Isolamento, coltura e caratterizzazione di fibroblasti dermici primari da tessuto cheloide umano

Riepilogo

Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per stabilire fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.

Abstract

I fibroblasti, il principale tipo di cellula nel tessuto cheloide, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo dei cheloidi. L'isolamento e la coltura di fibroblasti primari derivati dal tessuto cheloide sono la base per ulteriori studi sulla funzione biologica e sui meccanismi molecolari dei cheloidi, nonché nuove strategie terapeutiche per il loro trattamento. Il metodo tradizionale per ottenere fibroblasti primari ha dei limiti, come il cattivo stato cellulare, la miscelazione con altri tipi di cellule e la suscettibilità alla contaminazione. Questo documento descrive un protocollo ottimizzato e facilmente riproducibile che potrebbe ridurre l'insorgenza di possibili problemi quando si ottengono fibroblasti. In questo protocollo, i fibroblasti possono essere osservati 5 giorni dopo l'isolamento e raggiungere quasi l'80% di confluenza dopo 10 giorni di coltura. Quindi, i fibroblasti vengono fatti passare e verificati utilizzando anticorpi PDGFRα e vimentina per saggi di immunofluorescenza e anticorpi CD90 per citometria a flusso. In conclusione, i fibroblasti dal tessuto cheloide possono essere facilmente acquisiti attraverso questo protocollo, che può fornire una fonte abbondante e stabile di cellule in laboratorio per la ricerca sui cheloidi.

Introduzione

Il cheloide, una malattia fibroproliferativa, si manifesta come la crescita continua di placche che spesso invadono la pelle normale circostante senza autolimitazione e causano vari gradi di prurito, dolore e oneri estetici e psicologici per i pazienti¹. I fibroblasti, le cellule primarie coinvolte nei cheloidi, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo di questa malattia attraverso un'eccessiva proliferazione, la produzione ridondante di matrice extracellulare e collageni disorganizzati ^2,3. Tuttavia, la patogenesi sottostante rimane poco chiara e manca ancora un metodo terapeutico efficace per il cheloide; Pertanto, vi è un urgente bisogno di ulteriori ricerche ^4,5.

Poiché non esiste un modello animale ideale per la ricerca sui cheloidi in vivo ^6,7, la costruzione di un modello in vitro mediante l'acquisizione di fibroblasti primari da tessuti cheloidi può offrire fattibilità e affidabilità per la ricerca cheloide ^2,6. Le cellule primarie sono quelle derivate direttamente da tessuti viventi ed è generalmente riconosciuto che queste cellule possono assomigliare più da vicino allo stato fisiologico e al background genetico di più individui rispetto alle linee cellulari ^8,9. La coltura delle cellule primarie fornisce un potente mezzo per studiare la crescita e il metabolismo delle cellule, così come altri fenotipi cellulari.

Allo stato attuale, ci sono due metodi per acquisire fibroblasti primari: digestione enzimatica e coltura di espianto. Tuttavia, sono stati identificati diversi ostacoli all'ottenimento di fibroblasti primari, come il rischio di contaminazione da parte di vari batteri o funghi, la miscelazione con altri tipi di cellule che non sono facilmente rimosse, il lungo periodo del ciclo di coltura, le successive modifiche alle caratteristiche cellulari rispetto alle cellule originali e così via⁹. Pertanto, lo sviluppo di un processo fattibile ed efficace per ottenere fibroblasti primari è la base per ulteriori studi e applicazioni. Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per l'estrazione di fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.

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Protocollo

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del Dermatology Hospital, Southern Medical University (2020081). Il consenso informato del paziente è stato ottenuto prima che i tessuti fossero raccolti dagli individui.

1. Preparazione

NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in ambiente sterile sotto un armadio di sicurezza biologica.

1. Preparare un terreno di coltura completo aggiungendo il 10% di siero bovino fetale (FBS) e la soluzione di penicillina-streptomicina-amfotericina B (PSA) all'alto contenuto di glucosio del terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM).
2. Preparare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con PSA aggiungendo l'1% di PSA in 1x PBS. Prepara PBS con FBS aggiungendo l'1% di FBS a 1x PBS.
3. Preparare diverse forbici sterilizzate, pinze e bisturi in autoclave.

2. Ottenere i tessuti rimossi

1. Ottenere tessuti da pazienti cheloidi attraverso la chirurgia. Raccogliere i tessuti cheloidi freschi in un sacchetto di imballaggio sterile o in una provetta da centrifuga sterile e trasferirli in un armadio di sicurezza biologica in laboratorio il prima possibile.
   NOTA: In questo protocollo, la dimensione del tessuto cheloide acquisito era di circa ~ 20 x 20 x 10 mm³ e la dimensione può variare a seconda dell'intervento chirurgico.

