Композитная поддержка микрогеля и внеклеточного матрикса для встроенной 3D-печати нейронных конструкций человека

Резюме

В этой работе описывается протокол встроенной 3D-печати произвольной формы нервных стволовых клеток внутри самовосстанавливающихся отожженных композитов частица-внеклеточный матрикс. Протокол позволяет программировать паттерны взаимосвязанных конструкций нервной ткани человека с высокой точностью.

Аннотация

Встроенная 3D-печать клеток внутри гранулированной опорной среды появилась в последнее десятилетие как мощный подход к биофабрикации мягких тканей произвольной формы. Однако гранулированные гелевые составы были ограничены ограниченным числом биоматериалов, которые позволяют экономически эффективно генерировать большое количество микрочастиц гидрогеля. Таким образом, гранулированным гелевым носителям, как правило, не хватает клеточно-адгезивных и клеточных инструктивных функций, обнаруженных в нативном внеклеточном матриксе (ECM).

Для решения этой проблемы была разработана методология создания самовосстанавливающихся отожженных композитов частица и внеклеточный матрикс (SHAPE). Композиты SHAPE состоят из гранулированной фазы (микрогели) и непрерывной фазы (вязкий раствор ECM), которые вместе обеспечивают как программируемую печать с высокой точностью, так и регулируемую биофункциональную внеклеточную среду. В этой работе описывается, как разработанная методология может быть использована для точной биофабрикации нейронных конструкций человека.

Во-первых, альгинатные микрочастицы, которые служат гранулированным компонентом в композитах SHAPE, изготавливаются и комбинируются с непрерывным компонентом на основе коллагена. Затем нервные стволовые клетки человека печатаются внутри опорного материала с последующим отжигом опоры. Напечатанные конструкции могут поддерживаться в течение нескольких недель, чтобы обеспечить дифференцировку напечатанных клеток в нейроны. В то же время непрерывная фаза коллагена обеспечивает рост аксонов и взаимосвязь областей. Наконец, эта работа предоставляет информацию о том, как выполнять флуоресцентную визуализацию живых клеток и иммуноцитохимию для характеристики нейронных конструкций человека, напечатанных на 3D-принтере.

Введение

Точная и программируемая 3D-печать нагруженных клетками гидрогелевых конструкций, имитирующих мягкие ткани in vitro , представляет собой серьезную проблему. Например, попытки, основанные на прямой экструзии мягких гидрогелей, по своей сути проблематичны, поскольку плохие механические свойства, необходимые для повторения микроокружения in vivo , приводят к отсутствию структурной целостности, деформации предопределенных признаков или полному разрушению изготовленных конструкций. Обычным обходным путем для этой проблемы является печать поддерживающих лесов из более жесткого биосовместимого материала, который позволяет окончательной конструкции сохранять свою форму. Однако такой подход сильно ограничивает возможности дизайна и требует тщательной реологической тонкой настройки соседних красок.

Чтобы преодолеть ограничения традиционной послойной экструзионной 3D-печати, в последние годы встроенная 3D-печать стала мощной альтернативой для изготовления мягких материалов и тканей 1,2,3,4,5,6. Вместо того, чтобы экструдировать чернила в окружающем воздухе поверх поверхности, чернила непосредственно осаждаются через иглу шприца внутри опорной ванны, которая в состоянии покоя имеет твердое тело, но обратимо псевдоожижается вокруг движущегося кончика иглы, чтобы обеспечить точное осаждение мягкого материала, содержащего клетки. Осажденный материал удерживается на месте по мере того, как опора затвердевает после нажатия иглы. Таким образом, встроенная 3D-печать позволяет изготавливать сложные структуры произвольной формы с высоким разрешением из мягких биоматериалов с расширенными возможностями проектирования ^7,8.

