Suporte composto de matriz extracelular microgel para impressão 3D incorporada de construções neurais humanas

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para a impressão 3D embutida em forma livre de células-tronco neurais dentro de compósitos de matriz extracelular com partículas revencíveis auto-reparáveis. O protocolo permite a padronização programável de construções de tecido neural humano interconectadas com alta fidelidade.

Resumo

A impressão 3D embutida de células dentro de um meio de suporte granular emergiu na última década como uma abordagem poderosa para a biofabricação de forma livre de construções de tecidos moles. No entanto, formulações de gel granular têm sido restritas a um número limitado de biomateriais que permitem a geração custo-efetiva de grandes quantidades de micropartículas de hidrogel. Portanto, os meios de suporte em gel granular geralmente não têm as funções adesivo-celular e instrutivo-celular encontradas na matriz extracelular nativa (MEC).

Para resolver isso, uma metodologia foi desenvolvida para a geração de compósitos de matriz extracelular recozida (SHAPE) auto-reparáveis. Os compósitos SHAPE consistem em uma fase granular (microgéis) e uma fase contínua (solução viscosa de ECM) que, juntas, permitem uma impressão programável de alta fidelidade e um ambiente extracelular biofuncional ajustável. Este trabalho descreve como a metodologia desenvolvida pode ser utilizada para a biofabricação precisa de construtos neurais humanos.

Primeiro, as micropartículas de alginato, que servem como componente granular nos compósitos SHAPE, são fabricadas e combinadas com um componente contínuo à base de colágeno. Em seguida, células-tronco neurais humanas são impressas dentro do material de suporte, seguido pelo recozimento do suporte. As construções impressas podem ser mantidas por semanas para permitir a diferenciação das células impressas em neurônios. Simultaneamente, a fase contínua do colágeno permite o crescimento axonal e a interligação de regiões. Finalmente, este trabalho fornece informações sobre como realizar imagens de fluorescência de células vivas e imunocitoquímica para caracterizar as construções neurais humanas impressas em 3D.

Introdução

A impressão 3D precisa e programável de construções de hidrogel carregadas de células que mimetizam tecidos moles in vitro apresenta um grande desafio. Por exemplo, tentativas baseadas na extrusão direta de hidrogéis moles são inerentemente problemáticas, pois as más propriedades mecânicas necessárias para recapitular o microambiente in vivo levam à falta de integridade estrutural, deformações das características predefinidas ou ao colapso completo das estruturas fabricadas. Uma solução convencional para esse problema é imprimir um andaime de suporte a partir de um material biocompatível mais rígido que permita que a construção final mantenha sua forma. No entanto, essa abordagem limita muito as possibilidades de projeto e requer um ajuste reológico cuidadoso das tintas adjacentes.

Para superar as limitações da tradicional impressão 3D baseada em extrusão camada por camada, a impressão 3D embarcada surgiu nos últimos anos como uma poderosa alternativa para a fabricação de materiais moles e tecidos 1,2,3,4,5,6. Em vez de extrudar a tinta no ar ambiente em cima de uma superfície, a tinta é depositada diretamente através de uma agulha de seringa dentro de um banho de suporte que é sólido em repouso, mas fluidiza reversivelmente ao redor da ponta da agulha em movimento para permitir a deposição precisa de material carregado de células moles. O material depositado é mantido no local à medida que o suporte se ressolidifica na esteira da agulha. Como tal, a impressão 3D embarcada permite a fabricação de forma livre de alta resolução de estruturas intrincadas a partir de biomateriais macios com possibilidades de design expandidas ^7,8.

Os géis granulares têm sido extensivamente explorados como materiais de banho de suporte para impressão 3D embarcada, uma vez que podem ser formulados para exibir transições sólido-líquido suaves, localizadas e reversíveis em baixas tensões de escoamento 9,10,11. Embora apresentem excelentes propriedades reológicas para impressão de alta resolução, os géis granulares têm sido restritos a um punhado de biomateriais¹². A falta de diversidade nas formulações de gel granular, que é particularmente evidente se considerarmos a ampla gama de biomateriais disponíveis para formulações de hidrogel a granel, é causada pela necessidade de geração custo-efetiva de um grande número de microgéis usando químicas simples. Devido à paisagem limitada de biomateriais de suportes de gel granular, a sintonia do microambiente extracelular fornecida pelo suporte de impressão apresenta um desafio no campo.

