인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

요약

이 연구는 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질 복합체 내부의 신경 줄기 세포의 자유형 임베디드 3D 프린팅을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 높은 충실도로 상호 연결된 인간 신경 조직 구조의 프로그래밍 가능한 패터닝을 가능하게 합니다.

초록

과립 지지 배지 내부에 세포를 내장한 3D 프린팅은 지난 10년 동안 연조직 구조의 자유형 생체 제조를 위한 강력한 접근 방식으로 등장했습니다. 그러나, 과립형 겔 제형은 다량의 하이드로겔 미세입자의 비용 효율적인 생성을 가능하게 하는 제한된 수의 바이오 물질로 제한되어 왔다. 따라서 과립형 겔 지지 배지는 일반적으로 천연 세포외 기질(ECM)에서 발견되는 세포 접착 및 세포 지시 기능이 부족합니다.

이를 해결하기 위해 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질(SHAPE) 복합체를 생성하기 위한 방법론이 개발되었습니다. SHAPE 복합재는 과립상(마이크로겔)과 연속상(점성 ECM 용액)으로 구성되며, 이를 통해 프로그래밍 가능한 고화질 인쇄와 조정 가능한 생체 기능성 세포외 환경을 모두 허용합니다. 이 연구는 개발된 방법론이 인간 신경 구조의 정확한 생체 제작에 어떻게 활용될 수 있는지 설명합니다.

먼저, SHAPE 복합체에서 입상 성분 역할을 하는 알지네이트 미세입자를 제조하여 콜라겐 기반의 연속 성분과 결합합니다. 그런 다음 인간 신경 줄기 세포를 지지체 내부에 인쇄한 다음 지지체를 어닐링합니다. 인쇄된 구축물은 인쇄된 세포가 뉴런으로 분화될 수 있도록 수주 동안 유지될 수 있다. 동시에, 콜라겐 연속기는 축삭 성장과 영역의 상호 연결을 허용합니다. 마지막으로, 이 연구는 3D 프린팅된 인간 신경 구조를 특성화하기 위해 생세포 형광 이미징 및 면역세포화학을 수행하는 방법에 대한 정보를 제공합니다.

서문

시험관 내에서 연조직을 모방하는 세포 함유 하이드로겔 구조의 정밀하고 프로그래밍 가능한 3D 프린팅은 큰 도전 과제입니다. 예를 들어, 연질 하이드로겔의 직접 압출을 기반으로 한 시도는 생체 내 미세 환경을 재현하는 데 필요한 열악한 기계적 특성으로 인해 구조적 무결성이 부족하거나 사전 정의된 특징이 변형되거나 제작된 구조가 완전히 붕괴되기 때문에 본질적으로 문제가 있습니다. 이 문제에 대한 기존의 해결 방법은 최종 구조가 모양을 유지할 수 있도록 더 단단한 생체 적합성 재료로 지지 스캐폴드를 인쇄하는 것입니다. 그러나 이 접근 방식은 설계 가능성을 크게 제한하고 인접 잉크의 신중한 유변학적 미세 조정이 필요합니다.

전통적인 층별 압출 기반 3D 프린팅의 한계를 극복하기 위해 임베디드 3D 프린팅은 최근 몇 년 동안 연질 재료 및 조직 제작의 강력한 대안으로 등장했습니다 1,2,3,4,5,6. 표면 상단의 주변 공기에서 잉크를 압출하는 대신, 잉크는 정지 상태에서는 고체와 같지만 움직이는 바늘 끝 주위를 가역적으로 유동화하여 연질 셀 함유 재료를 정밀하게 증착할 수 있도록 하는 지지 수조 내부의 주사기 바늘을 통해 직접 증착됩니다. 증착된 물질은 바늘의 여파로 지지체가 다시 응고될 때 제자리에 유지됩니다. 따라서 임베디드 3D 프린팅은 확장된 설계 가능성을 가진 부드러운 생체 재료로 복잡한 구조의 고해상도 자유형 제작을 가능하게 합니다 ^7,8.