Гранулированные гели были широко исследованы в качестве материалов для опорных ванн для встроенной 3D-печати, поскольку они могут быть разработаны для демонстрации плавных, локализованных и обратимых переходов из твердого тела в жидкость при низких напряжениях текучести ^9,10,11. Несмотря на то, что гранулированные гели демонстрируют превосходные реологические свойства для печати с высоким разрешением, они ограничены несколькими биоматериалами¹². Отсутствие разнообразия в гранулированных гелевых составах, что особенно очевидно, если учесть широкий спектр биоматериалов, доступных для объемных гидрогелевых составов, вызвано необходимостью экономически эффективного производства большого количества микрогелей с использованием простых химических составов. Из-за ограниченного биоматериального ландшафта гранулированных гелевых носителей настройка внеклеточного микроокружения, обеспечиваемого печатной подложкой, представляет собой проблему в полевых условиях.

Недавно был разработан модульный подход к созданию встроенных опор для 3D-печати, называемых самовосстанавливающимися отожженными частицами-внеклеточными матриксами (SHAPE)¹³. Этот подход сочетает в себе различные реологические свойства гранулированных гелей с биофункциональной универсальностью объемных гидрогелевых составов. Представленная композитная основа SHAPE состоит из упакованных альгинатных микрочастиц (гранулированная фаза, объемная доля ~70%) с увеличенным межтканевым пространством, заполненным вязким раствором прегеля ECM на основе коллагена (непрерывная фаза, объемная доля ~30%). Кроме того, было показано, что опора SHAPE облегчает осаждение нервных стволовых клеток человека (hNSC) с высоким разрешением, которые после отжига опорной ванны могут быть дифференцированы в нейроны и поддерживаться в течение нескольких недель до достижения функционального созревания. Встроенная 3D-печать внутри опорной ванны SHAPE преодолевает некоторые из основных ограничений, связанных с традиционными методами биофабрикации нервной ткани, обеспечивая при этом универсальную платформу.

В этой работе подробно описаны этапы встроенной 3D-печати hNSC внутри опоры SHAPE и их последующей дифференцировки в функциональные нейроны (рис. 1). Во-первых, альгинатные микрочастицы образуются при сдвиге во время внутреннего гелеобразования. Такой подход позволяет легко генерировать большие объемы микрочастиц без необходимости использования специализированного оборудования и цитотоксических реагентов. Кроме того, альгинат является широко доступным и экономичным источником материала для формирования биосовместимых гидрогелевых субстратов для широкого спектра типов клеток. Полученные альгинатные микрочастицы объединяются с раствором коллагена с образованием композитного опорного материала SHAPE. Затем hNSC собирают и загружают в шприц в виде клеточных биочернил для 3D-печати. 3D-биопринтер используется для экструзионной встроенной печати hNSC внутри композита SHAPE. Клетки, напечатанные на 3D-принтере, дифференцируются в нейроны, чтобы дать начало пространственно определенным и функциональным нейронным конструкциям человека. Наконец, протокол описывает, как генерируемые тканевые конструкции могут быть охарактеризованы с использованием визуализации живых клеток и иммуноцитохимии. Кроме того, предоставляются советы по оптимизации и устранению неполадок. Примечательно, что как компоненты гранулированной, так и непрерывной фаз могут быть заменены с другими гидрогелевыми составами для размещения различных биофункциональных фрагментов, механических свойств и механизмов сшивания, как того требуют другие типы клеток и тканей, помимо нейронных применений.

