JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا العمل بروتوكولا للطباعة الحرة المضمنة 3D للخلايا الجذعية العصبية داخل مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء. يتيح البروتوكول الزخرفة القابلة للبرمجة لتركيبات الأنسجة العصبية البشرية المترابطة بدقة عالية.

Abstract

ظهرت الطباعة 3D المضمنة للخلايا داخل وسيط دعم حبيبي في العقد الماضي كنهج قوي للتصنيع الحيوي الحر لتركيبات الأنسجة الرخوة. ومع ذلك ، فقد اقتصرت تركيبات الجل الحبيبية على عدد محدود من المواد الحيوية التي تسمح بتوليد كميات كبيرة من جزيئات الهيدروجيل الدقيقة بشكل فعال من حيث التكلفة. لذلك ، تفتقر وسائط دعم الهلام الحبيبي بشكل عام إلى الوظائف اللاصقة للخلايا والوظائف الإرشادية للخلايا الموجودة في المصفوفة الأصلية خارج الخلية (ECM).

لمعالجة هذا ، تم تطوير منهجية لتوليد مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء (SHAPE). تتكون مركبات SHAPE من طور حبيبي (هلاميات دقيقة) وطور مستمر (محلول ECM لزج) يسمحان معا بطباعة عالية الدقة قابلة للبرمجة وبيئة خارج الخلية وظيفية حيوية قابلة للتعديل. يصف هذا العمل كيف يمكن استخدام المنهجية المطورة للتصنيع الحيوي الدقيق للبنى العصبية البشرية.

أولا ، يتم تصنيع الجسيمات الدقيقة للجينات ، والتي تعمل كمكون حبيبي في مركبات SHAPE ، ودمجها مع مكون مستمر قائم على الكولاجين. بعد ذلك ، تتم طباعة الخلايا الجذعية العصبية البشرية داخل مادة الدعم ، متبوعة بتلدين الدعم. يمكن الحفاظ على التركيبات المطبوعة لأسابيع للسماح بتمايز الخلايا المطبوعة إلى خلايا عصبية. في الوقت نفسه ، تسمح المرحلة المستمرة للكولاجين بنمو المحور العصبي والترابط بين المناطق. أخيرا ، يوفر هذا العمل معلومات حول كيفية إجراء التصوير الفلوري للخلايا الحية والكيمياء المناعية لتوصيف التركيبات العصبية البشرية المطبوعة 3D.

Introduction

تمثل الطباعة 3D الدقيقة والقابلة للبرمجة لتركيبات الهيدروجيل المحملة بالخلايا التي تحاكي الأنسجة الرخوة في المختبر تحديا كبيرا. على سبيل المثال ، تعد المحاولات القائمة على البثق المباشر للهلاميات المائية اللينة مشكلة بطبيعتها ، حيث أن الخصائص الميكانيكية الضعيفة المطلوبة لتلخيص البيئة الدقيقة في الجسم الحي تؤدي إلى نقص السلامة الهيكلية ، أو تشوهات الميزات المحددة مسبقا ، أو الانهيار الكامل للهياكل المصنعة. يتمثل الحل التقليدي لهذه المشكلة في طباعة سقالة داعمة من مادة متوافقة حيويا أكثر صلابة تسمح للبنية النهائية بالحفاظ على شكلها. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يحد بشكل كبير من إمكانيات التصميم ويتطلب ضبطا ريولوجيا دقيقا للأحبار المجاورة.

للتغلب على قيود الطباعة ثلاثية الأبعاد التقليدية القائمة على البثق طبقة تلو الأخرى ، ظهرت الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة في السنوات الأخيرة كبديل قوي للمواد اللينة وتصنيع الأنسجة1،2،3،4،5،6. بدلا من بثق الحبر في الهواء المحيط أعلى السطح ، يتم ترسيب الحبر مباشرة من خلال إبرة حقنة داخل حمام دعم يشبه الصلابة أثناء الراحة ولكنه يميع بشكل عكسي حول طرف الإبرة المتحرك للسماح بالترسب الدقيق للمواد المحملة بالخلايا الناعمة. يتم الاحتفاظ بالمادة المترسبة في مكانها حيث يتماسك الدعم في أعقاب الإبرة. على هذا النحو ، تسمح الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة بتصنيع الأشكال الحرة عالية الدقة للهياكل المعقدة من المواد الحيوية اللينة مع إمكانيات تصميم موسعة 7,8.

