İnsan Nöral Yapılarının Gömülü 3D Baskısı için Mikrojel-Hücre Dışı Matris Kompozit Desteği

Özet

Bu çalışma, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris kompozitleri içindeki nöral kök hücrelerin serbest biçimli gömülü 3D baskısı için bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, birbirine bağlı insan sinir dokusu yapılarının yüksek doğrulukla programlanabilir modellenmesini sağlar.

Özet

Granüler bir destek ortamı içindeki hücrelerin gömülü 3D baskısı, son on yılda yumuşak doku yapılarının serbest biçimli biyofabrikasyonu için güçlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, granüler jel formülasyonları, büyük miktarlarda hidrojel mikropartiküllerinin uygun maliyetli bir şekilde üretilmesine izin veren sınırlı sayıda biyomalzeme ile sınırlandırılmıştır. Bu nedenle, granüler jel destek ortamı genellikle doğal hücre dışı matriste (ECM) bulunan hücre yapıştırıcı ve hücre öğretici fonksiyonlardan yoksundur.

Bunu ele almak için, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris (SHAPE) kompozitlerinin üretimi için bir metodoloji geliştirilmiştir. SHAPE kompozitleri, birlikte hem programlanabilir yüksek doğrulukta baskıya hem de ayarlanabilir biyofonksiyonel hücre dışı ortama izin veren granüler bir fazdan (mikrojeller) ve sürekli bir fazdan (viskoz ECM çözeltisi) oluşur. Bu çalışma, geliştirilen metodolojinin insan sinir yapılarının hassas biyofabrikasyonu için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.

İlk olarak, SHAPE kompozitlerinde granüler bileşen olarak görev yapan aljinat mikropartikülleri üretilir ve kollajen bazlı sürekli bir bileşenle birleştirilir. Daha sonra, insan nöral kök hücreleri destek materyalinin içine basılır, ardından desteğin tavlanması takip edilir. Basılı yapılar, basılı hücrelerin nöronlara farklılaşmasına izin vermek için haftalarca korunabilir. Aynı zamanda, kollajen sürekli fazı aksonal büyümeye ve bölgelerin birbirine bağlanmasına izin verir. Son olarak, bu çalışma, 3D baskılı insan sinir yapılarını karakterize etmek için canlı hücre floresan görüntüleme ve immünositokimyanın nasıl gerçekleştirileceği hakkında bilgi sağlar.

Giriş

Yumuşak dokuları in vitro olarak taklit eden hücre yüklü hidrojel yapıların hassas ve programlanabilir 3D baskısı büyük bir zorluk teşkil etmektedir. Örneğin, yumuşak hidrojellerin doğrudan ekstrüzyonuna dayanan girişimler doğası gereği sorunludur, çünkü in vivo mikroçevreyi özetlemek için gereken zayıf mekanik özellikler yapısal bütünlük eksikliğine, önceden tanımlanmış özelliklerin deformasyonlarına veya fabrikasyon yapıların tamamen çökmesine neden olur. Bu sorun için geleneksel bir geçici çözüm, son yapının şeklini korumasını sağlayan daha sert bir biyouyumlu malzemeden destekleyici bir iskele basmaktır. Bununla birlikte, bu yaklaşım tasarım olanaklarını büyük ölçüde sınırlar ve bitişik mürekkeplerin dikkatli bir şekilde reolojik ince ayarını gerektirir.

Geleneksel katman katman ekstrüzyon tabanlı 3D baskının sınırlamalarının üstesinden gelmek için, gömülü 3D baskı son yıllarda yumuşak malzeme ve doku üretimi^için güçlü bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6. Mürekkebi bir yüzeyin üstündeki ortam havasında ekstrüzyon yapmak yerine, mürekkep doğrudan istirahatte katı benzeri olan bir destek banyosunun içindeki bir şırınga iğnesi aracılığıyla biriktirilir, ancak yumuşak hücre yüklü malzemenin hassas bir şekilde birikmesini sağlamak için hareketli iğne ucunun etrafında geri dönüşümlü olarak akışkanlaşır. Biriken malzeme, iğnenin ardından destek yeniden katılaştığı için yerinde tutulur. Bu nedenle, gömülü 3D baskı, genişletilmiş tasarım olanakları ^7,8 ile yumuşak biyomalzemelerden karmaşık yapıların yüksek çözünürlüklü serbest biçimli üretimine izin verir.