протокол

1. Приготовление буферов и реагентов

1. Приготовьте среду для роста клеток, добавив следующие добавки к DMEM/F12 с дипептидом L-аланил-L-глутамина: 30 мМ глюкозы, 5 мкМ HEPES, 0,5% богатого липидами бычьего сывороточного альбумина, 40 мкМ L-аланина, 40 мкМ моногидрата L-аспарагина, 40 мкМ L-аспарагиновой кислоты, 40 мкМ L-глутаминовой кислоты, 40 мкМ L-пролина, 1% добавки N2, 1% пенициллина-стрептомицина и по 20 нг/л эпидермального фактора роста (EGF) и фактора роста фибробластов (FGF). Выполните эти действия на скамье с ламинарным воздушным потоком (LAF).
2. Приготовьте 1% раствор альгината по массе в сверхчистой воде, энергично помешивая в течение 4 ч при 60 °C. Стерильно отфильтруйте растворенный горячий раствор альгината с помощью фильтра размером пор 0,45 мкм на стенде LAF. Хранить при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если температура альгинатного раствора ниже 60 °C, его невозможно будет пропустить через фильтр.
3. Приготовьте раствор NaHCO₃ 37 г/л в сверхчистой воде. Отрегулируйте рН раствора до 9,5 с помощью NaOH и простерилизуйте фильтр на стенде LAF. Хранить раствор при температуре 4 °C.

2. Подготовка композитного материала SHAPE

1. Генерация альгинатных микрочастиц
   1. Приготовьте 2 мг/мл раствора CaCO₃ в сверхчистой воде в стерильном стакане. Смешайте его 1:1 с раствором альгината и помешивайте в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью магнитной мешалки.
   2. Добавьте уксусную кислоту в соотношении 1:500 и оставьте помешивать на ночь при 650 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альгинатный раствор немедленно начнет желировать. Обязательно используйте перемешивающий магнит той же длины, что и диаметр используемой стеклянной посуды, чтобы обеспечить оптимальное однородное перемешивание формовочного геля. На следующий день раствор, образующийся при перемешивании во время гелеобразования, будет казаться вязким (рис. 2А).
   3. Механически фрагментируют гелеобразный раствор альгината на микрочастицы, гомогенизируя его при 15 000 об/мин в течение 10 мин с помощью гомогенизатора, помещенного в стенд LAF (рис. 2B).
   4. Центрифугируют микрочастицы при 18 500 × г в течение 20 мин (рис. 2С) при комнатной температуре.
   5. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость внутри стенда LAF, ресуспендируйте частицы в DMEM, содержащие 2 мМ NaOH и 1% P/S, и инкубируйте в течение ночи при 4 ° C (рис. 2D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет подвески должен вернуться к красному. Если суспензия остается желтой, добавьте NaOH по каплям и перемешивайте, пока она не станет красной (рис. 2E).
   6. Гомогенизируют частицы при 15 000 об/мин в течение 3 мин и центрифугу при 18 500 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
   7. Понаблюдайте за гранулой (рис. 2F) и осторожно удалите надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы плотно упакованных альгинатных микрочастиц можно хранить при температуре 4 °C до дальнейшего использования. Если раствор альгината не был стерилизован фильтром, микрочастицы должны быть израсходованы в течение 1 недели.
2. Композитная формула SHAPE
   1. За день до печати ресуспендируют гранулы альгинатных микрочастиц в удвоенном объеме питательной среды, содержащей 4% HEPES (1 М запас) и 4% раствор NaHCO₃ на стенде LAF, и инкубируют его в течение ночи при комнатной температуре.
   2. Центрифугируют микрогелевую суспензию при дозе 18 500 × г в течение 10 мин при комнатной температуре и удаляют надосадочную жидкость.
   3. Нейтрализуйте коллаген, который будет смешан с альгинатными микрочастицами на стенде LAF. Разбавьте исходный раствор коллагена до конечной концентрации 1 мг / мл и нейтрализуйте его, добавив 4% HEPES и 4% NaHCO₃. Например, для 3 мл композита SHAPE смешайте 2 мл альгинатных микрочастиц с 1 мл нейтрализованного коллагена (0,12 мл HEPES, 0,12 мл NaHCO₃, 0,16 мл питательной среды и 0,6 мл коллагена).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, смешиваемые с коллагеном, необходимо обрабатывать на льду, чтобы избежать полимеризации коллагена. Как только коллаген будет нейтрализован, полимеризация начнет медленно.
   4. Создайте композит SHAPE, смешав гранулы альгинатных микрочастиц с разбавленным и нейтрализованным коллагеном в соотношении 2:1. Тщательно перемешайте гель, медленно пипетируя вверх и вниз по льду на скамье LAF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихревните, так как это приведет к появлению пузырьков в опорном материале.
   5. На стенде LAF перенесите полученный композитный материал в охлажденную пластину с микролунками или любой подходящий контейнер для печати и используйте в течение 30 минут (рис. 3E, F).

