Suporte composto de matriz extracelular microgel para impressão 3D incorporada de construções neurais humanas

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para a impressão 3D embutida em forma livre de células-tronco neurais dentro de compósitos de matriz extracelular com partículas revencíveis auto-reparáveis. O protocolo permite a padronização programável de construções de tecido neural humano interconectadas com alta fidelidade.

Resumo

A impressão 3D embutida de células dentro de um meio de suporte granular emergiu na última década como uma abordagem poderosa para a biofabricação de forma livre de construções de tecidos moles. No entanto, formulações de gel granular têm sido restritas a um número limitado de biomateriais que permitem a geração custo-efetiva de grandes quantidades de micropartículas de hidrogel. Portanto, os meios de suporte em gel granular geralmente não têm as funções adesivo-celular e instrutivo-celular encontradas na matriz extracelular nativa (MEC).

Para resolver isso, uma metodologia foi desenvolvida para a geração de compósitos de matriz extracelular recozida (SHAPE) auto-reparáveis. Os compósitos SHAPE consistem em uma fase granular (microgéis) e uma fase contínua (solução viscosa de ECM) que, juntas, permitem uma impressão programável de alta fidelidade e um ambiente extracelular biofuncional ajustável. Este trabalho descreve como a metodologia desenvolvida pode ser utilizada para a biofabricação precisa de construtos neurais humanos.

Primeiro, as micropartículas de alginato, que servem como componente granular nos compósitos SHAPE, são fabricadas e combinadas com um componente contínuo à base de colágeno. Em seguida, células-tronco neurais humanas são impressas dentro do material de suporte, seguido pelo recozimento do suporte. As construções impressas podem ser mantidas por semanas para permitir a diferenciação das células impressas em neurônios. Simultaneamente, a fase contínua do colágeno permite o crescimento axonal e a interligação de regiões. Finalmente, este trabalho fornece informações sobre como realizar imagens de fluorescência de células vivas e imunocitoquímica para caracterizar as construções neurais humanas impressas em 3D.

Introdução

A impressão 3D precisa e programável de construções de hidrogel carregadas de células que mimetizam tecidos moles in vitro apresenta um grande desafio. Por exemplo, tentativas baseadas na extrusão direta de hidrogéis moles são inerentemente problemáticas, pois as más propriedades mecânicas necessárias para recapitular o microambiente in vivo levam à falta de integridade estrutural, deformações das características predefinidas ou ao colapso completo das estruturas fabricadas. Uma solução convencional para esse problema é imprimir um andaime de suporte a partir de um material biocompatível mais rígido que permita que a construção final mantenha sua for....

Protocolo

1. Preparação dos tampões e reagentes

1. Preparar o meio de crescimento celular adicionando os seguintes suplementos ao DMEM/F12 com dipeptídeo L-alanil-L-glutamina: 30 mM de glicose, 5 μM de HEPES, 0,5% p/v de albumina de soro bovino rico em lipídios, 40 μM L-alanina, 40 μM L-asparagina monohidratada, 40 μM de ácido L-aspártico, 40 μM de ácido L-glutâmico, 40 μM de L-prolina, 1% de suplemento de N2, 1% de penicilina-estreptomicina e 20 ng/L de fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento de fibroblastos (FGF). Execute essas etapas em uma bancada de fluxo de ar laminar (LAF).
2. Preparar solução de alginato a 1% (m/v) em ....

Resultados

A preparação de microgel de alginato via afinamento de cisalhamento durante a gelificação interna seguida de fragmentação mecânica produz microgéis de alginato que são polidispersos em tamanho e forma de flocos, como visto na Figura 2G. O tamanho dessas partículas irregulares varia de menos de 1 μm a aproximadamente 40 μm de diâmetro. Quando bem embaladas, as micropartículas formam um material transparente a granel que é apenas ligeiramente mais opaco do que o meio de.......

Discussão

A abordagem de material compósito SHAPE fornece uma rota versátil para a formulação de banhos de suporte recozidos e biofuncionais para a impressão 3D incorporada de tintas celulares. Embora este protocolo forneça um exemplo da impressão 3D de construções neurais, a caixa de ferramentas SHAPE poderia ser facilmente adaptada à biofabricação com outras fontes de células para a engenharia precisa de uma variedade de tipos de tecidos-alvo. A abordagem de impressão também permitiria a padronização precisa de .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253