تم استكشاف المواد الهلامية الحبيبية على نطاق واسع كمواد حمام داعمة للطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ، حيث يمكن صياغتها لإظهار انتقالات سلسة وموضعية وقابلة للانعكاس من الصلب إلى السائل عند ضغوط منخفضة العائد9،10،11. في حين أنها تظهر خصائص ريولوجية ممتازة للطباعة عالية الدقة ، فقد اقتصرت المواد الهلامية الحبيبية على حفنة من المواد الحيوية12. إن الافتقار إلى التنوع في تركيبات الجل الحبيبي ، والذي يتضح بشكل خاص إذا أخذنا في الاعتبار المجموعة الواسعة من المواد الحيوية المتاحة لتركيبات الهيدروجيل السائبة ، ناتج عن الحاجة إلى توليد فعال من حيث التكلفة لعدد كبير من الهلاميات الدقيقة باستخدام مواد كيميائية بسيطة. نظرا لمحدودية مشهد المواد الحيوية لدعامات الهلام الحبيبي ، فإن ضبط البيئة المكروية خارج الخلية التي يوفرها دعم الطباعة يمثل تحديا في هذا المجال.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج معياري لتوليد دعامات الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ، والتي يطلق عليها مركبات مصفوفة الجسيمات خارج الخلية القابلة للصلب ذاتية الشفاء (SHAPE)13. يجمع هذا النهج بين الخصائص الريولوجية المميزة للمواد الهلامية الحبيبية مع التنوع الوظيفي الحيوي لتركيبات الهيدروجيل السائبة. يتكون دعم مركب SHAPE المقدم من جسيمات الجينات الدقيقة المعبأة (المرحلة الحبيبية ، ~ 70٪ جزء حجمي) مع مساحة خلالية متزايدة مملوءة بمحلول pregel ECM اللزج القائم على الكولاجين (المرحلة المستمرة ، ~ 30٪ جزء الحجم). وقد تبين كذلك أن دعم SHAPE يسهل ترسب الخلايا الجذعية العصبية البشرية (hNSCs) عالية الدقة والتي ، بعد تلدين حمام الدعم ، يمكن تمييزها إلى خلايا عصبية والحفاظ عليها لأسابيع للوصول إلى النضج الوظيفي. تتغلب الطباعة 3D المضمنة داخل حمام دعم SHAPE على بعض القيود الرئيسية المتعلقة بالتقنيات التقليدية للتصنيع الحيوي للأنسجة العصبية مع توفير منصة متعددة الاستخدامات.

يفصل هذا العمل خطوات الطباعة ثلاثية الأبعاد المضمنة ل hNSCs داخل دعم SHAPE وتمايزها اللاحق إلى خلايا عصبية وظيفية (الشكل 1). أولا ، يتم إنشاء الجسيمات الدقيقة للجينات عن طريق القص أثناء الهلام الداخلي. يسمح هذا النهج بتوليد كميات كبيرة من الجسيمات الدقيقة بسهولة دون الحاجة إلى معدات متخصصة وكواشف سامة للخلايا. علاوة على ذلك ، فإن الجينات هي مصدر مواد اقتصادي ومتاح على نطاق واسع لتشكيل ركائز هيدروجيل متوافقة حيويا لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. يتم دمج الجسيمات الدقيقة للجينات المتولدة مع محلول الكولاجين لتشكيل مادة دعم مركبة SHAPE. بعد ذلك ، يتم حصاد hNSCs وتحميلها في حقنة كحبر حيوي خلوي للطباعة 3D. يتم استخدام طابعة حيوية 3D للطباعة المضمنة القائمة على البثق ل hNSCs داخل مركب SHAPE. يتم تمييز الخلايا المطبوعة 3D إلى خلايا عصبية لتؤدي إلى بنى عصبية بشرية محددة مكانيا ووظيفية. أخيرا ، يصف البروتوكول كيف يمكن وصف تركيبات الأنسجة المتولدة باستخدام تصوير الخلايا الحية والكيمياء المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير نصائح للتحسين واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. والجدير بالذكر أنه يمكن تبادل كل من مكونات المرحلتين الحبيبية والمستمرة مع تركيبات هيدروجيل أخرى لاستيعاب مختلف الأجزاء الوظيفية الحيوية ، والخواص الميكانيكية ، وآليات التشابك ، كما هو مطلوب من قبل أنواع الخلايا والأنسجة الأخرى خارج التطبيقات العصبية.