Granüler jeller, gömülü 3D baskı için destek banyo malzemeleri olarak kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır, çünkü düşük verim gerilimlerinde pürüzsüz, lokalize ve geri dönüşümlü katıdan sıvıya geçişler sergilemek üzere formüle edilebilirler^9,10,11. Yüksek çözünürlüklü baskı için mükemmel reolojik özellikler gösterirken, granüler jeller bir avuç biyomalzeme ile sınırlandırılmıştır¹². Granüler jel formülasyonlarındaki çeşitlilik eksikliği, özellikle dökme hidrojel formülasyonları için mevcut olan çok çeşitli biyomalzemeler göz önüne alındığında belirgindir, basit kimyasallar kullanılarak çok sayıda mikrojelin uygun maliyetli bir şekilde üretilmesi ihtiyacından kaynaklanmaktadır. Granüler jel desteklerinin sınırlı biyomateryal manzarası nedeniyle, baskı desteği tarafından sağlanan hücre dışı mikro ortamın ayarlanması sahada bir zorluk oluşturmaktadır.

Son zamanlarda, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris (SHAPE) kompozitleri¹³ olarak adlandırılan gömülü 3D baskı desteklerinin üretimi için modüler bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yaklaşım, granüler jellerin farklı reolojik özelliklerini, dökme hidrojel formülasyonlarının biyofonksiyonel çok yönlülüğü ile birleştirir. Sunulan SHAPE kompozit desteği, viskoz kollajen bazlı ECM ön jel çözeltisi (sürekli faz, ~% 30 hacim fraksiyonu) ile doldurulmuş artırılmış bir interstisyel alana sahip paketlenmiş aljinat mikropartiküllerinden (granüler faz, ~% 70 hacim fraksiyonu) oluşur. Ayrıca, SHAPE desteğinin, destek banyosunun tavlanmasından sonra nöronlara farklılaştırılabilen ve fonksiyonel olgunlaşmaya ulaşmak için haftalarca muhafaza edilebilen insan nöral kök hücrelerinin (hNSC'ler) yüksek çözünürlüklü birikimini kolaylaştırdığı gösterilmiştir. SHAPE destek banyosunun içine gömülü 3D baskı, çok yönlü bir platform sağlarken, sinir dokusu biyofabrikasyonu için geleneksel tekniklerle ilgili bazı önemli sınırlamaların üstesinden gelir.

Bu çalışma, SHAPE desteğinin içindeki hNSC'lerin gömülü 3D baskısı ve daha sonra fonksiyonel nöronlara farklılaşması için adımları detaylandırmaktadır (Şekil 1). İlk olarak, aljinat mikropartikülleri iç jelasyon sırasında kesme yoluyla üretilir. Bu yaklaşım, özel ekipmanlara ve sitotoksik reaktiflere ihtiyaç duymadan büyük hacimli mikropartiküllerin kolayca üretilmesini sağlar. Ayrıca, aljinat, çeşitli hücre tipleri için biyouyumlu hidrojel substratlarının oluşumu için yaygın olarak bulunan ve ekonomik bir malzeme kaynağıdır. Üretilen aljinat mikropartikülleri, SHAPE kompozit destek malzemesini oluşturmak için bir kollajen çözeltisi ile birleştirilir. Daha sonra, hNSC'ler toplanır ve 3D baskı için hücresel bir biyomürekkep olarak bir şırıngaya yüklenir. SHAPE kompozitinin içindeki hNSC'lerin ekstrüzyon tabanlı gömülü baskısı için bir 3D biyoyazıcı kullanılır. 3D baskılı hücreler, mekansal olarak tanımlanmış ve işlevsel insan sinir yapılarına yol açmak için nöronlara farklılaştırılır. Son olarak, protokol, üretilen doku yapılarının canlı hücre görüntüleme ve immünositokimya kullanılarak nasıl karakterize edilebileceğini açıklar. Ayrıca, optimizasyon ve sorun giderme için ipuçları sağlanmaktadır. Özellikle, granüler ve sürekli fazların hem bileşenleri, nöral uygulamaların ötesindeki diğer hücre ve doku tiplerinin gerektirdiği gibi, farklı biyofonksiyonel moieties, mekanik özellikler ve çapraz bağlama mekanizmalarını barındırmak için diğer hidrojel formülasyonları ile değiştirilebilir.

