İnsan Keloid Dokusundan Primer Dermal Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Özet

Bu çalışma, etkili ve istikrarlı bir şekilde saf ve canlı fibroblastlar sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastlar oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Özet

Keloid dokudaki ana hücre tipi olan fibroblastlar, keloidlerin oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynar. Keloid dokusundan türetilen primer fibroblastların izolasyonu ve kültürü, keloidlerin biyolojik fonksiyonu ve moleküler mekanizmalarının yanı sıra bunları tedavi etmek için yeni terapötik stratejiler hakkında daha ileri çalışmaların temelini oluşturur. Primer fibroblastları elde etmenin geleneksel yöntemi, zayıf hücresel durum, diğer hücre tipleriyle karışma ve kontaminasyona yatkınlık gibi sınırlamalara sahiptir. Bu makale, fibroblast elde edilirken olası sorunların ortaya çıkmasını azaltabilecek optimize edilmiş ve kolayca tekrarlanabilir bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokolde fibroblastlar izolasyondan 5 gün sonra gözlenebilmekte ve 10 günlük kültürden sonra %80'e yakın birleşmeye ulaşabilmektedir. Daha sonra fibroblastlar, immünofloresan testleri için PDGFRa ve vimentin antikorları ve akış sitometrisi için CD90 antikorları kullanılarak pasajlanır ve doğrulanır. Sonuç olarak, keloid dokusundan fibroblastlar, keloid araştırmaları için laboratuvarda bol ve stabil bir hücre kaynağı sağlayabilen bu protokol aracılığıyla kolayca elde edilebilir.

Giriş

Fibroproliferatif bir hastalık olan keloid, genellikle çevredeki normal cildi kendi kendini sınırlamadan istila eden ve hastalar için çeşitli derecelerde kaşıntı, ağrı ve kozmetik ve psikolojik yüklere neden olan plakların sürekli büyümesi olarak kendini gösterir¹. Keloidlerde yer alan birincil hücreler olan fibroblastlar, aşırı proliferasyon, gereksiz hücre dışı matriks üretimi ve düzensiz kollajenler yoluyla bu hastalığın oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynar ^2,3. Bununla birlikte, altta yatan patogenez belirsizliğini korumaktadır ve keloid için etkili bir terapötik yöntem hala eksiktir; Bu nedenle, daha fazla araştırmaya acil ihtiyaç vardır ^4,5.

İn vivo keloid araştırmaları için ideal bir hayvan modeli olmadığından, keloid dokulardan primer fibroblastlar elde ederek bir in vitro model ^{oluşturmak, keloid} araştırmaları için fizibilite ve güvenilirlik sağlayabilir ^2,6. Birincil hücreler, doğrudan canlı dokudan türetilen hücrelerdir ve genel olarak bu hücrelerin, hücre dizilerine kıyasla birden fazla bireyin fizyolojik durumuna ve genetik arka planına daha yakından benzeyebileceği kabul edilmektedir ^8,9. Birincil hücrelerin kültürlenmesi, hücrelerin büyümesini ve metabolizmasını ve diğer hücre fenotiplerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Şu anda, primer fibroblastları elde etmek için iki yöntem vardır: enzim sindirimi ve eksplant kültürü. Bununla birlikte, primer fibroblastların elde edilmesinde, çeşitli bakteri veya mantarlar tarafından kontaminasyon riski, kolayca çıkarılamayan diğer hücre türleri ile karışma, kültür döngüsünün uzun süresi, orijinal hücrelere kıyasla hücre özelliklerinde müteakip değişiklikler vb^{. gibi} çeşitli engeller tanımlanmıştır 9. Bu nedenle, primer fibroblastların elde edilmesi için uygulanabilir ve etkili bir süreç geliştirmek, daha ileri çalışmalar ve uygulamalar için temel oluşturur. Bu çalışma, saf ve canlı fibroblastları etkili ve istikrarlı bir şekilde sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastların çıkarılması için optimize edilmiş bir protokolü tanımlamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma, Güney Tıp Üniversitesi (2020081) Dermatoloji Hastanesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Bireylerden doku toplanmadan önce bilgilendirilmiş hasta onamları alındı.

1. Hazırlık

NOT: Aşağıdaki prosedürler biyolojik güvenlik kabini altında steril bir ortamda yapılmalıdır.

1. Yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerine (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin-amfoterisin B çözeltisi (PSA) ekleyerek tam kültür ortamı hazırlayın.
2. 1x PBS'ye% 1 PSA ekleyerek PSA ile fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) hazırlayın. 1x PBS'ye %1 FBS ekleyerek PBS'yi FBS ile hazırlayın.
3. Otoklavlama ile birkaç sterilize makas, forseps ve neşter hazırlayın.