Protocol

1. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف

  1. تحضير وسط نمو الخلايا عن طريق إضافة المكملات التالية إلى DMEM / F12 مع ثنائي ببتيد L-alanyl-L-glutamine: 30 mM الجلوكوز ، 5 μM HEPES ، 0.5٪ w / v ألبومين مصل الأبقار الغني بالدهون ، 40 ميكرومتر L- ألانين ، 40 ميكرومتر L- أسباراجين أحادي الهيدرات ، 40 ميكرومتر L- حمض الأسبارتيك ، 40 ميكرومتر L- حمض الجلوتاميك ، 40 ميكرومتر L- البرولين ، 1٪ N2 الملحق ، 1٪ البنسلين الستربتومايسين ، و 20 نانوغرام / لتر لكل من عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF). نفذ هذه الخطوات على مقعد تدفق الهواء الرقائقي (LAF).
  2. قم بإعداد محلول ألجينات 1٪ وزن / وزن في ماء عالي النقاء عن طريق التقليب بقوة لمدة 4 ساعات عند 60 درجة مئوية. قم بتصفية محلول الجينات الساخن المذاب المعقم باستخدام مرشح بحجم المسام 0.45 ميكرومتر في مقعد LAF. احفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: إذا كانت درجة حرارة محلول الجينات أقل من 60 درجة مئوية ، فلن يكون من الممكن تمريره عبر الفلتر.
  3. قم بإعداد محلول NaHCO37 جم / لتر في ماء عالي النقاء. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 9.5 باستخدام NaOH ، وقم بتعقيمه بالفلتر في مقعد LAF. يخزن المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. شكل إعداد المواد المركبة

  1. توليد الجسيمات الدقيقة الجينات
    1. تحضير محلول CaCO3 سعة 2 ملغ/مل في ماء فائق النقاء في دورق معقم. امزجه 1: 1 مع محلول الجينات ، وحركه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام محرك مغناطيسي.
    2. أضف حمض الأسيتيك بنسبة 1: 500 ، واتركه مع التحريك طوال الليل عند 650 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: سيبدأ محلول الجينات في التبلور على الفور. تأكد من استخدام مغناطيس تحريك بنفس طول قطر الأواني الزجاجية المستخدمة لضمان التقليب الأمثل والمتجانس لجل التشكيل. في اليوم التالي ، سيظهر المحلول الناتج عن التحريك أثناء الهلام لزجا (الشكل 2 أ).
    3. قم بتجزئة محلول الجينات الهلامي ميكانيكيا إلى جسيمات دقيقة عن طريق تجانسه عند 15000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق باستخدام خالط يوضع في مقعد LAF (الشكل 2 ب).
    4. أجهزة الطرد المركزي الجسيمات الدقيقة عند 18500 × جم لمدة 20 دقيقة (الشكل 2C) في درجة حرارة الغرفة.
    5. تخلص بعناية من المادة الطافية داخل مقعد LAF ، وأعد تعليق الجسيمات في DMEM التي تحتوي على 2 mM NaOH و 1٪ P / S ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية (الشكل 2D).
      ملاحظة: يجب أن يعود لون التعليق إلى اللون الأحمر. إذا ظل التعليق أصفر ، أضف NaOH بالتنقيط ، واخلطه حتى يتحول إلى اللون الأحمر (الشكل 2E).
    6. تجانس الجسيمات عند 15000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 18500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. راقب الحبيبات (الشكل 2F) ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية.
      ملاحظة: يمكن تخزين حبيبات الجسيمات الدقيقة من الجينات المعبأة بإحكام عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. إذا لم يتم تعقيم محلول الجينات بالفلتر ، فيجب استخدام الجسيمات الدقيقة في غضون 1 أسبوع.
  2. صياغة مركب الشكل
    1. في اليوم السابق للطباعة، أعد تعليق حبيبات الجسيمات الدقيقة للجينات في ضعف حجم وسط النمو الذي يحتوي على 4٪ HEPES (مخزون 1 M) ومحلول NaHCO3 بنسبة 4٪ في مقعد LAF، واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بطرد مركزي لتعليق الميكروجيل عند 18500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
    3. قم بتحييد الكولاجين المراد مزجه مع جزيئات الجينات الدقيقة في مقعد LAF. قم بتخفيف محلول مخزون الكولاجين للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل ، وقم بتحييده بإضافة 4٪ HEPES و 4٪ NaHCO3. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 3 مل من مركب SHAPE ، امزج 2 مل من جزيئات الجينات الدقيقة مع 1 مل من الكولاجين المحايد (0.12 مل من HEPES ، 0.12 مل من NaHCO3 ، 0.16 مل من وسط النمو ، و 0.6 مل من الكولاجين).
      ملاحظة: يجب التعامل مع جميع المواد التي يتم خلطها مع الكولاجين على الثلج لتجنب بلمرة الكولاجين. بمجرد تحييد الكولاجين ، ستبدأ البلمرة ببطء.
    4. قم بتوليد مركب SHAPE عن طريق خلط حبيبات الجسيمات الدقيقة للجينات مع الكولاجين المخفف والمحايد بنسبة 2: 1. امزج الجل جيدا عن طريق سحب الثلج ببطء لأعلى ولأسفل في مقعد LAF.
      ملاحظة: لا دوامة ، لأن هذا سيؤدي إلى إدخال فقاعات في مادة الدعم.
    5. في مقعد LAF ، انقل المادة المركبة المتولدة إلى لوحة microwell مبردة أو أي حاوية طباعة مناسبة ، واستخدمها في غضون 30 دقيقة (الشكل 3E ، F).

