תמיכה מרוכבת במטריצה חוץ-תאית מיקרוג'ל להדפסה תלת-ממדית משובצת של מבנים עצביים אנושיים

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקול להדפסה תלת-ממדית משובצת בצורה חופשית של תאי גזע עצביים בתוך חומרים מרוכבים של חלקיקים חוץ-תאיים הניתנים לריפוי עצמי. הפרוטוקול מאפשר דפוסים ניתנים לתכנות של מבנים מחוברים של רקמות עצביות אנושיות עם נאמנות גבוהה.

Abstract

ההדפסה התלת-ממדית המשובצת של תאים בתוך מדיום תמיכה גרעיני התפתחה בעשור האחרון כגישה רבת עוצמה לייצור ביולוגי חופשי של מבנים של רקמות רכות. עם זאת, פורמולציות ג'ל גרגירי הוגבלו למספר מוגבל של ביו-חומרים המאפשרים ייצור חסכוני של כמויות גדולות של מיקרו-חלקיקי הידרוג'ל. לכן, אמצעי תמיכה בג'ל גרגירי חסרים בדרך כלל את הפונקציות של הדבקת תאים והנחיית תאים הנמצאות במטריצה החוץ תאית הטבעית (ECM).

כדי להתמודד עם זה, פותחה מתודולוגיה ליצירת חומרים מרוכבים של מטריצה חוץ-תאית (SHAPE) הניתנת לריפוי עצמי. חומרים מרוכבים מסוג SHAPE מורכבים משלב גרגירי (מיקרו-ג'לים) ופאזה רציפה (תמיסת ECM צמיגה) אשר יחדיו מאפשרים הן הדפסה באיכות גבוהה הניתנת לתכנות והן סביבה חוץ-תאית ביו-פונקציונלית מתכווננת. עבודה זו מתארת כיצד ניתן להשתמש במתודולוגיה שפותחה לייצור ביולוגי מדויק של מבנים עצביים אנושיים.

ראשית, מיקרו-חלקיקי אלגינט, המשמשים כמרכיב גרעיני בתרכובות SHAPE, מיוצרים ומשולבים עם רכיב רציף מבוסס קולגן. לאחר מכן, תאי גזע עצביים אנושיים מודפסים בתוך חומר התמיכה, ולאחר מכן חישול התמיכה. המבנים המודפסים יכולים להישמר במשך שבועות כדי לאפשר התמיינות של התאים המודפסים לנוירונים. במקביל, הפאזה הרציפה של הקולגן מאפשרת צמיחה אקסונלית וחיבור בין אזורים. לבסוף, עבודה זו מספקת מידע על אופן ביצוע הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים ואימונוציטוכימיה כדי לאפיין את המבנים העצביים האנושיים המודפסים בתלת-ממד.

Introduction

ההדפסה התלת-ממדית המדויקת והניתנת לתכנות של מבני הידרוג'ל עמוסי תאים המחקים רקמות רכות במבחנה מהווה אתגר גדול. לדוגמה, ניסיונות המבוססים על אקסטרוזיה ישירה של הידרוג'לים רכים הם בעייתיים מטבעם, שכן התכונות המכניות הירודות הנדרשות כדי לשחזר את המיקרו-סביבה in vivo מובילות לחוסר שלמות מבנית, עיוותים של התכונות שהוגדרו מראש, או קריסה מוחלטת של המבנים המיוצרים. דרך מקובלת לעקיפת בעיה זו היא הדפסת פיגום תומך מחומר קשיח יותר בעל תאימות ביולוגית המאפשר למבנה הסופי לשמור על צורתו. עם זאת, גישה זו מגבילה מאוד את אפשרויות העיצוב ודורשת כוונון ראולוגי זהיר של הדיו הסמוך.