3. Isolamento

1. Estrarre il tessuto cheloide con una pinzetta sterile e metterlo in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml contenente 10-25 ml di PBS con PSA all'1% per 10 minuti. Quindi, preparare una piastra a 6 pozzetti e aggiungere 4 ml di PBS integrato con PSA all'1% a ciascun pozzetto. Estrarre il tessuto con una pinzetta sterilizzata e lavarlo due volte con PBS integrato con PSA all'1%. Utilizzando una pinza sterile, trasferire il tessuto in sequenza da un pozzetto all'altro.
2. Rimuovere gli strati adiposi dell'epidermide usando forbici chirurgiche o un bisturi chirurgico e lasciare intatto lo strato del derma. Tagliare e sezionare lo strato del derma in 3-5 mm² pezzi con le forbici, trasferire questi pezzi con una pinza sterile al pozzetto successivo e lavarli nuovamente in PBS con una soluzione di PSA all'1%.

4. Cultura

1. Posizionare i pezzi di tessuto del derma in piastre di Petri usando una pinza sterilizzata; Assicurarsi che il numero di pezzi sia compreso tra 10 e 30 e che la distanza tra ogni pezzo sia >5 mm. Mettere le piastre di Petri capovolte in un'incubatrice al 5% di CO₂ a 37 °C per 30-60 minuti fino a quando i pezzi di tessuto si asciugano un po 'e si attaccano alla capsula di Petri. Quindi, aggiungere DMEM integrato con FBS al 10% e PSA all'1% e posizionare con cura le piastre di Petri in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 ° C.
   NOTA: I fibroblasti sono una popolazione cellulare morfologicamente e funzionalmente eterogenea. Considerando questa complessità, le fasi di isolamento e cultura dovrebbero essere eseguite con cura; selezionare uniformemente i pezzi di tessuto dermico cheloide e mescolare bene questi pezzi prima di metterli nella capsula di Petri.
2. Dopo 3 giorni, sostituire metà del surnatante con un terreno di coltura completo. Cambia il terreno di coltura ogni 2-3 giorni. Osservare i fibroblasti al microscopio con un ingrandimento 40x ogni giorno.
   NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti delicatamente. Non spostare la capsula di Petri per 2 giorni dopo l'isolamento, poiché i pezzi di tessuto richiedono tempo per aderire alle piastre di Petri.
3. Quando i fibroblasti che crescono intorno ai pezzi di tessuto raggiungono circa il 90% di confluenza, rimuovere i pezzi di tessuto e il terreno di coltura. Lavare i fibroblasti con 1x PBS sterile e aggiungere 2 ml di soluzione sterile 1x tripsina-EDTA alle piastre. Incubare le cellule per circa ~3-5 minuti a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ . Picchiettare delicatamente il piatto di coltura e osservarlo al microscopio. Quando la maggior parte delle cellule si stacca dalla piastra, aggiungere 2 ml di mezzo completo per terminare il processo di digestione.
4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 mL e centrifugare la provetta a 300 × g per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare attentamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo completo. Seminare i fibroblasti in un piatto di coltura cellulare di 9 cm e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ .

5. Manutenzione e conservazione

1. Circa 3-4 giorni dopo, quando i fibroblasti sono cresciuti fino all'80% di confluenza, ripetere i passaggi 4,2-4,4 e far passare i fibroblasti con un rapporto di 1:3. Utilizzare i fibroblasti di passaggio per ulteriori esperimenti.
   NOTA: La coltura di fibroblasti deve essere interrotta dopo 10 passaggi, perché le cellule possono iniziare a mostrare caratteristiche modificate rispetto alle cellule originali.
2. Crioconservare le cellule passate di P1-P3 in azoto liquido per un ulteriore utilizzo.
   1. Ripetere i passaggi 4.2-4.3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da centrifuga da 15 mL e centrifugare la provetta per 3 minuti a 300 × g. Scartare il surnatante con attenzione, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di congelamento cellulare contenente il 90% di FBS e il 10% di DMSO e trasferire la sospensione nei criotubi cellulari.
   2. Spostare le celle in una scatola congelata, quindi mettere la scatola congelata in un congelatore a -80 °C. Dopo 1 giorno, trasferire le cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