3. ثقافة hNSC وإعداد الحبر الحيوي

  1. استزراع الخلايا في قارورة T75 المغلفة بمستخلص الغشاء القاعدي في وسط النمو. قم بتمرير الخلايا مرتين على الأقل بعد الذوبان قبل استخدامها لتجربة الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D.
  2. قبل الطباعة ، قم بفصل الخلايا إنزيميا باستخدام محلول التربسين 0.025٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وقم بتحييد التربسين بوسط النمو ، وقم بالطرد المركزي تعليق الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، استنشاق المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات في 2-3 مل من وسط النمو.
  3. قم بإجراء تعداد الخلايا ، وطرد الخلايا عند 400 × جم ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط نمو مكمل بصمغ الزانثان بنسبة 0.1٪ (لمنع الخلايا من الترسيب) بتركيز نهائي قدره 9 × 106 خلايا / مل.
  4. استخدم إبرة معدنية حادة 21 جراما لتحميل 100 ميكرولتر من جزيئات الجينات الدقيقة المعبأة بإحكام في حقنة (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: يخدم إنشاء قابس باستخدام الجسيمات الدقيقة للجينات غرضين: فهو يساعد في الحفاظ على ثبات البثق أثناء الطباعة ويسمح بالبثق الكامل للحبر الخلوي المحمل (بدون حجم ميت).
  5. باستخدام نفس الإبرة ، قم بتحميل تعليق الخلية المحضر في المحقنة (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: احرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء أثناء خطوات تحميل المحقنة. سوف تتسبب فقاعات الهواء في عدم الاستقرار أثناء الطباعة.
  6. استبدل إبرة التحميل بإبرة معدنية حادة 27 جم ، والتي سيتم استخدامها للطباعة (الشكل 3C).