입상 겔은 낮은 항복 응력 ^9,10,11에서 매끄럽고 국소적이며 가역적인 고체-액체 전이를 나타내도록 공식화될 수 있기 때문에 임베디드 3D 프린팅을 위한 지지 수조 재료로 광범위하게 연구되었습니다. 고해상도 인쇄를 위한 우수한 유변학적 특성을 보여주지만, 과립형 겔은 소수의 생체 재료에 국한되어 있다¹². 벌크 하이드로겔 제형에 사용할 수 있는 광범위한 바이오 재료를 고려할 때 특히 분명한 과립형 겔 제형의 다양성 부족은 간단한 화학 물질을 사용하여 많은 수의 마이크로겔을 비용 효율적으로 생성해야 하기 때문에 발생합니다. 과립형 겔 지지체의 제한된 생체 재료 환경으로 인해 인쇄 지지체가 제공하는 세포외 미세 환경의 조정은 현장에서 도전 과제를 제시합니다.

최근에, 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 매트릭스(SHAPE) 복합재(self-healing annealable particle-extracellular matrix, SHAPE) 복합체(composites¹³)라고 하는 임베디드 3D 프린팅 지지체의 생성을 위한 모듈식 접근법이 개발되었다. 이 접근법은 과립형 겔의 뚜렷한 유변학적 특성과 벌크 하이드로겔 제형의 생체 기능적 다양성을 결합합니다. 제시된 SHAPE 복합 지지체는 점성 콜라겐 기반 ECM 프리겔 용액(연속상, ~30% 부피 분율)으로 채워진 증가된 틈새 공간과 함께 충전된 알지네이트 미립자(과립상, ~70% 부피 분율)로 구성됩니다. 또한 SHAPE 지지체는 인간 신경 줄기 세포(hNSC)의 고해상도 증착을 용이하게 하며, 지지체의 어닐링 후 뉴런으로 분화되고 기능적 성숙에 도달하기 위해 몇 주 동안 유지될 수 있는 것으로 나타났습니다. SHAPE 지지대 내부에 내장된 3D 프린팅은 신경 조직 생체 제조를 위한 기존 기술과 관련된 주요 한계 중 일부를 극복하는 동시에 다목적 플랫폼을 제공합니다.

이 작업은 SHAPE 지지대 내부에 hNSC를 내장한 3D 프린팅 단계와 이후 기능적 뉴런으로 분화하는 단계를 자세히 설명합니다(그림 1). 첫째, 알지네이트 미립자는 내부 겔화 동안 전단을 통해 생성됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 특수 장비 및 세포독성 시약 없이 대량의 미립자를 쉽게 생성할 수 있습니다. 또한, 알지네이트는 다양한 세포 유형에 대한 생체적합성 하이드로겔 기질의 형성을 위한 널리 이용 가능하고 경제적인 재료 공급원입니다. 생성된 알지네이트 미립자는 콜라겐 용액과 결합하여 SHAPE 복합 지지체 물질을 형성합니다. 그런 다음 hNSC를 수확하여 3D 프린팅을 위한 세포 바이오잉크로 주사기에 로드합니다. 3D 바이오 프린터는 SHAPE 복합재 내부의 hNSC의 압출 기반 임베디드 인쇄에 사용됩니다. 3D 프린팅 된 세포는 뉴런으로 분화되어 공간적으로 정의되고 기능적인 인간 신경 구조를 생성합니다. 마지막으로, 프로토콜은 생성된 조직 구성물이 생세포 이미징 및 면역세포화학을 사용하여 특성화될 수 있는 방법을 설명합니다. 또한 최적화 및 문제 해결을 위한 팁이 제공됩니다. 특히, 과립상 및 연속상의 구성 요소는 신경 응용 분야를 넘어 다른 세포 및 조직 유형에서 요구하는 대로 다양한 생체 기능성 부분, 기계적 특성 및 가교 메커니즘을 수용하기 위해 다른 하이드로겔 제형과 교환될 수 있습니다.

프로토콜

1. 완충액 및 시약의 제조

1. 30mM 포도당, 5μM HEPES, 0.5% w/v 지질이 풍부한 소 혈청 알부민, 40μM L-알라닌, 40μM L-아스파라긴 일수화물, 40μM L-아스파라긴산, 40μM L-글루탐산, 40μM L-프롤린, 1% N2 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 표피 성장 인자(EGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 각각 20ng/L. LAF(층류 공기 흐름) 벤치에서 다음 단계를 수행합니다.
2. 60°C에서 4시간 동안 격렬하게 교반하여 초순수에 1% w/v 알긴산염 용액을 준비합니다. LAF 벤치에서 0.45μm 기공 크기 필터로 용해된 고온 알지네이트 용액을 멸균 필터합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   알림: 알긴산 용액의 온도가 60°C 미만이면 필터를 통과할 수 없습니다.
3. 초순수에서 37g/L NaHCO₃ 용액을 준비합니다. NaOH를 사용하여 용액의 pH를 9.5로 조정하고 LAF 벤치에서 필터 멸균합니다. 용액을 4°C에서 보관한다.

2. SHAPE 복합 재료 준비

1. 알지네이트 미립자 생성
   1. 멸균 비커의 초순수에 2mg/mL_CaCO3 용액을 준비합니다. 알긴산 용액과 1:1로 혼합하고 마그네틱 교반기를 사용하여 실온에서 1시간 동안 저어줍니다.
   2. 아세트산을 1:500 비율로 첨가하고 650rpm에서 밤새 저어줍니다.
      알림: 알긴산 용액은 즉시 겔화를 시작합니다. 성형 젤의 최적이고 균일한 교반을 보장하기 위해 사용된 유리 제품의 직경과 동일한 길이의 교반 자석을 사용해야 합니다. 다음날, 겔화 동안 교반을 통해 생성된 용액은 점성이 나타날 것입니다(그림 2A).
   3. 겔화된 알지네이트 용액을 LAF 벤치에 놓인 균질화기로 15,000rpm에서 10분 동안 균질화하여 미립자로 기계적으로 단편화합니다(그림 2B).
   4. 실온에서 18,500× g 의 속도로 20분 동안 미립자를 원심분리합니다(그림 2C).
   5. LAF 벤치 내부의 상층액을 조심스럽게 버리고 2mM NaOH 및 1% P/S를 포함하는 DMEM에 입자를 재현탁하고 4°C에서 밤새 배양합니다(그림 2D).
      알림: 서스펜션의 색상이 빨간색으로 돌아가야 합니다. 현탁액이 노란색으로 유지되면 NaOH를 적가하고 빨간색으로 변할 때까지 혼합합니다(그림 2E).
   6. 입자를 15,000rpm에서 3분 동안 균질화하고 실온에서 18,500× g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
   7. 펠릿(그림 2F)을 관찰하고 상청액을 조심스럽게 제거합니다.
      참고: 단단히 포장된 알지네이트 미립자의 펠릿은 추가 사용이 있을 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 알긴산 용액이 필터 멸균되지 않은 경우 미립자는 1주일 이내에 모두 사용해야 합니다.
2. SHAPE 복합 제형
   1. 인쇄 전날, 알긴산 미세입자 펠릿을 LAF 벤치에서 4% HEPES(1M 스톡) 및 4% NaHCO3 용액을 함유하는 성장 배지 부피의 2배에 재현탁하고, 실온에서 밤새 배양한다.
   2. 마이크로겔 현탁액을 18,500 × g 에서 실온에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.
   3. 알지네이트 미립자와 혼합되는 콜라겐을 LAF 벤치에서 중화시킨다. 콜라겐 원액을 희석하여 최종 농도 1mg/mL에 도달하고 4% HEPES와 4% NaHCO₃를 첨가하여 중화합니다. 예를 들어, SHAPE 복합체 3mL의 경우 알지네이트 미립자 2mL와 중화 콜라겐 1mL(HEPES 0.12mL,_NaHCO3 0.12mL, 성장 배지 0.16mL 및 콜라겐 0.6mL)를 혼합합니다.
      알림: 콜라겐과 혼합되는 모든 물질은 콜라겐 중합을 피하기 위해 얼음 위에서 다루어야 합니다. 콜라겐이 중화되자마자 중합이 천천히 시작됩니다.
   4. 알긴산 미세 입자 펠릿과 희석 및 중화된 콜라겐을 2:1 비율로 혼합하여 SHAPE 복합체를 생성합니다. LAF 벤치에서 얼음 위에서 천천히 위아래로 피펫팅하여 젤을 완전히 섞습니다.
      알림: 지지 재료에 기포가 생길 수 있으므로 소용돌이치지 마십시오.
   5. LAF 벤치에서 생성된 복합 재료를 냉각된 마이크로웰 플레이트 또는 적절한 인쇄 용기로 옮기고 30분 이내에 사용합니다(그림 3E, F).

3. hNSC 배양 및 바이오잉크 준비

1. 성장 배지에서 기저막 추출물이 코팅된 T75 플라스크에서 세포를 배양합니다. 3D 프린팅 실험에 사용하기 전에 해동 후 세포를 최소 2회 계대배양합니다.
2. 인쇄하기 전에, 37°C에서 5분 동안 0.025% 트립신 용액을 사용하여 세포를 효소적으로 해리시키고, 트립신을 성장 배지로 중화시키고, 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 400 × g 에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 흡인하고, 펠릿을 2-3 mL의 성장 배지에 재현탁시킨다.
3. 세포 계수를 수행하고, 400 × g에서 세포를 원심분리하고, 0.1% 잔탄검(세포가 침전되는 것을 방지하기 위해)이 보충된 성장 배지에 펠릿을 9 ×^{10 6} cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다.
4. 21G의 뭉툭한 금속 바늘을 사용하여 단단히 채워진 알지네이트 미립자 100μL를 주사기에 넣습니다(그림 3A).
   참고: 알지네이트 미립자로 플러그를 만드는 것은 두 가지 목적을 제공합니다: 인쇄 중 압출 안정성을 유지하는 데 도움이 되고 로드된 셀룰러 잉크(데드 볼륨 없음)의 완전한 압출을 허용합니다.
5. 동일한 바늘을 사용하여 준비된 세포 현탁액을 주사기에 넣습니다(그림 3B).
   알림: 주사기 로딩 단계에서 기포가 유입되지 않도록 각별히 주의하십시오. 기포는 인쇄하는 동안 불안정을 일으킬 수 있습니다.
6. 로딩 바늘을 인쇄에 사용할 27G 무딘 금속 바늘로 교체합니다(그림 3C).

4. 임베디드 3D 프린팅

1. 참조된 소프트웨어를 사용하여 인쇄할 구조를 설계합니다( 재료 표 참조).
   알림: 인쇄된 구조의 초기 높이를 SHAPE 복합 지지대의 깊이 내로 조정해야 합니다. 디자인 제안은 그림 4A (나선형 및 목재 파일 디자인)에서 찾을 수 있습니다.
2. 생성을 클릭하여 G-Code를 생성합니다.
3. 세포가 함유된 유리 주사기를 압출 기반 바이오프린터의 체적 압출 헤드에 삽입합니다(그림 3D).
4. Needle Length Measurement(바늘 길이 측정)를 클릭하여 세포가 함유된 유리 주사기의 바늘 길이를 측정합니다.
5. SHAPE 컴포지트가 들어 있는 마이크로웰 플레이트 또는 용기를 프린터에 놓습니다.
   알림: 지지대의 조기 가교를 방지하기 위해 인쇄할 때까지 셀 플레이트 또는 용기를 4°C에 보관하십시오.
6. SHM(표면 높이 측정)을 클릭하여 SHAPE 젤이 로드된 동일한 마이크로웰 플레이트 또는 용기 내에서 빈 웰의 표면 높이를 측정합니다.
   알림: 또는 바늘로 우물의 높이를 측정하여 표면 높이를 수동으로 결정하십시오.
7. 압출 속도를 3.6μL/min으로, 이송 속도를 0.3mm/s로 설정합니다.
   참고: 인쇄하기 전에 압출을 테스트해야 합니다. 셀 침전은 노즐 막힘을 유발할 수 있으며 실제 내장 인쇄 전에 작은 부피를 미리 압출하거나 부피 주사기에 수축 부피를 추가하여 방지할 수 있습니다. 경우에 따라 바늘이 SHAPE 젤에 삽입되거나 나올 때 잉크가 끌리지 않도록 이송 속도를 0.5mm/s 미만 으로 유지해야 합니다.
8. G 코드를 프린터의 사용자 인터페이스에 로드합니다.
   알림: 설계된 구조가 변경될 때마다 새로운 G-Code를 생성해야 합니다.
9. 실행(Run)을 클릭하여 인쇄 절차를 시작합니다(그림 3G).
10. 인쇄 직후, SHAPE 겔을 37°C에서 30분 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣고 어닐링한다.
11. 어닐링된 SHAPE 젤 지지대 위에 성장 배지를 부드럽게 추가합니다.
12. 다음날, 성장 배지를 다음과 같이 제형화된 분화 배지로 교체하십시오: DMEM/F12 30mM 포도당, 5μM HEPES, 0.5% w/v 지질이 풍부한 소 혈청 알부민, 40μM L-알라닌, 40μM L-아스파라긴 일수화물, 40μM L-아스파라긴산, 40μM L-글루탐산, 40μM L-프롤린, 1% N2 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 100μM 디부티릴-사이클릭 아데노신 모노포스페이트(디부티릴-cAMP), 및 2ng/mL 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF).
    알림: 배지 교체 중에 하이드로겔이 손상되지 않도록 하십시오. 접시를 기울이고 오래된 매체를 부드럽게 제거합니다. 젤 위에 직접 위가 아닌 젤이 들어있는 웰의 벽에 신선한 배지를 적가합니다. 배지를 제거하기 위해 흡열기를 사용하지 마십시오.
13. 실험 종점까지 2일마다 분화 배지를 새로 고칩니다.