Recentemente, uma abordagem modular foi desenvolvida para a geração de suportes de impressão 3D incorporados, denominados compósitos de matriz extracelular recoligível de auto-cura (SHAPE)¹³. Esta abordagem combina as distintas propriedades reológicas dos géis granulares com a versatilidade biofuncional das formulações de hidrogel a granel. O suporte compósito SHAPE apresentado consiste em micropartículas de alginato empacotado (fase granular, ~70% de fração volumétrica) com um espaço intersticial aumentado preenchido com uma solução viscosa de pré-gel de MEC à base de colágeno (fase contínua, ~30% de fração volumétrica). Demonstrou-se ainda que o suporte SHAPE facilita a deposição de células-tronco neurais humanas (hNSCs) que, após o anelamento do banho de suporte, podem ser diferenciadas em neurônios e mantidas por semanas para atingir a maturação funcional. A impressão 3D embutida dentro do banho de suporte SHAPE supera algumas das principais limitações relacionadas às técnicas convencionais de biofabricação de tecido neural, fornecendo uma plataforma versátil.

Este trabalho detalha os passos para a impressão 3D embutida de hNSCs dentro do suporte SHAPE e sua subsequente diferenciação em neurônios funcionais (Figura 1). Primeiro, as micropartículas de alginato são geradas via cisalhamento durante a gelificação interna. Esta abordagem permite a fácil geração de grandes volumes de micropartículas sem a necessidade de equipamentos especializados e reagentes citotóxicos. Além disso, o alginato é uma fonte de material amplamente disponível e econômica para a formação de substratos de hidrogel biocompatíveis para uma ampla gama de tipos celulares. As micropartículas de alginato geradas são combinadas com uma solução de colágeno para formar o material de suporte compósito SHAPE. Em seguida, os hNSCs são colhidos e carregados em uma seringa como uma biotinta celular para impressão 3D. Uma bioimpressora 3D é usada para a impressão embarcada baseada em extrusão de hNSCs dentro do compósito SHAPE. As células impressas em 3D são diferenciadas em neurônios para dar origem a construções neurais humanas espacialmente definidas e funcionais. Finalmente, o protocolo descreve como os construtos teciduais gerados podem ser caracterizados usando imagens de células vivas e imunocitoquímica. Além disso, dicas para otimização e solução de problemas são fornecidas. Notavelmente, ambos os componentes das fases granular e contínua podem ser trocados com outras formulações de hidrogel para acomodar diferentes metades biofuncionais, propriedades mecânicas e mecanismos de reticulação, conforme exigido por outros tipos de células e tecidos além de aplicações neurais.

Protocolo

1. Preparação dos tampões e reagentes

1. Preparar o meio de crescimento celular adicionando os seguintes suplementos ao DMEM/F12 com dipeptídeo L-alanil-L-glutamina: 30 mM de glicose, 5 μM de HEPES, 0,5% p/v de albumina de soro bovino rico em lipídios, 40 μM L-alanina, 40 μM L-asparagina monohidratada, 40 μM de ácido L-aspártico, 40 μM de ácido L-glutâmico, 40 μM de L-prolina, 1% de suplemento de N2, 1% de penicilina-estreptomicina e 20 ng/L de fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento de fibroblastos (FGF). Execute essas etapas em uma bancada de fluxo de ar laminar (LAF).
2. Preparar solução de alginato a 1% (m/v) em água ultrapura agitando vigorosamente durante 4 h a 60 °C. Filtrar estéril a solução de alginato quente dissolvido com um filtro de tamanho de poro de 0,45 μm em uma bancada de LAF. Conservar a 4 °C.
   NOTA: Se a temperatura da solução de alginato for inferior a 60 °C, não será possível passá-la através do filtro.
3. Preparar uma solução de NaHCO₃ a 37 g/L em água ultrapura. Ajustar o pH da solução para 9,5 usando NaOH e filtrar-esterilizar em uma bancada de LAF. Conservar a solução a 4 °C.