4. الطباعة 3D جزءا لا يتجزأ من

  1. تصميم هيكل للطباعة باستخدام البرنامج المشار إليه (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تأكد من ضبط الارتفاع الأولي للهيكل المطبوع إلى داخل عمق دعامة SHAPE المركبة. يمكن العثور على اقتراحات التصميم في الشكل 4 أ (التصاميم الحلزونية والخشبية).
  2. قم بإنشاء رمز G بالنقر فوق إنشاء.
  3. أدخل المحقنة الزجاجية المحملة بالخلايا في رأس بثق حجمي على طابعة حيوية قائمة على البثق (الشكل 3D).
  4. قم بقياس طول إبرة المحقنة الزجاجية المحملة بالخلايا بالنقر فوق قياس طول الإبرة.
  5. ضع لوحة أو حاوية microwell المحملة بمركب SHAPE على الطابعة.
    ملاحظة: احتفظ بلوحة الخلية أو الحاوية عند 4 درجات مئوية حتى الطباعة لمنع التشابك المبكر للدعامة.
  6. قم بقياس ارتفاع سطح بئر فارغة داخل نفس لوحة أو حاوية microwell التي يتم فيها تحميل هلام SHAPE بالنقر فوق SHM (قياس ارتفاع السطح).
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، حدد ارتفاع السطح يدويا عن طريق قياس ارتفاع البئر بالإبرة.
  7. اضبط معدل البثق على 3.6 ميكرولتر / دقيقة ومعدل التغذية على 0.3 مم / ثانية.
    ملاحظة: تأكد من اختبار البثق قبل الطباعة. يمكن أن يتسبب ترسيب الخلايا في انسداد الفوهة ويمكن تجنبه عن طريق بثق حجم صغير مسبقا قبل الطباعة المضمنة الفعلية أو عن طريق إضافة حجم سحب إلى المحقنة الحجمية. في بعض الحالات ، يجب الحفاظ على معدل التغذية أقل من 0.5 مم / ثانية عند إدخال الإبرة في جل SHAPE أو الخروج منه لتجنب سحب الحبر.
  8. قم بتحميل G-Code في واجهة المستخدم الخاصة بالطابعة.
    ملاحظة: يجب إنشاء رمز G جديد في كل مرة يتم فيها إجراء تغييرات على الهيكل المصمم.
  9. ابدأ إجراء الطباعة بالنقر فوق تشغيل (الشكل 3G).
  10. بعد الطباعة مباشرة، ضع جل SHAPE على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة للصلب.
  11. أضف وسط النمو برفق فوق دعامة جل SHAPE الملدن.
  12. في اليوم التالي ، استبدل وسط النمو بوسط تمايز تمت صياغته على النحو التالي: DMEM / F12 مع ثنائي ببتيد L-alanyl-L-glutamine مع 30 mM الجلوكوز ، 5 μM HEPES ، 0.5٪ w / v ألبومين مصل الأبقار الغني بالدهون ، 40 ميكرومتر L- ألانين ، 40 ميكرومتر L- أسباراجين مونوهيدرات ، 40 ميكرومتر L- حمض الأسبارتيك ، 40 ميكرومتر L- حمض الجلوتاميك ، 40 ميكرومتر L- برولين ، 1٪ N2 ملحق ، 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين ، 100 ميكرومتر ثنائي بوتيريل دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (dibutyryl-cAMP) ، و 2 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF).
    ملاحظة: تأكد من عدم إتلاف الهيدروجيل أثناء التغييرات المتوسطة. قم بإمالة اللوحة وإزالة الوسط القديم برفق. أضف وسطا جديدا بالتنقيط إلى جدار البئر الذي يحتوي على الجل بدلا من وضعه مباشرة فوق الجل. لا تستخدم شفاطا لإزالة الوسيط.
  13. قم بتحديث وسيط التمايز كل 2 أيام حتى نقطة النهاية التجريبية.

5. التصوير الفلوري للخلايا الحية

  1. إزالة المتوسطة الزائدة من الجل.
  2. أضف حجما متساويا من 20 ميكرومتر Calcein AM (مخفف في وسط التمايز من محلول المخزون) إلى حجم هلام الدعم.
  3. احتضان لمدة 40 دقيقة على 37 درجة مئوية.
  4. قم بإزالة محلول Calcein AM ، وأضف حجما مناسبا من وسط التمايز الجديد.
  5. نقل اللوحة إلى المجهر للتصوير.

6. الكيمياء المناعية

  1. إزالة المتوسطة الزائدة من الجل.
  2. باستخدام ملعقة صغيرة ، انقل الجل إلى حاوية أكبر تحتوي على DPBS.
  3. اغسل ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في كل مرة باستخدام DPBS ، وانقل اللوحة إلى غطاء الدخان.
  4. إزالة DPBS ، إضافة ما يكفي من محلول الفورمالديهايد 4 ٪ لتغطية هلام ، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 20 دقيقة في كل مرة.
  6. تحضير محلول مانع يتكون من 5٪ مصل حمار ، 0.25٪ منظف ، و 0.02٪ أزيد صوديوم في DPBS.
    ملاحظة: تحضير ثلاثة أضعاف الحجم اللازم لتغطية الجل ؛ سيتم استخدامه لاحقا كأساس لحلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية.
  7. بعد الغسيل باستخدام DPBS ، أضف محلول الحجب إلى الجل ، واحتضنه لمدة 6 ساعات في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد. هز الطبق برفق.
  8. قم بإعداد محلول الجسم المضاد الأساسي عن طريق تخفيف الجسم المضاد TUBB3 في محلول مانع بنسبة 1: 1,000.
  9. قم بإزالة محلول الحجب من الجل ، وأضف محلول الأجسام المضادة الأساسي ، واحتضن لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية. هز الطبق برفق.
  10. اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 20 دقيقة في كل مرة.
  11. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوي عن طريق تخفيف 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI ، 1: 1,000) والجسم المضاد الثانوي (1: 200) في محلول الحظر.
  12. بعد الغسيل باستخدام DPBS ، احتضان الجل في محلول الأجسام المضادة الثانوي لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. هز الطبق برفق.
  13. اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 20 دقيقة في كل مرة ، واحفظه على حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
  14. قبل التصوير ، انقل الجل الملون باستخدام ملعقة إلى طبق أو صفيحة جيدة ذات قاع تصوير رفيع.