3. Приготовление культуры hNSC и биочернил

1. Культивируйте клетки в колбе T75, покрытой экстрактом базальной мембраны, в питательной среде. Пройдите клетки не менее двух раз после оттаивания, прежде чем использовать их для эксперимента с 3D-печатью.
2. Перед печатью диссоциируют клетки ферментативно, используя 0,025% раствор трипсина в течение 5 мин при 37 ° C, нейтрализуют трипсин питательной средой и центрифугируют клеточную суспензию при 400 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. После центрифугирования аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 2-3 мл питательной среды.
3. Проведите подсчет клеток, центрифугируйте клетки при 400 × г и ресуспендируйте гранулу в питательной среде с добавлением 0,1% ксантановой камеди (для предотвращения осаждения клеток) в конечной концентрации 9 × 10⁶ клеток / мл.
4. Используйте тупую металлическую иглу 21 G, чтобы загрузить 100 мкл плотно упакованных альгинатных микрочастиц в шприц (рис. 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Создание пробки с альгинатными микрочастицами служит двум целям: оно помогает поддерживать стабильность экструзии во время печати и позволяет полностью выдавливать загруженные клеточные чернила (без мертвого объема).
5. Используя ту же иглу, загрузите подготовленную клеточную суспензию в шприц (рис. 3Б).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха во время загрузки шприца. Пузырьки воздуха вызывают нестабильность во время печати.
6. Замените загрузочную иглу тупой металлической иглой 27 G, которая будет использоваться для печати (рис. 3C).

4. Встроенная 3D-печать

1. Разработайте структуру для печати с помощью указанного программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что начальная высота печатной структуры находится в пределах глубины композитной опоры SHAPE. Предложения по проектированию можно найти на рисунке 4А (спиральные и поленницы).
2. Сгенерируйте G-код, нажав « Создать».
3. Вставьте стеклянный шприц с ячейками в объемную экструзионную головку на экструзионном биопринтере (рис. 3D).
4. Измерьте длину иглы стеклянного шприца с ячейками, нажав « Измерение длины иглы».
5. Поместите пластину или контейнер с микролунками, загруженный композитом SHAPE, на принтер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите ячеистую пластину или контейнер при температуре 4 °C до печати, чтобы предотвратить преждевременное сшивание опоры.
6. Измерьте высоту поверхности пустой лунки в той же пластине или контейнере с микролунками, в который загружен гель SHAPE, нажав на SHM (измерение высоты поверхности).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно определить высоту поверхности вручную, измерив высоту скважины иглой.
7. Установите скорость экструзии 3,6 мкл / мин и скорость подачи 0,3 мм / с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно проверьте экструзию перед печатью. Осаждение клеток может вызвать засорение сопла, и его можно избежать, предварительно выдавив небольшой объем перед фактической встроенной печатью или добавив объем втягивания в объемный шприц. В некоторых случаях скорость подачи должна быть ниже 0,5 мм/с , когда игла вставляется в гель SHAPE или выходит из него, чтобы избежать перетаскивания чернил.
8. Загрузите G-код в пользовательский интерфейс принтера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Новый G-код необходимо генерировать каждый раз, когда в проектируемую структуру вносятся изменения.
9. Инициируйте процедуру печати, нажав кнопку «Выполнить» (рисунок 3G).
10. Сразу после печати поместите гель SHAPE при температуре 37 °C в инкубатор клеточных культур на 30 минут для отжига.
11. Аккуратно добавьте питательную среду поверх отожженной гелевой подложки SHAPE.
12. На следующий день замените питательную среду дифференцировочной средой, составленной следующим образом: DMEM/F12 с L-аланил-L-глутаминовым дипептидом с 30 мМ глюкозы, 5 мкМ HEPES, 0,5% по массе и объему богатого липидами бычьего сывороточного альбумина, 40 мкМ L-аланина, 40 мкМ L-аспарагина моногидрата, 40 мкМ L-аспарагиновой кислоты, 40 мкМ L-глутаминовой кислоты, 40 мкМ L-пролина, 1% добавки N2, 1% пенициллин-стрептомицина, 100 мкМ дибутирилциклического аденозинмонофосфата (дибутирил-цАМФ), и нейротрофический фактор (GDNF), полученный из линии глиальных клеток (GDNF) 2 нг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не повредить гидрогель во время смены среды. Наклоните тарелку и аккуратно удалите старую среду. Добавляйте свежую среду по каплям к стенке лунки, содержащей гель, а не непосредственно поверх геля. Не используйте аспиратор для удаления среды.
13. Обновляйте дифференцирующую среду каждые 2 дня до экспериментальной конечной точки.