Protokol

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

1. DMEM / F12'ye L-alanil-L-glutamin dipeptid ile aşağıdaki takviyeleri ekleyerek hücre büyüme ortamını hazırlayın: 30 mM glikoz, 5 μM HEPES,% 0.5 w / v lipid bakımından zengin sığır serum albümini, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparagin monohidrat, 40 μM L-aspartik asit, 40 μM L-glutamik asit, 40 μM L-prolin,% 1 N2 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin ve epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörünün (FGF) her biri 20 ng / L. Bu adımları laminer hava akışı (LAF) tezgahında gerçekleştirin.
2. 60 ° C'de 4 saat boyunca kuvvetlice karıştırarak ultra saf suda% 1 w / v aljinat çözeltisi hazırlayın. Bir LAF tezgahında çözünmüş, sıcak aljinat çözeltisini 0,45 μm gözenek boyutunda bir filtre ile steril filtreleyin. 4 °C'de saklayın.
   NOT: Aljinat çözeltisinin sıcaklığı 60 ° C'nin altındaysa, filtreden geçirilmesi mümkün olmayacaktır.
3. Ultra saf suda 37 g/L NaHCO₃ çözeltisi hazırlayın. NaOH kullanarak çözeltinin pH'ını 9,5'e ayarlayın ve bir LAF tezgahında filtre sterilizasyonu yapın. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.

2. SHAPE kompozit malzeme hazırlama

1. Aljinat mikropartikül üretimi
   1. Steril bir beherde ultra saf suda 2 mg/mL CaCO₃ çözeltisi hazırlayın. Aljinat çözeltisi ile 1: 1 karıştırın ve manyetik bir karıştırıcı kullanarak oda sıcaklığında 1 saat karıştırın.
   2. Asetik asidi 1:500 oranında ekleyin ve gece boyunca 650 rpm'de karıştırmaya bırakın.
      NOT: Aljinat çözeltisi hemen jelleşmeye başlayacaktır. Şekillendirme jelinin optimum ve homojen bir şekilde karıştırılmasını sağlamak için kullanılan cam eşyaların çapıyla aynı uzunlukta bir karıştırma mıknatısı kullandığınızdan emin olun. Ertesi gün, jelasyon sırasında karıştırılarak üretilen çözelti viskoz görünecektir (Şekil 2A).
   3. Jelleşmiş aljinat çözeltisini, bir LAF tezgahına yerleştirilmiş bir homojenizatör ile 10 dakika boyunca 15.000 rpm'de homojenize ederek mekanik olarak mikropartiküllere ayırın (Şekil 2B).
   4. Mikropartikülleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 18.500 × g'da santrifüj edin (Şekil 2C).
   5. Süpernatantı LAF tezgahının içine dikkatlice atın, 2 mM NaOH ve% 1 P / S içeren DDEM'deki parçacıkları yeniden askıya alın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (Şekil 2D).
      NOT: Süspansiyonun rengi kırmızıya geri dönmelidir. Süspansiyon sarı kalırsa, NaOH'yi damla damla ekleyin ve kırmızıya dönene kadar karıştırın (Şekil 2E).
   6. Partikülleri 3 dakika boyunca 15.000 rpm'de homojenize edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 18.500 × g'da santrifüjleyin.
   7. Pelet gözlemleyin (Şekil 2F) ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
      NOT: Sıkıca paketlenmiş aljinat mikropartiküllerinin peletleri, bir sonraki kullanıma kadar 4 ° C'de saklanabilir. Aljinat çözeltisi filtreyle sterilize edilmediyse, mikropartiküller 1 hafta içinde kullanılmalıdır.
2. SHAPE kompozit formülasyonu
   1. Baskıdan bir gün önce, aljinat mikropartikül peletini bir LAF tezgahında% 4 HEPES (1 M stok) ve% 4 NaHCO₃ çözeltisi içeren büyüme ortamının iki katı hacminde yeniden askıya alın ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   2. Mikrojel süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 18.500 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı atın.
   3. Bir LAF tezgahındaki aljinat mikropartikülleri ile karıştırılacak kollajeni nötralize edin. 1 mg / mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için kollajen stok çözeltisini seyreltin ve% 4 HEPES ve% 4 NaHCO₃ ekleyerek nötralize edin. Örneğin, 3 mL SHAPE kompoziti için, 2 mL aljinat mikropartikülünü 1 mL nötralize kollajen (0.12 mL HEPES, 0.12 mL NaHCO₃, 0.16 mL büyüme ortamı ve 0.6 mL kollajen) ile karıştırın.
      NOT: Kollajen polimerizasyonunu önlemek için kollajen ile karıştırılan tüm malzemelerin buz üzerinde işlenmesi gerekir. Kollajen nötralize edilir edilmez, polimerizasyon yavaşça başlayacaktır.
   4. Aljinat mikropartikül peletini seyreltilmiş ve nötralize edilmiş kollajen ile 2: 1 oranında karıştırarak SHAPE kompozitini oluşturun. Bir LAF tezgahında buz üzerinde yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek jeli iyice karıştırın.
      NOT: Vorteks yapmayın, çünkü bu destek malzemesine kabarcıklar sokacaktır.
   5. Bir LAF tezgahında, üretilen kompozit malzemeyi soğutulmuş bir mikro kuyu plakasına veya uygun bir baskı kabına aktarın ve 30 dakika içinde kullanın (Şekil 3E, F).

3. hNSC kültürü ve biyomürekkep hazırlama

1. Büyüme ortamında bazal membran ekstrakt kaplı T75 şişesindeki hücreleri kültürleyin. Hücreleri bir 3D baskı deneyi için kullanmadan önce çözüldükten sonra en az iki kez geçirin.
2. Yazdırmadan önce, 37 ° C'de 5 dakika boyunca% 0.025'lik bir tripsin çözeltisi kullanarak hücreleri enzimatik olarak ayırın, tripsini büyüme ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj edin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve peletleri 2-3 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın.
3. Bir hücre sayımı yapın, hücreleri 400 × g'da santrifüj edin ve peleti% 0.1 ksantan zamkı ile desteklenmiş büyüme ortamında (hücrelerin çökelmesini önlemek için) 9 × 10⁶ hücre / mL'lik bir konsantrasyonda yeniden askıya alın.
4. 100 μL sıkıca paketlenmiş aljinat mikropartiküllerini bir şırıngaya yüklemek için 21 G künt metal iğne kullanın (Şekil 3A).
   NOT: Aljinat mikropartikülleri ile bir tıkaç oluşturmak iki amaca hizmet eder: baskı sırasında ekstrüzyon stabilitesinin korunmasına yardımcı olur ve yüklenen hücresel mürekkebin tamamen ekstrüzyonuna izin verir (ölü hacim yok).
5. Aynı iğneyi kullanarak, hazırlanan hücre süspansiyonunu şırıngaya yükleyin (Şekil 3B).
   NOT: Şırınga yükleme adımları sırasında herhangi bir hava kabarcığı girmemeye dikkat edin. Hava kabarcıkları baskı sırasında kararsızlıklara neden olur.
6. Yükleme iğnesini, baskı için kullanılacak 27 G künt metal iğne ile değiştirin (Şekil 3C).

4. Gömülü 3D baskı

1. Başvurulan yazılımı kullanarak yazdırmak için bir yapı tasarlayın ( bkz.
   NOT: Yazdırılan yapının başlangıç yüksekliğini SHAPE kompozit desteğinin derinliğine ayarladığınızdan emin olun. Tasarım önerileri Şekil 4A'da bulunabilir (spiral ve ahşap yığını tasarımları).
2. Oluştur'a tıklayarak bir G Kodu oluşturun.
3. Hücre yüklü cam şırıngayı ekstrüzyon bazlı bir biyoyazıcı üzerindeki hacimsel ekstrüzyon kafasına yerleştirin (Şekil 3D).
4. İğne Uzunluğu Ölçümü'ne tıklayarak hücre yüklü cam şırınganın iğne uzunluğunu ölçün.
5. SHAPE kompoziti yüklü mikro kuyu plakasını veya kabını yazıcının üzerine yerleştirin.
   NOT: Desteğin erken çapraz bağlanmasını önlemek için hücre plakasını veya kabı yazdırana kadar 4 °C'de tutun.
6. SHM'ye (yüzey yüksekliği ölçümü) tıklayarak SHAPE jelinin yüklendiği aynı mikro kuyucuk plakası veya kabı içindeki boş bir kuyucuğun yüzey yüksekliğini ölçün.
   NOT: Alternatif olarak, kuyunun yüksekliğini iğne ile ölçerek yüzey yüksekliğini manuel olarak belirleyin.
7. Ekstrüzyon hızını 3,6 μL/dak'ya ve besleme hızını 0,3 mm/sn'ye ayarlayın.
   NOT: Yazdırmadan önce ekstrüzyonu test ettiğinizden emin olun. Hücre çökelmesi nozul tıkanmasına neden olabilir ve gerçek gömülü baskıdan önce küçük bir hacmin önceden ekstrüzyonu yapılarak veya hacimsel şırıngaya bir geri çekme hacmi eklenerek önlenebilir. Bazı durumlarda, mürekkebin sürüklenmesini önlemek için iğne SHAPE jelinin içine sokulduğunda veya SHAPE jelinden çıkarken besleme hızının 0,5 mm/sn altında tutulması gerekir.
8. G-Code'u yazıcının kullanıcı arayüzüne yükleyin.
   NOT: Tasarlanan yapıda her değişiklik yapıldığında yeni bir G Kodu oluşturulmalıdır.
9. Çalıştır'a tıklayarak yazdırma prosedürünü başlatın (Şekil 3G).
10. Baskıdan hemen sonra, SHAPE jelini tavlama için 30 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de yerleştirin.
11. Tavlanmış SHAPE jel desteğinin üzerine büyüme ortamını nazikçe ekleyin.
12. Ertesi gün, büyüme ortamını aşağıdaki gibi formüle edilmiş farklılaşma ortamı ile değiştirin: DMEM / F12, 30 mM glikoz ile L-alanil-L-glutamin dipeptid, 5 μM HEPES,% 0.5 lipid bakımından zengin sığır serum albümini, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparagin monohidrat, 40 μM L-aspartik asit, 40 μM L-glutamik asit, 40 μM L-prolin,% 1 N2 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin,% 100 μM dibütiril-siklik adenozin monofosfat (dibütiril-cAMP), ve 2 ng/mL glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF).
    NOT: Ortam değişimleri sırasında hidrojele zarar vermediğinizden emin olun. Plakayı eğin ve eski ortamı yavaşça çıkarın. Doğrudan jelin üzerine değil, jeli içeren kuyucuğun duvarına damla damla taze ortam ekleyin. Ortamı çıkarmak için aspiratör kullanmayın.
13. Farklılaştırma ortamını deneysel uç noktaya kadar her 2 günde bir yenileyin.