النتائج

ينتج عن تحضير ميكروجيل الجينات عن طريق ترقق القص أثناء الهلام الداخلي متبوعا بالتفتيت الميكانيكي هلاميات ألجينات دقيقة متعددة التشتت في الحجم وتشبه التقشر في الشكل كما هو موضح في الشكل 2G. يتراوح حجم هذه الجسيمات غير المنتظمة من أقل من 1 ميكرومتر إلى حوالي 40 ميكرومتر ف...

Discussion

يوفر نهج المواد المركبة SHAPE طريقا متعدد الاستخدامات لصياغة حمامات الدعم القابلة للصلب والوظيفية الحيوية للطباعة 3D المضمنة للأحبار الخلوية. في حين أن هذا البروتوكول يوفر مثالا على الطباعة 3D للتركيبات العصبية ، يمكن بسهولة تكييف صندوق أدوات SHAPE مع التصنيع الحيوي مع مصادر الخلايا الأخرى لل?...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل البحث بشكل أساسي من قبل برنامج BrainMatTrain للاتحاد الأوروبي Horizon 2020 (رقم H2020-MSCA-ITN-2015) بموجب شبكة ماري سكودوفسكا - كوري للتدريب الأولي واتفاقية المنحة رقم 676408. يود كل من CR و JUL أن يعربا عن امتنانهما لمؤسسة Lundbeck (R250-2017-1425) وصندوق الأبحاث المستقل الدنماركي (8048-00050) لدعمهما. نحن نقدر بامتنان تمويل مشروع HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLLHamilton81320
3DDiscovery 3D bioprinterRegenHU
Acetic acidSigma-AldrichA6283
AlbuMAXThermoFisher11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermoFisherA-11001Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)Braun9180109
Blunt Needle (27 G)CellinkNZ5270505001
BioCAD softwareSolidWorks
Calcein AMThermoFisher65-0853-39
Calcium carbonateSigma-AldrichC5929
Dibutyryl-cAMP sodium saltSigma-AldrichD0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)R&D Systems3440-100-01
DAPIThermoFisher62248
DMEM/F-12, GlutaMAXThermoFisher10565018
Donkey serumSigma-AldrichD9663
DPBSThermoFisher14190094
EGFR&D Systems236-EG
FGFR&D Systems3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9Sigma-Aldrich100496
GDNFR&D Systems212-GD
GeltrexThermoFisherA1569601
GlucoseSigma-AldrichG7021
HEPES Buffer (1 M)ThermoFisher15630080
L-AlanineSigma-Aldrich5129
L-Asparagine monohydrateSigma-AldrichA4284
L-Aspartic acidSigma-AldrichA9256
L-Glutamic acidSigma-AldrichG1251
L-ProlineSigma-AldrichP0380
Magnetic stirrer RET basicIKA3622000
N-2 SupplementThermoFisher17502048
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122
S25N-10G dispersing toolIKA4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)FUJIFILM Wako194-13321
Sodium azideSigma-AldrichS2002
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761
Sodium hydroxideSigma-AldrichS5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizerIKA3720000
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trypsin/EDTA SolutionThermoFisherR001100
TUBB3 antibodyBioLegend801213Mouse
Xanthan gum Sigma-AldrichG1253

References

  1. Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
  2. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), e1500655 (2015).
  3. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  4. Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
  5. Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
  6. Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
  7. Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
  8. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  9. LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
  10. Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
  11. Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
  12. McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
  13. Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
  14. Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
  15. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  16. Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved