인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

요약

이 연구는 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질 복합체 내부의 신경 줄기 세포의 자유형 임베디드 3D 프린팅을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 높은 충실도로 상호 연결된 인간 신경 조직 구조의 프로그래밍 가능한 패터닝을 가능하게 합니다.

초록

과립 지지 배지 내부에 세포를 내장한 3D 프린팅은 지난 10년 동안 연조직 구조의 자유형 생체 제조를 위한 강력한 접근 방식으로 등장했습니다. 그러나, 과립형 겔 제형은 다량의 하이드로겔 미세입자의 비용 효율적인 생성을 가능하게 하는 제한된 수의 바이오 물질로 제한되어 왔다. 따라서 과립형 겔 지지 배지는 일반적으로 천연 세포외 기질(ECM)에서 발견되는 세포 접착 및 세포 지시 기능이 부족합니다.

이를 해결하기 위해 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질(SHAPE) 복합체를 생성하기 위한 방법론이 개발되었습니다. SHAPE 복합재는 과립상(마이크로겔)과 연속상(점성 ECM 용액)으로 구성되며, 이를 통해 프로그래밍 가능한 고화질 인쇄와 조정 가능한 생체 기능성 세포외 환경을 모두 허용합니다. 이 연구는 개발된 방법론이 인간 신경 구조의 정확한 생체 제작에 어떻게 활용될 수 있는지 설명합니다.

먼저, SHAPE 복합체에서 입상 성분 역할을 하는 알지네이트 미세입자를 제조하여 콜라겐 기반의 연속 성분과 결합합니다. 그런 다음 인간 신경 줄기 세포를 지지체 내부에 인쇄한 다음 지지체를 어닐링합니다. 인쇄된 구축물은 인쇄된 세포가 뉴런으로 분화될 수 있도록 수주 동안 유지될 수 있다. 동시에, 콜라겐 연속기는 축삭 성장과 영역의 상호 연결을 허용합니다. 마지막으로, 이 연구는 3D 프린팅된 인간 신경 구조를 특성화하기 위해 생세포 형광 이미징 및 면역세포화학을 수행하는 방법에 대한 정보를 제공합니다.

서문

시험관 내에서 연조직을 모방하는 세포 함유 하이드로겔 구조의 정밀하고 프로그래밍 가능한 3D 프린팅은 큰 도전 과제입니다. 예를 들어, 연질 하이드로겔의 직접 압출을 기반으로 한 시도는 생체 내 미세 환경을 재현하는 데 필요한 열악한 기계적 특성으로 인해 구조적 무결성이 부족하거나 사전 정의된 특징이 변형되거나 제작된 구조가 완전히 붕괴되기 때문에 본질적으로 문제가 있습니다. 이 문제에 대한 기존의 해결 방법은 최종 구조가 모양을 유지할 수 있도록 더 단단한 생체 적합성 재료로 지지 스캐폴드를 인쇄하는 것입니다. 그러나 이 접근 방식은 설계 가능성을 크게 제한하고 인접 잉크의 신중한 유변학적 미세 조정이 필요합니다.

전통적인 층별 압출 기반 3D 프린팅의 한계를 극복하기 위해 임베디드 3D 프린팅은 최근 몇 년 동안 연질 재료 및 조직 제작의 강력한 대안으로 등장했습니다 1,2,3,4,5,6.

프로토콜

1. 완충액 및 시약의 제조

1. 30mM 포도당, 5μM HEPES, 0.5% w/v 지질이 풍부한 소 혈청 알부민, 40μM L-알라닌, 40μM L-아스파라긴 일수화물, 40μM L-아스파라긴산, 40μM L-글루탐산, 40μM L-프롤린, 1% N2 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 표피 성장 인자(EGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 각각 20ng/L. LAF(층류 공기 흐름) 벤치에서 다음 단계를 수행합니다.
2. 60°C에서 4시간 동안 격렬하게 교반하여 초순수에 1% w/v 알긴산염 용액을 준비합니다. LAF 벤치에서 0.45μm 기공 크기 필터로 용해된 고온 알지네이트 용액을 멸균 필터합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   알림: 알긴산 용액의 온도가 60°C 미만이면 필터를 통과할 수 없습니다.
3. 초순수에서 37g/L NaHCO₃ 용액을 준비합니다. NaOH를 사용하여 용액의 pH를 9.5로 조정하고 LAF 벤치에서 필터 멸균합니다. 용액을 4°C에서 보관한다.

2. SHAPE 복합 재료 준비

1. 알지네이트 미립자 생성
   1. 멸균 비커의 초순수에 2mg/mL<....

결과

내부 겔화 동안 전단 박화를 통한 알지네이트 마이크로겔 제조에 이어 기계적 단편화는 그림 2G에서 볼 수 있듯이 크기가 다분산되고 플레이크와 같은 모양을 갖는 알지네이트 마이크로겔을 생성합니다. 이러한 불규칙한 입자의 크기는 직경이 1μm 미만에서 약 40μm입니다. 촘촘하게 포장된 미세 입자는 해당 세포 배양 배지보다 약간 더 불투명한 투명한 벌크 물질을 ?.......

토론

SHAPE 복합 재료 접근 방식은 셀룰러 잉크의 임베디드 3D 프린팅을 위한 어닐링 및 생체 기능성 지지 수조의 제형을 위한 다양한 경로를 제공합니다. 이 프로토콜은 신경 구조의 3D 프린팅의 예를 제공하지만 SHAPE 도구 상자는 다양한 표적 조직 유형의 정밀 엔지니어링을 위해 다른 세포 소스와의 생체 가공에 쉽게 적용할 수 있습니다. 인쇄 접근 방식은 또한 여러 세포 유형의 정확한 패터닝을 통해 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253