2. Preparação do material compósito SHAPE

1. Geração de micropartículas de alginato
   1. Preparar uma solução de 2 mg/mL de CaCO₃ em água ultrapura em um copo estéril. Misture 1:1 com a solução de alginato e mexa durante 1 h à temperatura ambiente utilizando um agitador magnético.
   2. Adicione o ácido acético na proporção de 1:500 e deixe mexer durante a noite a 650 rpm.
      NOTA: A solução de alginato começará a gelificar imediatamente. Certifique-se de usar um ímã de agitação com o mesmo comprimento que o diâmetro da vidraria usada para garantir a agitação ideal e homogênea do gel formador. No dia seguinte, a solução gerada por agitação durante a gelificação aparecerá viscosa (Figura 2A).
   3. Fragmentar mecanicamente a solução gelificada de alginato em micropartículas homogeneizando-a a 15.000 rpm por 10 min com um homogeneizador colocado em uma bancada de LAF (Figura 2B).
   4. Centrifugar as micropartículas a 18.500 × g por 20 min (Figura 2C) à temperatura ambiente.
   5. Descarte cuidadosamente o sobrenadante dentro da bancada do LAF, ressuspenda as partículas em DMEM contendo 2 mM de NaOH e 1% de P/S e incube durante a noite a 4 °C (Figura 2D).
      NOTA: A cor da suspensão deve voltar para vermelho. Se a suspensão permanecer amarela, adicione NaOH gota a gota e misture até ficar vermelha (Figura 2E).
   6. Homogeneizar as partículas a 15.000 rpm por 3 min e centrifugar a 18.500 × g por 10 min à temperatura ambiente.
   7. Observe o pellet (Figura 2F) e retire o sobrenadante cuidadosamente.
      NOTA: O pellet de micropartículas de alginato bem embalado pode ser armazenado a 4 °C até nova utilização. Se a solução de alginato não foi esterilizada por filtro, as micropartículas devem ser usadas dentro de 1 semana.
2. Formulação composta SHAPE
   1. No dia anterior à impressão, ressuspender o pellet de micropartículas de alginato em duas vezes o volume do meio de crescimento contendo solução de HEPES a 4% (estoque de 1 M) e NaHCO₃ a 4% em uma bancada de LAF e incubá-lo durante a noite à temperatura ambiente.
   2. Centrifugar a suspensão de microgel a 18.500 × g por 10 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
   3. Neutralizar o colágeno a ser misturado com as micropartículas de alginato em uma bancada de LAF. Diluir a solução estoque de colágeno para atingir uma concentração final de 1 mg/mL e neutralizá-la adicionando 4% de HEPES e NaHCO₃ a 4%. Por exemplo, para 3 mL de compósito SHAPE, misture 2 mL de micropartículas de alginato com 1 mL de colágeno neutralizado (0,12 mL de HEPES, 0,12 mL de NaHCO₃, 0,16 mL de meio de crescimento e 0,6 mL de colágeno).
      OBS: Todos os materiais que estão sendo misturados com colágeno precisam ser manuseados no gelo para evitar a polimerização do colágeno. Assim que o colágeno é neutralizado, a polimerização começará lentamente.
   4. Gere o compósito SHAPE misturando o pellet de micropartículas de alginato com o colágeno diluído e neutralizado na proporção de 2:1. Misture bem o gel pipetando lentamente para cima e para baixo no gelo em um banco LAF.
      NOTA: Não faça vórtices, pois isso introduzirá bolhas no material de suporte.
   5. Em uma bancada LAF, transfira o material compósito gerado para uma placa de micropoço resfriada ou qualquer recipiente de impressão adequado e use dentro de 30 min (Figura 3E, F).