5. Canlı hücre floresan görüntüleme

1. Fazla ortamı jelden çıkarın.
2. Destek jelinin hacmine eşit miktarda 20 μM Calcein (stok çözeltisinden farklılaşma ortamında seyreltilmiş) ekleyin.
3. 37 ° C'de 40 dakika inkübe edin.
4. Calcein çözeltisini çıkarın ve uygun miktarda taze farklılaşma ortamı ekleyin.
5. Görüntüleme için plakayı mikroskopa aktarın.

6. İmmünositokimya

1. Fazla ortamı jelden çıkarın.
2. Küçük bir spatula kullanarak, jeli DPBS içeren daha büyük bir kaba aktarın.
3. DPBS ile her seferinde 20 dakika boyunca üç kez yıkayın ve plakayı bir duman davlumbazına aktarın.
4. DPBS'yi çıkarın, jeli örtmek için yeterli% 4 formaldehit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
5. Her seferinde 20 dakika boyunca DPBS ile üç kez yıkayın.
6. DPBS'de %5 eşek serumu, %0,25 deterjan ve %0,02 sodyum azidden oluşan bloke edici çözelti hazırlayın.
   NOT: Jeli örtmek için gereken hacmin üç katını hazırlayın; Daha sonra birincil ve ikincil antikor çözeltilerinin temeli olarak kullanılacaktır.
7. DPBS ile yıkadıktan sonra, blokaj çözeltisini jele ekleyin ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için oda sıcaklığında 6 saat inkübe edin. Tabağı yavaşça sallayın.
8. TUBB3 antikorunu bloke edici çözeltide 1: 1.000 oranında seyrelterek birincil antikor çözeltisini hazırlayın.
9. Bloke edici çözeltiyi jelden çıkarın, birincil antikor çözeltisini ekleyin ve 4 ° C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Tabağı yavaşça sallayın.
10. Her seferinde 20 dakika boyunca DPBS ile üç kez yıkayın.
11. Sekonder antikor solüsyonunu, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:1,000) ve sekonder antikoru (1:200) bloke edici çözelti içinde seyrelterek hazırlayın.
12. DPBS ile yıkadıktan sonra, jeli sekonder antikor çözeltisinde 4 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Tabağı yavaşça sallayın.
13. DPBS ile her seferinde 20 dakika boyunca üç kez yıkayın ve görüntülemeye kadar 4 ° C'de saklayın.
14. Görüntülemeden önce, lekeli jeli bir spatula ile bir tabağa veya ince bir görüntüleme tabanına sahip bir kuyu plakasına aktarın.

Sonuçlar

İç jelasyon sırasında kesme inceltme yoluyla aljinat mikrojel preparasyonu ve ardından mekanik parçalanma, Şekil 2G'de görüldüğü gibi boyut olarak polidağılmış ve pul benzeri şekilli aljinat mikrojelleri verir. Bu düzensiz parçacıkların boyutu 1 μm'den az ila yaklaşık 40 μm çap arasında değişmektedir. Sıkıca paketlendiğinde, mikropartiküller, karşılık gelen hücre kültürü ortamından sadece biraz daha opak olan şeffaf bir dökme malzeme oluşt...

Tartışmalar

SHAPE kompozit malzeme yaklaşımı, hücresel mürekkeplerin gömülü 3D baskısı için tavlanabilir ve biyofonksiyonel destek banyolarının formülasyonu için çok yönlü bir yol sağlar. Bu protokol, nöral yapıların 3D baskısına bir örnek sunarken, SHAPE araç kutusu, bir dizi hedef doku tipinin hassas mühendisliği için diğer hücre kaynaklarıyla biyofabrikasyona kolayca uyarlanabilir. Baskı yaklaşımı ayrıca, etkileşimlerini incelemek veya hücresel bölmelerin (örneğin, nöronlar ve glial hüc...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253