2. Çıkarılan dokuların elde edilmesi

1. Keloid hastalarından ameliyat yoluyla doku elde edin. Taze keloid dokularını steril bir ambalaj torbasında veya steril santrifüj tüpünde toplayın ve mümkün olan en kısa sürede laboratuvardaki biyolojik güvenlik kabinine aktarın.
   NOT: Bu protokolde elde edilen keloid dokusunun boyutu yaklaşık ~20 x 20 x 10^mm3 olup, boyut ameliyata bağlı olarak değişebilir.

3. İzolasyon

1. Steril cımbız kullanarak keloid dokusunu çıkarın ve 10 dakika boyunca% 1 PSA ile 10-25 mL PBS içeren 50 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra 6 oyuklu bir plaka hazırlayın ve her oyuğa %1 PSA ile takviye edilmiş 4 mL PBS ekleyin. Sterilize edilmiş cımbız kullanarak dokuyu çıkarın ve% 1 PSA ile desteklenmiş PBS ile iki kez yıkayın. Steril forseps kullanarak, dokuyu sırayla bir kuyudan diğerine aktarın.
2. Cerrahi makas veya cerrahi neşter kullanarak yağ ve epidermis tabakalarını çıkarın ve dermis tabakasına dokunmayın. Dermis tabakasını makasla 3-5 mm² parçaya kesin ve disekesin, bu parçaları steril forseps kullanarak bir sonraki kuyucuğa aktarın ve tekrar% 1 PSA solüsyonu ile PBS'de yıkayın.

4. Kültür

1. Dermis dokusu parçalarını sterilize edilmiş forseps kullanarak Petri kaplarına yerleştirin; Parça sayısının 10 ile 30 arasında olmasına ve her parça arasındaki mesafenin >5 mm olmasına dikkat edin. Petri kaplarını 37 °C'de %5'lik bir_CO2 inkübatörde 30-60 dakika boyunca doku parçaları biraz kuruyana kadar baş aşağı koyun ve Petri kabına yapışın. Ardından, %10 FBS ve %1 PSA ile takviye edilmiş DMEM ekleyin ve Petri kaplarını 37 °C'de %5_CO2 inkübatöre dikkatlice yerleştirin.
   NOT: Fibroblastlar morfolojik ve fonksiyonel olarak heterojen bir hücre popülasyonudur. Bu karmaşıklık göz önüne alındığında, izolasyon ve kültür adımları dikkatle gerçekleştirilmelidir; keloid dermal doku parçalarını eşit şekilde seçin ve bu parçaları Petri kabına yerleştirmeden önce iyice karıştırın.
2. 3 gün sonra, süpernatantın yarısını tam bir kültür ortamı ile değiştirin. Kültür ortamını 2-3 günde bir değiştirin. Fibroblastları her gün 40x büyütmede mikroskop altında gözlemleyin.
   NOT: Tüm adımlar nazikçe gerçekleştirilmelidir. Doku parçalarının Petri kaplarına yapışması zaman aldığından, PERI kabını izole ettikten sonra 2 gün boyunca hareket ettirmeyin.
3. Doku parçalarının etrafında büyüyen fibroblastlar yaklaşık% 90 birleşmeye ulaştığında, doku parçalarını ve kültür ortamını çıkarın. Fibroblastları steril 1x PBS ile yıkayın ve plakalara 2 mL steril 1x tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de yaklaşık ~ 3-5 dakika inkübe edin. Kültür kabına hafifçe vurun ve mikroskop altında gözlemleyin. Hücrelerin çoğu plakadan ayrıldığında, sindirim işlemini sonlandırmak için 2 mL tam ortam ekleyin.
4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücre peletini tam ortamda yeniden süspanse edin. Fibroblastları 9 cm'lik bir hücre kültürü kabına tohumlayın ve nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.

5. Bakım ve koruma

1. Yaklaşık 3-4 gün sonra, fibroblastlar% 80 birleşme noktasına ulaştığında, 4.2-4.4 adımlarını tekrarlayın ve fibroblastları 1: 3 oranında geçirin. Daha ileri deneyler için pasajlı fibroblastları kullanın.
   NOT: Fibroblast kültürü 10 geçişten sonra durdurulmalıdır, çünkü hücreler orijinal hücrelere göre değişen özellikler göstermeye başlayabilir.
2. Daha fazla kullanım için sıvı nitrojen içinde P1-P3'ün geçiş hücrelerini kriyoprezervasyon.
   1. 4.2-4.3 arasındaki adımları tekrarlayın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 300 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın, hücre peletini %90 FBS ve %10 DMSO içeren 1 mL hücre dondurma ortamında yeniden süspanse edin ve süspansiyonu hücre kriyotüplerine aktarın.
   2. Hücreleri donmuş bir kutuya taşıyın ve ardından donmuş kutuyu −80 °C'lik bir dondurucuya koyun. 1 gün sonra, uzun süreli koruma için hücreleri sıvı nitrojene aktarın.