3. Cultura hNSC e preparação de biotinta

1. Cultivar as células em frasco T75 revestido com extrato de membrana basal em meio de cultura. Passe as células pelo menos duas vezes após o descongelamento antes de usá-las para um experimento de impressão 3D.
2. Antes da impressão, dissociar as células enzimaticamente usando uma solução de tripsina a 0,025% por 5 min a 37 °C, neutralizar a tripsina com meio de crescimento e centrifugar a suspensão celular a 400 × g por 5 min à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 2-3 mL de meio de cultura.
3. Realizar contagem celular, centrifugar as células a 400 × g e ressuspender o pellet em meio de cultura suplementado com goma xantana a 0,1% (para evitar sedimentação das células) na concentração final de 9 × 10⁶ células/mL.
4. Use uma agulha metálica romba de 21 G para carregar 100 μL de micropartículas de alginato firmemente embaladas em uma seringa (Figura 3A).
   NOTA: Criar um plugue com as micropartículas de alginato serve a dois propósitos: ajuda a manter a estabilidade da extrusão durante a impressão e permite a extrusão completa da tinta celular carregada (sem volume morto).
5. Com a mesma agulha, carregar a suspensão de células preparada na seringa (Figura 3B).
   NOTA: Tome cuidado extra para não introduzir bolhas de ar durante as etapas de carregamento da seringa. Bolhas de ar causarão instabilidades durante a impressão.
6. Substitua a agulha de carregamento por uma agulha metálica romba de 27 G, que será utilizada para impressão (Figura 3C).

4. Impressão 3D incorporada

1. Projete uma estrutura para imprimir usando o software referenciado (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Certifique-se de ajustar a altura inicial da estrutura impressa para dentro da profundidade do suporte composto SHAPE. Sugestões de design podem ser encontradas na Figura 4A (desenhos em espiral e de estacas de madeira).
2. Gere um G-Code clicando em Gerar.
3. Insira a seringa de vidro carregada de células em uma cabeça de extrusão volumétrica em uma bioimpressora baseada em extrusão (Figura 3D).
4. Meça o comprimento da agulha da seringa de vidro carregada de células clicando em Medição do comprimento da agulha.
5. Coloque a placa ou o recipiente de micropoço carregado com o composto SHAPE na impressora.
   NOTA: Mantenha a placa celular ou o recipiente a 4 °C até à impressão para evitar a reticulação prematura do suporte.
6. Meça a altura da superfície de um poço vazio dentro da mesma placa ou recipiente de micropoço em que o gel SHAPE é carregado clicando em SHM (medição de altura de superfície).
   NOTA: Alternativamente, determine a altura da superfície manualmente medindo a altura do poço com a agulha.
7. Ajuste a taxa de extrusão para 3,6 μL/min e a taxa de alimentação para 0,3 mm/s.
   NOTA: Certifique-se de testar a extrusão antes de imprimir. A sedimentação celular pode causar entupimento do bico e pode ser evitada pré-extrudando um pequeno volume antes da impressão incorporada real ou adicionando um volume de retração à seringa volumétrica. Em alguns casos, a taxa de alimentação precisa ser mantida abaixo de 0,5 mm/s quando a agulha está sendo inserida ou saindo do gel SHAPE para evitar o arraste da tinta.
8. Carregue o G-Code na interface do usuário da impressora.
   NOTA: Um novo G-Code precisa ser gerado toda vez que alterações são feitas na estrutura projetada.
9. Inicie o procedimento de impressão clicando em Executar (Figura 3G).
10. Imediatamente após a impressão, colocar o gel SHAPE a 37 °C numa incubadora de cultura celular durante 30 minutos para recozimento.
11. Adicione o meio de crescimento suavemente por cima do suporte de gel SHAPE recozido.
12. No dia seguinte, substituir o meio de crescimento por meio de diferenciação formulado da seguinte forma: DMEM/F12 por dipeptídeo L-alanil-L-glutamina com glicose 30 mM, 5 μM HEPES, albumina de soro bovino rica em lipídios a 0,5%, 40 μM L-alanina, 40 μM L-asparagina monohidratada, 40 μM L-ácido aspártico, 40 μM L-ácido glutâmico, 40 μM L-prolina, 1% suplemento N2, 1% penicilina-estreptomicina, 100 μM dibutiril-adenosina monofosfato cíclico (dibutiril-cAMP), e 2 ng/mL de fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF).
    NOTA: Certifique-se de não danificar o hidrogel durante as trocas do meio. Incline o prato e retire o meio velho delicadamente. Adicione meio fresco gota a gota na parede do poço que contém o gel em vez de diretamente em cima do gel. Não use um aspirador para remover o meio.
13. Atualizar o meio de diferenciação a cada 2 dias até o desfecho experimental.