כדי להתגבר על מגבלות ההדפסה התלת-ממדית המסורתית המבוססת על שחול שכבה אחר שכבה, הדפסה תלת-ממדית משובצת התפתחה בשנים האחרונות כחלופה רבת עוצמה לייצור חומרים רכים ורקמות 1,2,3,4,5,6. במקום להוציא את הדיו באוויר הסביבה על גבי משטח, הדיו מושקע ישירות דרך מחט מזרק בתוך אמבט תמיכה שהוא מוצק במנוחה אך נוזל באופן הפיך סביב קצה המחט הנעה כדי לאפשר שיקוע מדויק של חומר רך עמוס תאים. החומר המושקע נשמר במקומו כאשר התמיכה מתמצקת מחדש בעקבות המחט. ככזו, הדפסה תלת-ממדית משובצת מאפשרת ייצור חופשי ברזולוציה גבוהה של מבנים מורכבים מביו-חומרים רכים עם אפשרויות עיצוב מורחבות ^7,8.

ג'לים גרגיריים נחקרו בהרחבה כחומרי אמבט תומכים להדפסה תלת-ממדית משובצת, מכיוון שניתן ליצור אותם כך שיציגו מעברים חלקים, מקומיים והפיכים ממוצק לנוזל בלחצי תפוקה נמוכים 9,10,11. בעוד שהם מראים תכונות ראולוגיות מצוינות להדפסה ברזולוציה גבוהה, ג'לים גרעיניים הוגבלו לקומץ ביו-חומרים¹². חוסר הגיוון בפורמולציות ג'ל גרגיריות, אשר בולט במיוחד אם לוקחים בחשבון את המגוון הרחב של ביו-חומרים הזמינים עבור פורמולציות הידרוג'ל בתפזורת, נגרם על ידי הצורך בייצור חסכוני של מספר רב של מיקרוג'לים באמצעות כימיה פשוטה. בשל הנוף הביו-חומרי המוגבל של תמיכות ג'ל גרגיריות, הכוונון של המיקרו-סביבה החוץ תאית המסופקת על ידי תמיכת ההדפסה מהווה אתגר בשטח.

לאחרונה פותחה גישה מודולרית ליצירת תמיכות הדפסה תלת-ממדיות משובצות, המכונות קומפוזיציות מרוכבות של חלקיקים חוץ-תאיים (SHAPE)¹³ הניתנות לריפוי עצמי. גישה זו משלבת את התכונות הריאולוגיות המובהקות של ג'לים גרגיריים עם הרבגוניות הביו-פונקציונלית של פורמולציות הידרוג'ל בתפזורת. התמיכה המרוכבת המוצגת ב- SHAPE מורכבת ממיקרו-חלקיקי אלגינט ארוזים (פאזה גרגירית, ~ 70% חלק נפח) עם חלל אינטרסטיציאלי מוגבר המלא בתמיסת פרגל ECM צמיגה מבוססת קולגן (פאזה רציפה, ~ 30% חלק נפח). עוד הוכח כי תמיכת SHAPE מאפשרת שיקוע ברזולוציה גבוהה של תאי גזע עצביים אנושיים (hNSCs), אשר לאחר חישול אמבט התמיכה, ניתן להתמיין לנוירונים ולשמור עליהם במשך שבועות כדי להגיע להבשלה תפקודית. הדפסה תלת-ממדית מוטבעת בתוך אמבט התמיכה של SHAPE מתגברת על כמה מהמגבלות העיקריות הקשורות לטכניקות קונבנציונליות לייצור ביולוגי של רקמות עצביות תוך מתן פלטפורמה רב-תכליתית.