6. İmmünofloresan boyama ile fibroblastların tanımlanması

1. Yuvarlak lamelleri 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve pasajlı fibroblastları 1 × 10⁴ hücre / kuyu konsantrasyonunda kültürleyin. Fibroblastlar% 60 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını çıkarın. Fibroblastları oda sıcaklığında 20 dakika sabitlemek için 1 mL% 4 paraformaldehit ekleyin ve her seferinde 1 dakika boyunca 3x PBS ile yıkayın.
   NOT: Mikroskop altında bir hemositometre lamı veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın.
2. PBS'yi çıkarın, hücre zarlarının geçirgenliği için% 0.5 Triton X-100 ile 20 dakika inkübe edin ve ardından her seferinde 1 dakika boyunca PBS ile 3x yıkayın. % 0.5 sığır serum albümini ile PBS ekleyin ve 30 dakika bekletin. Daha sonra çıkarın ve 1: 1.000'de antikor seyreltici içinde seyreltilmiş PDGFR-α/vimentin antikorunu ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
3. Ertesi gün, birincil antikoru çıkarın, hücreleri 3x PBS ile 3 dakika yıkayın ve 1: 200'de antikor seyreltici ile seyreltilmiş ikincil antikor Alexa Fluor-555 keçi anti-tavşan IgG'yi 1 saat bekletin.
4. İkincil antikoru çıkarın ve hücreleri 3x PBS ile yıkayın. Forseps kullanarak yuvarlak lamelleri çıkarın, cam slaytlara koyun ve hücre çekirdeklerini boyamak için 50 μL 5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi ekleyin. Numuneleri ıslak, karanlık bir kutuda saklayın ve lazer konfokal floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
   NOT: Spesifik olmayan boyamayı dışlamak için birincil antikoru olmayan ancak ikincil antikoru olan negatif bir kontrol grubu ekleyin.

7. Fibroblastların akım sitometrisi ile tanımlanması

1. Hücre peletini 1.5 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne toplayın ve% 1 FBS içeren 50 μL PBS ile yeniden süspanse edin. Karanlıkta 30 dakika boyunca anti-CD90 ile inkübe edin ve kontrol grubuna bir anti-IgG izotip kontrolü ekleyin. Daha sonra,% 1 FBS içeren 200 μL PBS ekleyin ve tüpü 4 ° C'de 300 × g'de 10 dakika santrifüjleyin.
2. Süpernatanı çıkarın ve% 1 FBS içeren 200 μL PBS ekleyin. Süspansiyonu bir hücre süzgecinden (70 göz) yeniden askıya alın ve filtreleyin. Filtrata 1:100'de 5 μg/mL'lik bir DAPI stok çözeltisi ekleyin ve ardından sonuçları akış sitometrisi ile elde edin. İleri saçılımı (FSC) apsis ve yan saçılımı (SSC) ordinat olarak ayarlayın ve ana hücre popülasyonunu daire içine alın. Hücre popülasyonunu seçin ve fikoeritrini apsis olarak ve sayıyı analiz için ordinat olarak ayarlayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protokolün zaman çizelgesi Şekil 1A'da özetlenmiştir. İzolasyon sürecinin bazı temsili görüntüleri Şekil 2'de gösterilmektedir; epidermis ve yağ tabakaları dikkatlice çıkarıldı ve dermis tabakası 3-4^mm2'lik küçük parçalara ayrıldı ve bunlar Petri kaplarına aşılandı.

Şekil 3A'da gösterildiği gibi, işlemden 5 gün sonra mikroskop altında doku parçalarında ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Keloid dokulardan primer fibroblastların elde edilmesi, daha ileri araştırmalar için kritik bir temeldir. Şimdiye kadar, primer fibroblastları elde etmek için iki yöntem vardı: enzim sindirimi ve eksplant kültürü^11,12,13,14. Bununla birlikte, her iki geleneksel yöntemin de kontaminasyona yatkınlık, diğer hücre tipleriyle karışma, uzun bir kültür süresi ve düşük başarı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8076
4% polyformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8081	Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluent	Beyotime Biotechnology	P0262
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 series A2	Isolation and culture cells
Bovine serum albumin	aladdin	B265993	Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubator	ESCO	CCL-170B-8	Using for culturing cells
Cell cryotubes	Corning	43513	Store the cells in low temperature
centrifugal machine	Thermo Fisher	ST 16R	Discard supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Stain the cellular nucleus
DMSO	MP Biomedicals	196055	Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	C11995500BT	Culture medium solution
Fetal bovine serum	BI	04-001-1A
Flow cytometer	BD	BD FACSCelesta	Observing the identity of cells
frozen box	Thermo Scientific	5100-0050
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laser confocal microscope	Nikon	AIR-HD25	Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibody	CST	3174T	First antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solution	Solarbio	P1410	Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dish	JETBIOFIL	7556	Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solution	Gibco	C10010500BT	Culture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Cell Signaling Technology	5742S	As a control for flow cytometry
Round coverslip	Biosharp	801007	Cell culture
Triton X 100	Solarbio	T8200	Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Used for passaging cells
Vimentin antibody	Abcam	ab8978	First antibody for immunofluorescence staining assay