Выделение, культивирование и характеристика первичных дермальных фибробластов из келоидной ткани человека

Резюме

В этом исследовании описывается оптимизированный протокол создания первичных фибробластов из келоидных тканей, которые могут эффективно и стабильно обеспечивать чистые и жизнеспособные фибробласты.

Аннотация

Фибробласты, основной тип клеток в келоидной ткани, играют важную роль в образовании и развитии келоидов. Выделение и культивирование первичных фибробластов, полученных из келоидной ткани, являются основой для дальнейших исследований биологической функции и молекулярных механизмов келоидов, а также новых терапевтических стратегий их лечения. Традиционный метод получения первичных фибробластов имеет ограничения, такие как плохое клеточное состояние, смешивание с другими типами клеток и восприимчивость к контаминации. В этой статье описывается оптимизированный и легко воспроизводимый протокол, который может уменьшить возникновение возможных проблем при получении фибробластов. В этом протоколе фибробласты можно наблюдать через 5 дней после выделения и достигать почти 80% слияния после 10 дней культивирования. Затем фибробласты пассируют и верифицируют с помощью антител к PDGFRα и виментину для иммунофлуоресцентного анализа и антител к CD90 для проточной цитометрии. В заключение, фибробласты из келоидной ткани могут быть легко получены с помощью этого протокола, что может обеспечить обильный и стабильный источник клеток в лаборатории для исследования келоидов.

Введение

Келоид, фибропролиферативное заболевание, проявляется в виде непрерывного роста бляшек, которые часто вторгаются в окружающую нормальную кожу без самоограничения и вызывают зуд, боль, а также косметические и психологические нагрузки для пациентов¹. Фибробласты, первичные клетки, участвующие в келоидах, играют важную роль в формировании и развитии этого заболевания из-за чрезмерной пролиферации, избыточной продукции внеклеточного матрикса и дезорганизованных коллагенов ^2,3. Тем не менее, основной патогенез остается неясным, и эффективный метод лечения келоида до сих пор отсутствует; Поэтому существует острая необходимость в дальнейших исследованиях ^4,5.

Поскольку не существует идеальной животной модели для исследования келоидов in vivo ^6,7, построение модели in vitro путем получения первичных фибробластов из келоидных тканей может обеспечить осуществимость и надежность исследования келоидов ^2,6. Первичными клетками являются клетки, полученные непосредственно из живой ткани, и общепризнано, что эти клетки могут более близко напоминать физиологическое состояние и генетический фон нескольких индивидуумов по сравнению с клеточными линиями ^8,9. Культивирование первичных клеток является мощным средством для изучения роста и метаболизма клеток, а также других клеточных фенотипов.

В настоящее время существует два метода получения первичных фибробластов: ферментное расщепление и эксплант-культура. Тем не менее, было выявлено несколько препятствий для получения первичных фибробластов, таких как риск заражения различными бактериями или грибами, смешивание с другими типами клеток, которые не так легко удаляются, длительный период цикла культивирования, последующие изменения характеристик клеток по сравнению с исходными клетками^{и так далее}.. Поэтому разработка осуществимого и эффективного процесса получения первичных фибробластов является основой для дальнейших исследований и применений. В этом исследовании описан оптимизированный протокол извлечения первичных фибробластов из келоидных тканей, который может эффективно и стабильно обеспечивать чистые и жизнеспособные фибробласты.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом Дерматологической больницы Южного медицинского университета (2020081). Информированное согласие пациента было получено до того, как у пациентов были взяты ткани.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры должны выполняться в стерильной среде под шкафом биологической безопасности.

1. Готовят полную питательную среду, добавляя 10% фетальную бычью сыворотку (FBS) и 1% раствор пенициллина-стрептомицина-амфотерицина B (ПСА) в модифицированную среду Eagle (DMEM) с высоким содержанием глюкозы Dulbecco.
2. Приготовьте фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) с PSA, добавив 1% PSA в 1x PBS. Подготовьте PBS с помощью FBS, добавив 1% FBS к 1x PBS.
3. Подготовьте несколько стерилизованных ножниц, щипцов и скальпелей в автоклаве.