עבודה זו מפרטת את השלבים להדפסה תלת-ממדית מוטמעת של תאי עצב עצביים בתוך תמיכת SHAPE ואת ההתמיינות שלהם לאחר מכן לתאי עצב פונקציונליים (איור 1). ראשית, מיקרו-חלקיקי אלגינט נוצרים באמצעות גזירה במהלך ג'לציה פנימית. גישה זו מאפשרת יצירה קלה של כמויות גדולות של מיקרו-חלקיקים ללא צורך בציוד מיוחד וריאגנטים ציטוטוקסיים. יתר על כן, אלגינט הוא מקור חומר זמין וחסכוני ליצירת מצעי הידרוג'ל תואמים ביולוגית למגוון רחב של סוגי תאים. חלקיקי האלגינט הנוצרים משולבים עם תמיסת קולגן ליצירת חומר התמיכה המרוכב SHAPE. לאחר מכן, ה-hNSCs נקצרים ומועלים לתוך מזרק כביו-דיו תאי להדפסה תלת-ממדית. מדפסת ביולוגית תלת-ממדית משמשת להדפסה משובצת מבוססת שחול של hNSCs בתוך הקומפוזיט SHAPE. התאים המודפסים בתלת-ממד מתמיינים לתאי עצב כדי ליצור מבנים עצביים אנושיים מוגדרים מרחבית ומתפקדים. לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד ניתן לאפיין את מבני הרקמה שנוצרו באמצעות דימות תאים חיים ואימונוציטוכימיה. בנוסף, ניתנים טיפים לאופטימיזציה ולפתרון בעיות. יש לציין כי ניתן להחליף הן את המרכיבים של השלב הגרעיני והן את השלב הרציף עם פורמולציות הידרוג'ל אחרות כדי להתאים למויאטים ביו-פונקציונליים שונים, תכונות מכניות ומנגנוני הצלבה, כפי שנדרש על ידי סוגי תאים ורקמות אחרים מעבר ליישומים עצביים.

Protocol

1. הכנת המאגרים והריאגנטים

1. הכן מדיום גידול תאים על ידי הוספת התוספים הבאים DMEM/F12 עם L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד: 30 mM גלוקוז, 5 מיקרומטר HEPES, 0.5% w / v עשיר שומנים בסרום בקר אלבומין, 40 מיקרומטר L-אלנין, 40 מיקרומטר L-אספרגין מונוהידרט, 40 מיקרומטר L-חומצה אספרטית, 40 מיקרומטר L-חומצה גלוטמית, 40 מיקרומטר L-פרולין, 1% תוסף N2, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 20 ng / L כל אחד של גורם גדילה אפידרמיס (EGF) וגורם גדילה פיברובלסט (FGF). בצע שלבים אלה בספסל זרימת אוויר למינרית (LAF).
2. הכינו תמיסת אלגינט 1% עם V במים טהורים במיוחד על ידי ערבוב נמרץ במשך 4 שעות ב-60°C. סנן סטרילי את תמיסת האלגינט המומס והחמה עם מסנן בגודל נקבוביות של 0.45 מיקרומטר בספסל LAF. אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: אם הטמפרטורה של תמיסת אלגינט נמוכה מ-60°C, לא ניתן יהיה להעביר אותה דרך המסנן.
3. הכינו תמיסת NaHCO₃ בנפח 37 גרם/ליטר במים טהורים במיוחד. התאימו את רמת החומציות של התמיסה ל-9.5 באמצעות NaOH, ובצעו סינון ועיקרו בספסל LAF. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.