5. Флуоресцентная визуализация живых клеток

1. Удалите излишки среды из геля.
2. Добавьте равный объем 20 мкМ кальцеина АМ (разбавленный в дифференцировочной среде из исходного раствора) к объему поддерживающего геля.
3. Выдерживать 40 мин при 37 °C.
4. Удалите раствор Calcein AM и добавьте соответствующий объем свежей среды для дифференциации.
5. Перенесите пластину в микроскоп для визуализации.

6. Иммуноцитохимия

1. Удалите излишки среды из геля.
2. С помощью небольшого шпателя переложите гель в большую емкость с DPBS.
3. Промойте три раза в течение 20 минут каждый раз с помощью DPBS и перенесите пластину в вытяжной шкаф.
4. Удалите DPBS, добавьте достаточное количество 4% раствора формальдегида, чтобы покрыть гель, и выдерживайте в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Трижды мойте DPBS по 20 минут каждый раз.
6. Приготовьте блокирующий раствор, состоящий из 5% ослиной сыворотки, 0,25% моющего средства и 0,02% азида натрия в DPBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте в три раза больше объема, необходимого для покрытия геля; Позже он будет использоваться в качестве основы для первичных и вторичных растворов антител.
7. После промывки DPBS добавьте блокирующий раствор в гель и выдержите в течение 6 ч при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. Аккуратно покачайте тарелку.
8. Приготовьте раствор первичного антитела, разбавив антитело TUBB3 в блокирующем растворе в соотношении 1:1,000.
9. Удалите блокирующий раствор из геля, добавьте раствор первичного антитела и инкубируйте в течение 48 ч при 4 ° C. Аккуратно покачайте тарелку.
10. Трижды мойте DPBS по 20 минут каждый раз.
11. Готовят раствор вторичного антитела, разбавляя 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, 1:1000) и вторичное антитело (1:200) в блокирующем растворе.
12. После промывки DPBS гель инкубировать в растворе вторичных антител в течение 24 ч при 4 °C. Аккуратно покачайте тарелку.
13. Вымойте три раза DPBS в течение 20 минут каждый раз и храните при температуре 4 ° C до получения изображения.
14. Перед визуализацией перенесите окрашенный гель шпателем в посуду или хорошо тарелку с тонким визуальным дном.

Результаты

Получение альгинатного микрогеля путем разжижения сдвигом во время внутреннего гелеобразования с последующей механической фрагментацией дает альгинатные микрогели, которые являются полидисперсными по размеру и чешуйчатой форме, как показано на рисунке 2G. Разме...

Обсуждение

Подход к композитным материалам SHAPE обеспечивает универсальный путь для создания отжигаемых и биофункциональных опорных ванн для встроенной 3D-печати ячеистых чернил. Хотя этот протокол представляет собой пример 3D-печати нейронных конструкций, набор инструментов SHAPE может быть легко ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253