2. Получение удаленных тканей

1. Получение тканей у пациентов с келоидными рубцами хирургическим путем. Соберите свежие келоидные ткани в стерильный упаковочный пакет или стерильную центрифужную пробирку и как можно скорее перенесите их в шкаф биологической безопасности в лаборатории.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе размер приобретенной келоидной ткани составлял примерно ~20 x 20 x 10^мм3, и размер может варьироваться в зависимости от операции.

3. Изоляция

1. Удалите келоидную ткань стерильным пинцетом и поместите ее в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 10-25 мл PBS с 1% ПСА на 10 минут. Затем подготовьте планшет на 6 лунок и добавьте в каждую лунку 4 мл PBS с добавлением 1% PSA. Выньте салфетку стерилизованным пинцетом и дважды промойте ее PBS с добавлением 1% PSA. С помощью стерильных щипцов последовательно переносят ткань из одной лунки в другую.
2. Удалите слои жира и эпидермиса с помощью хирургических ножниц или хирургического скальпеля, а слой дермы оставьте нетронутым. Обрезают и рассекают ножницами слой дермы на^{3-5 мм 2} штуки, переносят эти кусочки стерильными щипцами в следующую лунку и снова промывают в ПБС с 1% раствором ПСА.

4. Культура

1. Поместите кусочки ткани дермы в чашки Петри с помощью стерилизованных щипцов; Убедитесь, что количество деталей составляет от 10 до 30, а расстояние между ними составляет >5 мм. Поставьте чашки Петри вверх дном в инкубатор с 5%_СО2 при температуре 37 °C на 30-60 мин, пока кусочки тканей немного не подсохнут и не прилипнут к чашке Петри. Затем добавьте DMEM с добавлением 10% FBS и 1% PSA и осторожно поместите чашки Петри в инкубатор с 5%_CO2 при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты представляют собой морфологически и функционально гетерогенную клеточную популяцию. Учитывая эту сложность, этапы изоляции и культивирования должны выполняться с осторожностью; Равномерно выберите кусочки келоидной дермальной ткани и хорошо перемешайте эти кусочки, прежде чем поместить их в чашку Петри.
2. Через 3 дня замените половину надосадочной жидкости полной питательной средой. Меняйте питательную среду каждые 2-3 дня. Наблюдайте за фибробластами под микроскопом при 40-кратном увеличении каждый день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны выполняться аккуратно. Не перемещайте чашку Петри в течение 2 дней после изоляции, так как кусочкам ткани требуется время, чтобы прилипнуть к чашкам Петри.
3. Когда фибробласты, растущие вокруг кусочков ткани, достигнут примерно 90% слияния, удалите кусочки ткани и питательную среду. Промойте фибробласты стерильным 1x PBS и добавьте 2 мл стерильного 1x раствора трипсина-ЭДТА на пластины. Инкубируют клетки примерно ~3-5 мин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_СО2 . Осторожно постучите по чашке для закваски и понаблюдайте за ней под микроскопом. Когда большая часть клеток отделится от пластины, добавьте 2 мл полной среды, чтобы завершить процесс пищеварения.
4. Переложите клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте пробирку при 300 × г в течение 3 мин при комнатной температуре. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в полной среде. Высевают фибробласты в чашку для культивирования клеток диаметром 9 см и инкубируют при температуре 37 °C в инкубаторе с содержанием 5%_CO2 .

5. Обслуживание и консервация

1. Примерно через 3-4 дня, когда фибробласты вырастут до 80% слияния, повторите шаги 4.2-4.4 и проведите фибробласты в соотношении 1:3. Используйте пассированные фибробласты для дальнейших экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование фибробластов следует прекратить после 10 пассажей, потому что клетки могут начать проявлять измененные характеристики по сравнению с исходными клетками.
2. Криоконсервировать пассажированные клетки Р1-Р3 в жидком азоте для дальнейшего использования.
   1. Повторите шаги 4.2-4.3. Переложите клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте пробирку в течение 3 мин при 300 × г. Тщательно выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды для замораживания клеток, содержащей 90% FBS и 10% DMSO, и перенесите суспензию в клеточные криопробирки.
   2. Переместите клетки в морозильную камеру, а затем поместите замороженную коробку в морозильную камеру с температурой −80 °C. Через 1 сутки переведите клетки в жидкий азот для длительного сохранения.