5. 생세포 형광 이미징

1. 젤에서 과도한 배지를 제거합니다.
2. 동일한 부피의 20μM Calcein AM(원액에서 분화 배지로 희석됨)을 지지 겔의 부피에 추가합니다.
3. 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
4. Calcein AM 용액을 제거하고 적절한 양의 신선한 분화 배지를 추가합니다.
5. 이미징을 위해 플레이트를 현미경으로 옮깁니다.

6. 면역세포화학

1. 젤에서 과잉 배지를 제거합니다.
2. 작은 주걱을 사용하여 젤을 DPBS가 들어 있는 더 큰 용기로 옮깁니다.
3. DPBS로 매번 20분 동안 세 번 세척하고 플레이트를 흄 후드로 옮깁니다.
4. DPBS를 제거하고 겔을 덮을 만큼 충분한 4% 포름알데히드 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
5. 매번 20분 동안 DPBS로 세 번 세척하십시오.
6. DPBS에 당나귀 혈청 5%, 세제 0.25%, 아지드화나트륨 0.02%로 구성된 블로킹 용액을 준비합니다.
   알림: 젤을 덮는 데 필요한 부피의 3배를 준비합니다. 이는 나중에 1차 및 2차 항체 용액의 기초로 사용될 것입니다.
7. DPBS로 세척한 후 블로킹 용액을 겔에 첨가하고 불특정 결합을 방지하기 위해 실온에서 6시간 동안 배양합니다. 접시를 부드럽게 흔든다.
8. TUBB3 항체를 블로킹 용액에 1:1,000의 비율로 희석하여 1차 항체 용액을 준비합니다.
9. 겔로부터 블로킹 용액을 제거하고, 1차 항체 용액을 첨가하고, 4°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 접시를 부드럽게 흔든다.
10. 매번 20분 동안 DPBS로 세 번 세척하십시오.
11. 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, 1:1,000)과 2차 항체(1:200)를 블로킹 용액에 희석하여 2차 항체 용액을 준비합니다.
12. DPBS로 세척한 후, 4°C에서 24시간 동안 2차 항체 용액에서 겔을 인큐베이션한다. 접시를 부드럽게 흔든다.
13. 매번 20분 동안 DPBS로 3회 세척하고 이미징될 때까지 4°C에서 보관합니다.
14. 이미징하기 전에 주걱으로 염색 된 젤을 이미징 바닥이 얇은 접시 또는 웰 플레이트로 옮깁니다.

결과

내부 겔화 동안 전단 박화를 통한 알지네이트 마이크로겔 제조에 이어 기계적 단편화는 그림 2G에서 볼 수 있듯이 크기가 다분산되고 플레이크와 같은 모양을 갖는 알지네이트 마이크로겔을 생성합니다. 이러한 불규칙한 입자의 크기는 직경이 1μm 미만에서 약 40μm입니다. 촘촘하게 포장된 미세 입자는 해당 세포 배양 배지보다 약간 더 불투명한 투명한 벌크 물질을 ?...

토론

SHAPE 복합 재료 접근 방식은 셀룰러 잉크의 임베디드 3D 프린팅을 위한 어닐링 및 생체 기능성 지지 수조의 제형을 위한 다양한 경로를 제공합니다. 이 프로토콜은 신경 구조의 3D 프린팅의 예를 제공하지만 SHAPE 도구 상자는 다양한 표적 조직 유형의 정밀 엔지니어링을 위해 다른 세포 소스와의 생체 가공에 쉽게 적용할 수 있습니다. 인쇄 접근 방식은 또한 여러 세포 유형의 정확한 패터닝을 통해 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253