2. הכנת חומר מרוכב SHAPE

1. יצירת מיקרו-חלקיקים אלגינט
   1. הכינו תמיסת CaCO₃ במינון 2 מ"ג/מ"ל במים טהורים במיוחד בכד סטרילי. ערבבו 1:1 עם תמיסת אלגינט, וערבבו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות מערבל מגנטי.
   2. מוסיפים חומצה אצטית ביחס של 1:500, ומשאירים ערבוב למשך הלילה ב-650 סל"ד.
      הערה: תמיסת האלגינט תתחיל לפעול באופן מיידי. הקפידו להשתמש במגנט ערבוב באורך זהה לקוטר כלי הזכוכית המשמש להבטחת ערבוב אופטימלי והומוגני של ג'ל היצירה. למחרת, התמיסה שנוצרת באמצעות ערבוב במהלך הג'לציה תיראה צמיגה (איור 2A).
   3. שברו באופן מכני את תמיסת האלגינט הג'לי למיקרו-חלקיקים על-ידי הומוגניזציה שלה במהירות של 15,000 סל"ד למשך 10 דקות באמצעות הומוגנייזר הממוקם בספסל LAF (איור 2B).
   4. צנטריפוגה של המיקרו-חלקיקים ב-18,500 × גרם למשך 20 דקות (איור 2C) בטמפרטורת החדר.
   5. השליכו בזהירות את הסופרנאטנט בתוך ספסל ה-LAF, השהו מחדש את החלקיקים ב-DMEM המכילים 2 מילימטר NaOH ו-1% P/S, ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 2D).
      הערה: צבע המתלים צריך לחזור לאדום. אם המתלה נשאר צהוב, הוסיפו NaOH טיפה וערבבו עד שהוא הופך לאדום (איור 2E).
   6. הומוגניזציה של החלקיקים ב-15,000 סל"ד למשך 3 דקות, וצנטריפוגה ב-18,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. התבוננו בגלולה (איור 2F), והוציאו את הסופרנאטנט בזהירות.
      הערה: ניתן לאחסן את הגלולה של מיקרו-חלקיקי אלגינט ארוזים היטב בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף. אם תמיסת האלגינט לא עברה עיקור סינון, יש להשתמש במיקרו-חלקיקים תוך שבוע.
2. ניסוח מורכב של SHAPE
   1. יום לפני ההדפסה, יש להשהות מחדש את כדורית המיקרו-חלקיק אלגינט בנפח כפול מזה של מדיום גידול המכיל 4% HEPES (1 M Stock) ו-4% תמיסת NaHCO₃ בספסל LAF, ולדגור עליה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
   2. צנטריפוגו את מתלה המיקרוג'ל ב-18,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט.
   3. נטרלו את הקולגן כדי לערבב אותו עם חלקיקי האלגינט בספסל LAF. דללו את תמיסת מלאי הקולגן כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל, ונטרלו אותה על ידי הוספת 4% HEPES ו-4% NaHCO₃. לדוגמה, עבור 3 מ"ל של SHAPE מרוכב, ערבבו 2 מ"ל של מיקרו-חלקיקי אלגינט עם 1 מ"ל של קולגן מנוטרל (0.12 מ"ל HEPES, 0.12 מ"ל של NaHCO₃, 0.16 מ"ל של מדיום צמיחה ו-0.6 מ"ל קולגן).
      הערה: כל החומרים המעורבבים עם קולגן צריכים להיות מטופלים על קרח כדי למנוע פילמור קולגן. ברגע שהקולגן מנוטרל, פילמור יתחיל לאט.
   4. צור את SHAPE מרוכב על ידי ערבוב כדורית מיקרו-חלקיק אלגינט עם קולגן מדולל ומנוטרל ביחס של 2:1. מערבבים היטב את הג'ל על ידי פיפטוף איטי למעלה ולמטה על קרח בספסל LAF.
      הערה: אין לערבל, מכיוון שפעולה זו תכניס בועות לחומר התמיכה.
   5. בספסל LAF, העבירו את החומר המרוכב שנוצר ללוח מיקרווול מקורר או לכל מיכל הדפסה מתאים, והשתמשו תוך 30 דקות (איור 3E, F).

3. תרבית hNSC והכנת דיו ביולוגי

1. תרבית את התאים בבקבוק T75 מצופה בתמצית קרום מרתף במצע גידול. עברו את התאים לפחות פעמיים לאחר ההפשרה לפני שתשתמשו בהם לניסוי הדפסה תלת-ממדית.
2. לפני ההדפסה, נתק את התאים באופן אנזימטי באמצעות תמיסת טריפסין 0.025% למשך 5 דקות ב-37°C, נטרל את הטריפסין עם מדיום גידול, וצנטריפוגה את תרחיף התא ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, שואפים את הסופרנטנט, ותולים מחדש את הגלולה ב 2-3 מ"ל של מדיום צמיחה.
3. בצע ספירת תאים, בצע צנטריפוגה של התאים ב 400 × גרם, והשהה מחדש את הגלולה במדיום צמיחה בתוספת 0.1% קסנטן גאם (כדי למנוע מהתאים לשקוע) בריכוז סופי של 9 × 10⁶ תאים / מ"ל.
4. השתמשו במחט מתכת קהה של 21 G כדי לטעון 100 מיקרו-ליטר של מיקרו-חלקיקי אלגינט דחוסים היטב לתוך מזרק (איור 3A).
   הערה: יצירת תקע עם מיקרו-חלקיקי אלגינט משרתת שתי מטרות: היא מסייעת בשמירה על יציבות האקסטרוזיה במהלך ההדפסה ומאפשרת אקסטרוזיה מלאה של הדיו הסלולרי הטעון (ללא נפח מת).
5. באמצעות אותה מחט, טענו את תרחיף התאים המוכן לתוך המזרק (איור 3B).
   הערה: יש להיזהר במיוחד שלא להכניס בועות אוויר במהלך שלבי העמסת המזרק. בועות אוויר יגרמו לאי יציבות במהלך ההדפסה.
6. החלף את מחט ההעמסה במחט מתכת קהה 27 G, שתשמש להדפסה (איור 3C).