6. Идентификация фибробластов методом иммунофлуоресцентного окрашивания

1. Поместите круглые покровные стекла в 24-луночный планшет и культивируйте пассированные фибробласты в концентрации 1 × 10⁴ клеток/лунку. Когда фибробласты достигнут 60% слияния, питательную среду удаляют. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать фибробласты в течение 20 минут при комнатной температуре, и промойте 3 раза PBS в течение 1 минуты каждый раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте количество клеток с помощью предметного стекла гемоцитометра под микроскопом или автоматического счетчика клеток.
2. Удалите PBS, инкубируйте с 0,5% Triton X-100 в течение 20 мин для пермеабилизации клеточных мембран, а затем промывают 3 раза PBS в течение 1 мин каждый раз. Добавьте PBS с 0,5% бычьим сывороточным альбумином и выдержите 30 минут. Затем удалите его и добавьте антитело PDGFR-α/vimentin, разведенное в разбавителе антител в соотношении 1:1000. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
3. На следующий день удалите первичное антитело, промойте клетки 3 раза PBS в течение 3 мин и добавьте вторичное антитело Alexa Fluor-555 козий антикроличий IgG, разбавленное разбавителем антител в соотношении 1:200, для замачивания в течение 1 ч.
4. Удалите вторичное антитело и промойте клетки 3 раза PBS. Вынимают круглые покровные стекла с помощью щипцов, надевают их на предметные стекла и добавляют 50 мкл раствора 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) 50 мкл 5 мкг/мл для окрашивания клеточных ядер. Храните образцы во влажной темной коробке и наблюдайте за ними под лазерным конфокальным флуоресцентным микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте отрицательную контрольную группу без первичного антитела, но с вторичным антителом, чтобы исключить неспецифическое окрашивание.

7. Идентификация фибробластов методом проточной цитометрии

1. Соберите клеточную гранулу в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и ресуспендируйте 50 мкл PBS, содержащего 1% FBS. Инкубируют с анти-CD90 в течение 30 мин в темноте и добавляют контроль изотипа анти-IgG в контрольную группу. Затем добавляют 200 мкл PBS, содержащего 1% FBS, и центрифугируют пробирку в течение 10 мин при 300 × g при 4 °C.
2. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 200 мкл PBS, содержащего 1% FBS. Ресуспендировать и отфильтровать суспензию через сетчатый фильтр (70 меш). Добавьте к фильтрату исходный раствор DAPI в концентрации 5 мкг/мл в соотношении 1:100, а затем получите результаты методом проточной цитометрии. Установите прямое рассеяние (FSC) в качестве абсциссы и боковое рассеяние (SSC) в качестве ординаты и обведите основную популяцию клеток. Выберите популяцию клеток и установите фикоэритрин в качестве абсциссы и количество в качестве ординаты для анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Временная шкала протокола представлена на рисунке 1A. Некоторые репрезентативные изображения процесса изоляции показаны на рисунке 2; эпидермис и жировые слои осторожно удаляли, а слой дермы разделяли на мелкие фрагменты по 3-4^мм2, которые засевали ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Получение первичных фибробластов из келоидных тканей является важнейшей основой для дальнейших исследований. До сих пор существовало два метода получения первичных фибробластов: ферментное расщепление и эксплант-культура^11,12,13,14

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8076
4% polyformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8081	Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluent	Beyotime Biotechnology	P0262
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 series A2	Isolation and culture cells
Bovine serum albumin	aladdin	B265993	Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubator	ESCO	CCL-170B-8	Using for culturing cells
Cell cryotubes	Corning	43513	Store the cells in low temperature
centrifugal machine	Thermo Fisher	ST 16R	Discard supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Stain the cellular nucleus
DMSO	MP Biomedicals	196055	Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	C11995500BT	Culture medium solution
Fetal bovine serum	BI	04-001-1A
Flow cytometer	BD	BD FACSCelesta	Observing the identity of cells
frozen box	Thermo Scientific	5100-0050
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laser confocal microscope	Nikon	AIR-HD25	Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibody	CST	3174T	First antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solution	Solarbio	P1410	Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dish	JETBIOFIL	7556	Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solution	Gibco	C10010500BT	Culture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Cell Signaling Technology	5742S	As a control for flow cytometry
Round coverslip	Biosharp	801007	Cell culture
Triton X 100	Solarbio	T8200	Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Used for passaging cells
Vimentin antibody	Abcam	ab8978	First antibody for immunofluorescence staining assay