5. Imagem de fluorescência de células vivas

1. Retire o excesso de meio do gel.
2. Adicionar um volume igual de 20 μM de calceína AM (diluído em meio de diferenciação a partir da solução-mãe) ao volume do gel suporte.
3. Incubar durante 40 min a 37 °C.
4. Retire a solução de Calcein AM e adicione um volume apropriado de meio de diferenciação fresco.
5. Transfira a placa para o microscópio para obtenção de imagens.

6. Imunocitoquímica

1. Retire o excesso de meio do gel.
2. Usando uma espátula pequena, transfira o gel para um recipiente maior contendo DPBS.
3. Lave três vezes por 20 min cada vez com DPBS e transfira a placa para um exaustor.
4. Retire o DPBS, adicione solução de formaldeído a 4% suficiente para cobrir o gel e incube durante 1 h à temperatura ambiente.
5. Lave três vezes com DPBS por 20 min de cada vez.
6. Preparar solução de bloqueio composta por soro de burro a 5%, detergente a 0,25% e azida sódica a 0,02% em DPBS.
   OBS: Preparar três vezes o volume necessário para cobrir o gel; será usado posteriormente como base para as soluções de anticorpos primários e secundários.
7. Após a lavagem com DPBS, adicione a solução de bloqueio ao gel e incube por 6 h à temperatura ambiente para evitar ligação inespecífica. Agite o prato suavemente.
8. Preparar a solução de anticorpos primários diluindo o anticorpo TUBB3 em solução de bloqueio na proporção de 1:1.000.
9. Retire a solução de bloqueio do gel, adicione a solução de anticorpos primários e incube durante 48 h a 4 °C. Agite o prato suavemente.
10. Lave três vezes com DPBS por 20 min de cada vez.
11. Preparar a solução de anticorpos secundários diluindo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:1.000) e o anticorpo secundário (1:200) em solução de bloqueio.
12. Após lavagem com DPBS, incubar o gel na solução de anticorpos secundários durante 24 h a 4 °C. Agite o prato suavemente.
13. Lavar três vezes com DPBS durante 20 min de cada vez e conservar a 4 °C até obter imagens.
14. Antes da aquisição de imagens, transfira o gel corado com uma espátula para um prato ou uma placa de poço com um fundo fino de imagem.

Resultados

A preparação de microgel de alginato via afinamento de cisalhamento durante a gelificação interna seguida de fragmentação mecânica produz microgéis de alginato que são polidispersos em tamanho e forma de flocos, como visto na Figura 2G. O tamanho dessas partículas irregulares varia de menos de 1 μm a aproximadamente 40 μm de diâmetro. Quando bem embaladas, as micropartículas formam um material transparente a granel que é apenas ligeiramente mais opaco do que o meio de...

Discussão

A abordagem de material compósito SHAPE fornece uma rota versátil para a formulação de banhos de suporte recozidos e biofuncionais para a impressão 3D incorporada de tintas celulares. Embora este protocolo forneça um exemplo da impressão 3D de construções neurais, a caixa de ferramentas SHAPE poderia ser facilmente adaptada à biofabricação com outras fontes de células para a engenharia precisa de uma variedade de tipos de tecidos-alvo. A abordagem de impressão também permitiria a padronização precisa de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253