6. Identificazione dei fibroblasti mediante colorazione con immunofluorescenza

1. Posizionare i vetrini rotondi in una piastra a 24 pozzetti e coltivare i fibroblasti passaggi ad una concentrazione di 1 × 10⁴ cellule / pozzetto. Quando i fibroblasti raggiungono il 60% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% per fissare i fibroblasti per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare 3 volte con PBS per 1 minuto ogni volta.
   NOTA: Contare il numero di cellule utilizzando un vetrino emocitometrico al microscopio o un contatore automatico delle cellule.
2. Rimuovere il PBS, incubare con Triton X-100 allo 0,5% per 20 minuti per la permeabilizzazione delle membrane cellulari, quindi lavare 3 volte con PBS per 1 minuto ogni volta. Aggiungere PBS con albumina sierica bovina allo 0,5% e immergere per 30 minuti. Quindi, rimuoverlo e aggiungere l'anticorpo PDGFR-α/vimentina diluito nel diluente anticorpale a 1:1.000. Incubare per una notte a 4 °C.
3. Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario, lavare le cellule 3 volte con PBS per 3 minuti e aggiungere l'anticorpo secondario Alexa Fluor-555 capra anti-coniglio IgG diluito con diluente anticorpale a 1:200 per immergere per 1 ora.
4. Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare le cellule 3 volte con PBS. Estrarre i vetrini rotondi con una pinza, metterli su vetrini e aggiungere 50 μL di soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) da 5 μg/mL per colorare i nuclei cellulari. Conservare i campioni in una scatola umida e buia e osservarli al microscopio a fluorescenza confocale laser.
   NOTA: Aggiungere un gruppo di controllo negativo senza un anticorpo primario ma con un anticorpo secondario per escludere la colorazione non specifica.

7. Identificazione di fibroblasti mediante citometria a flusso

1. Raccogliere il pellet cellulare in una provetta sterile da centrifuga da 1,5 ml e risospendere con 50 μL di PBS contenente FBS all'1%. Incubare con anti-CD90 per 30 minuti al buio e aggiungere un controllo isotipo anti-IgG al gruppo di controllo. Quindi, aggiungere 200 μL di PBS contenente l'1% di FBS e centrifugare la provetta per 10 minuti a 300 × g a 4 °C.
2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 μL di PBS contenente l'1% di FBS. Risospendere e filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare (70 mesh). Aggiungere una soluzione madre da 5 μg/mL di DAPI a 1:100 al filtrato, quindi acquisire i risultati mediante citometria a flusso. Impostare lo scatter in avanti (FSC) come ascissa e lo scatter laterale (SSC) come ordinata e cerchiare la popolazione cellulare principale. Selezionare la popolazione cellulare e impostare la ficoeritrina come ascissa e il conteggio come ordinata per l'analisi.

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Risultati

La sequenza temporale del protocollo è riassunta nella Figura 1A. Alcune immagini rappresentative del processo di isolamento sono mostrate nella Figura 2; l'epidermide e gli strati adiposi sono stati accuratamente rimossi e lo strato del derma è stato separato in piccoli frammenti di 3-4 mm², che sono stati inoculati nelle piastre di Petri.

Come mostrato nella Figura 3A, diverse escrescen...

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Discussione

Ottenere fibroblasti primari dai tessuti cheloidi è una base fondamentale per ulteriori ricerche. Fino ad ora, ci sono stati due metodi per acquisire fibroblasti primari: digestione enzimatica e coltura di espianti^11,12,13,14. Tuttavia, entrambi i metodi tradizionali hanno limiti, come la suscettibilità alla contaminazione, la miscelazione con altri tipi di cellule, un lungo periodo di coltur...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	CFT002015
15 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8076
4% polyformaldehyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Cell fixation
50 mL sterile centrifuge tube	JETBIOFIL	8081	Put keloid tissue
Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG	Abcam	Alexa Fluor 555	second antibody for immunofluorescence staining assay
Anti human CD90	BioLegend	B301002	Identify the purity of fibroblasts
Antibody diluent	Beyotime Biotechnology	P0262
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 series A2	Isolation and culture cells
Bovine serum albumin	aladdin	B265993	Blocking for immunofluorescence staining assay
Carbon dioxide incubator	ESCO	CCL-170B-8	Using for culturing cells
Cell cryotubes	Corning	43513	Store the cells in low temperature
centrifugal machine	Thermo Fisher	ST 16R	Discard supernatant
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Stain the cellular nucleus
DMSO	MP Biomedicals	196055	Using for preserving cells
Dulbecco's modified eagle medium	Gibco	C11995500BT	Culture medium solution
Fetal bovine serum	BI	04-001-1A
Flow cytometer	BD	BD FACSCelesta	Observing the identity of cells
frozen box	Thermo Scientific	5100-0050
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
Laser confocal microscope	Nikon	AIR-HD25	Observing the immunofluorescence staining assay
PDGFR-α antibody	CST	3174T	First antibody for immunofluorescence staining assay
Penicillin-streptomycin-Am solution	Solarbio	P1410	Add in culture medium solution to avoid contamination
petri dish	JETBIOFIL	7556	Culture fibroblasts
Phosphate buffered saline solution	Gibco	C10010500BT	Culture medium solution
Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)	Cell Signaling Technology	5742S	As a control for flow cytometry
Round coverslip	Biosharp	801007	Cell culture
Triton X 100	Solarbio	T8200	Punch holes in the cell membrane
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Used for passaging cells
Vimentin antibody	Abcam	ab8978	First antibody for immunofluorescence staining assay