4. הדפסה תלת-ממדית מוטבעת

1. עצב מבנה להדפסה באמצעות התוכנה שאליה מתבצעת הפניה (ראה טבלת חומרים).
   הערה: הקפד להתאים את הגובה ההתחלתי של המבנה המודפס לעומק התמיכה ב- SHAPE composite. הצעות עיצוב ניתן למצוא באיור 4A (עיצובים של ספירלות וערימות עץ).
2. צור G-Code על ידי לחיצה על צור.
3. הכניסו את מזרק הזכוכית עמוס התאים לראש אקסטרוזיה נפחי במדפסת ביולוגית מבוססת שחול (איור 3D).
4. מדוד את אורך המחט של מזרק הזכוכית עמוס התאים על ידי לחיצה על מדידת אורך מחט.
5. הניחו את צלחת המיקרווול או את המכל הטעון בקומפוזיט SHAPE על גבי המדפסת.
   הערה: שמור על לוח התא או המכל בטמפרטורה של 4°C עד להדפסה כדי למנוע הצלבה מוקדמת מדי של התמיכה.
6. מדוד את גובה פני השטח של באר ריקה בתוך אותה צלחת מיקרווול או מיכל שבו ג'ל SHAPE נטען על ידי לחיצה על SHM (מדידת גובה פני השטח).
   הערה: לחלופין, קבע את גובה פני השטח באופן ידני על ידי מדידת גובה הבאר באמצעות המחט.
7. הגדר את קצב האקסטרוזיה ל- 3.6 מיקרוליטר לדקה ואת קצב ההזנה ל- 0.3 מ"מ לשנייה.
   הערה: הקפד לבדוק את האקסטרוזיה לפני ההדפסה. שקיעת תאים עלולה לגרום לסתימת חרירים וניתן להימנע ממנה על ידי הבלעה מראש של נפח קטן לפני ההדפסה המוטבעת בפועל או על ידי הוספת נפח משיכה למזרק הנפחי. במקרים מסוימים, קצב ההזנה צריך להישמר מתחת ל-0.5 מ"מ לשנייה כאשר המחט מוחדרת לג'ל SHAPE או יוצאת ממנו כדי למנוע גרירת הדיו.
8. טען את ה- G-Code לממשק המשתמש של המדפסת.
   הערה: יש ליצור G-Code חדש בכל פעם שמתבצעים שינויים במבנה המעוצב.
9. התחל את הליך ההדפסה על-ידי לחיצה על הפעל (איור 3G).
10. מיד לאחר ההדפסה, הניחו את ג'ל SHAPE בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של תרבית תאים למשך 30 דקות לחישול.
11. יש להוסיף את מדיום הצמיחה בעדינות על גבי תמיכת הג'ל SHAPE המחושלת.
12. למחרת, החלף את מדיום הגידול במדיום התמיינות שנוסח כדלקמן: DMEM/F12 עם L-אלניל-L-גלוטמין דיפפטיד עם 30 mM גלוקוז, 5 μM HEPES, 0.5% עם אלבומין סרום בקר עשיר בשומנים, 40 מיקרומטר L-אלנין, 40 מיקרומטר L-אספרגין מונוהידרט, 40 מיקרומטר L-חומצה אספרטית, 40 מיקרומטר L-חומצה גלוטמית, 40 מיקרומטר L-פרולין, 1% תוסף N2, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 100 מיקרומטר דיבוטיריל-מחזורי אדנוזין מונופוספט (dibutyryl-cAMP), ו-2 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי נגזר מקו תאי גליה (GDNF).
    הערה: יש להקפיד לא לפגוע בהידרוג'ל במהלך השינויים הבינוניים. מטים את הצלחת ומסירים את המדיום הישן בעדינות. יש להוסיף טיפה בינונית טרייה לדופן הבאר המכילה את הג'ל ולא ישירות על גבי הג'ל. אין להשתמש בשואב כדי להסיר את המדיום.
13. רענן את מדיום הבידול כל יומיים עד לנקודת הסיום של הניסוי.

5. הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים

1. הסר את עודפי המדיום מהג'ל.
2. הוסף נפח שווה של 20 מיקרומטר Calcein AM (מדולל בתווך בידול מתמיסת המלאי) לנפח ג'ל התמיכה.
3. יש לדגור במשך 40 דקות בטמפרטורה של 37°C.
4. הסר את תמיסת Calcein AM והוסף נפח מתאים של אמצעי בידול טרי.
5. העבירו את הצלחת למיקרוסקופ לצורך הדמיה.

6. אימונוציטוכימיה

1. הסר את המדיום העודף מהג'ל.
2. בעזרת מרית קטנה, מעבירים את הג'ל למיכל גדול יותר המכיל DPBS.
3. שטפו שלוש פעמים במשך 20 דקות בכל פעם עם DPBS, והעבירו את הצלחת למכסה אדים.
4. הסר את DPBS, הוסף מספיק תמיסת פורמלדהיד 4% כדי לכסות את הג'ל, ודגר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
5. שטפו שלוש פעמים עם DPBS במשך 20 דקות בכל פעם.
6. הכינו תמיסת חסימה המורכבת מסרום 5% חמור, 0.25% חומר ניקוי ו-0.02% נתרן אזיד ב-DPBS.
   הערה: הכינו פי שלושה מהנפח הדרוש לכיסוי הג'ל; הוא ישמש בהמשך כבסיס לפתרונות הנוגדנים הראשוניים והמשניים.
7. לאחר שטיפה עם DPBS, להוסיף את הפתרון החוסם לג'ל, ולדגור במשך 6 שעות בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית. רוק את הצלחת בעדינות.
8. הכינו את תמיסת הנוגדנים הראשונית על ידי דילול נוגדן TUBB3 בתמיסת חסימה ביחס של 1:1,000.
9. הסר את התמיסה החוסמת מהג'ל, הוסף את תמיסת הנוגדנים העיקרית ודגר במשך 48 שעות ב -4 מעלות צלזיוס. רוק את הצלחת בעדינות.
10. שטפו שלוש פעמים עם DPBS במשך 20 דקות בכל פעם.
11. הכן את תמיסת הנוגדנים המשנית על ידי דילול 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000) ואת הנוגדן המשני (1:200) בתמיסת חסימה.
12. לאחר שטיפה עם DPBS, לדגור את הג'ל בתמיסת נוגדנים משנית במשך 24 שעות ב 4 ° C. רוק את הצלחת בעדינות.
13. יש לשטוף שלוש פעמים עם DPBS במשך 20 דקות בכל פעם, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה.
14. לפני ההדמיה, להעביר את הג'ל המוכתם עם מרית לצלחת או צלחת היטב עם תחתית הדמיה דקה.

תוצאות

הכנת מיקרו-ג'ל אלגינט באמצעות דילול גזירה במהלך ג'לציה פנימית ואחריה פיצול מכני מניבה מיקרו-ג'לים אלגינטים מפוזרים בגודלם ודמויי פתיתים בצורתם, כפי שניתן לראות באיור 2G. גודלם של חלקיקים בלתי סדירים אלה נע בין פחות ממיקרומטר אחד לקוטר של כ-40 מיקרומטר. כאשר הם ארוזים היט?...

Discussion

גישת החומר המרוכב SHAPE מספקת מסלול רב-תכליתי ליצירת אמבטיות תמיכה חיישות וביו-פונקציונאליות להדפסה תלת-ממדית מוטבעת של דיו סלולרי. בעוד פרוטוקול זה מספק דוגמה להדפסה תלת-ממדית של מבנים עצביים, ארגז הכלים של SHAPE יכול בקלות להיות מותאם לייצור ביולוגי עם מקורות תאים אחרים לצורך הנדסה מדויקת ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253