Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für den Freiform-eingebetteten 3D-Druck von neuralen Stammzellen in selbstheilenden, annealbaren Partikel-extrazellulären Matrixkompositen. Das Protokoll ermöglicht die programmierbare Strukturierung von miteinander verbundenen menschlichen Nervengewebekonstrukten mit hoher Genauigkeit.

Zusammenfassung

Der eingebettete 3D-Druck von Zellen in einem granularen Trägermedium hat sich in den letzten zehn Jahren zu einem leistungsstarken Ansatz für die Freiform-Biofabrikation von Weichteilkonstrukten entwickelt. Granulierte Gelformulierungen sind jedoch auf eine begrenzte Anzahl von Biomaterialien beschränkt, die die kostengünstige Erzeugung großer Mengen von Hydrogel-Mikropartikeln ermöglichen. Daher fehlten granularen Gelträgermedien im Allgemeinen die zelladhäsiven und zellinstruktiven Funktionen, die in der nativen extrazellulären Matrix (EZM) zu finden sind.

Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Methodik zur Erzeugung von selbstheilenden annealbaren Partikel-extrazellulären Matrix-Kompositen (SHAPE) entwickelt. SHAPE-Verbundwerkstoffe bestehen aus einer granularen Phase (Mikrogele) und einer kontinuierlichen Phase (viskose ECM-Lösung), die zusammen sowohl einen programmierbaren High-Fidelity-Druck als auch eine einstellbare biofunktionelle extrazelluläre Umgebung ermöglichen. Diese Arbeit beschreibt, wie die entwickelte Methodik für die präzise Biofabrikation menschlicher neuronaler Konstrukte genutzt werden kann.

Zunächst werden Alginat-Mikropartikel, die als körnige Komponente in den SHAPE-Verbundwerkstoffen dienen, hergestellt und mit einer kollagenbasierten kontinuierlichen Komponente kombiniert. Dann werden menschliche neuronale Stammzellen in das Trägermaterial gedruckt, gefolgt vom Ausglühen des Trägers. Die gedruckten Konstrukte können wochenlang aufrechterhalten werden, um die Differenzierung der gedruckten Zellen zu Neuronen zu ermöglichen. Gleichzeitig ermöglicht die kontinuierliche Phase des Kollagens das axonale Wachstum und die Verbindung von Regionen. Schließlich liefert diese Arbeit Informationen darüber, wie Lebendzell-Fluoreszenzbildgebung und Immunzytochemie durchgeführt werden können, um die 3D-gedruckten menschlichen neuronalen Konstrukte zu charakterisieren.

Einleitung

Der präzise und programmierbare 3D-Druck von zellbeladenen Hydrogel-Konstrukten, die Weichgewebe in vitro nachahmen, stellt eine große Herausforderung dar. Zum Beispiel sind Versuche, die auf der direkten Extrusion von weichen Hydrogelen basieren, von Natur aus problematisch, da die schlechten mechanischen Eigenschaften, die erforderlich sind, um die In-vivo-Mikroumgebung zu rekapitulieren, zu einem Mangel an struktureller Integrität, zu Verformungen der vordefinierten Merkmale oder zum vollständigen Kollaps der hergestellten Strukturen führen. Eine konventionelle Problemumgehung für dieses Problem besteht darin, ein Stützgerüst aus einem steiferen biokompatiblen Material zu drucken, das es dem endgültigen Konstrukt ermöglicht, seine Form beizubehalten. Dieser Ansatz schränkt jedoch die Gestaltungsmöglichkeiten stark ein und erfordert eine sorgfältige rheologische Feinabstimmung der angrenzenden Tinten.

Um die Einschränkungen des traditionellen schichtweise extrusionsbasierten 3D-Drucks zu überwinden, hat sich der eingebettete 3D-Druck in den letzten Jahren zu einer leistungsstarken Alternative für die Herstellung von weichem Material und Gewebe entwickelt 1,2,3,4,5,6. Anstatt die Tinte in der Umgebungsluft auf einer Oberfläche zu extrudieren, wird die Tinte direkt durch eine Spritzennadel in einem Stützbad abgeschieden, das im Ruhezustand feststoffartig ist, aber reversibel um die bewegliche Nadelspitze herum fluidisiert, um die präzise Abscheidung von weichem, zellbeladenem Material zu ermöglichen. Das abgeschiedene Material wird an Ort und Stelle gehalten, während sich der Träger im Nachlauf der Nadel wieder verfestigt. So ermöglicht der eingebettete 3D-Druck die hochauflösende Freiformherstellung komplizierter Strukturen aus weichen Biomaterialien mit erweiterten Gestaltungsmöglichkeiten ^7,8.

Granulare Gele wurden ausgiebig als Stützbadmaterialien für den eingebetteten 3D-Druck untersucht, da sie so formuliert werden können, dass sie glatte, lokalisierte und reversible Fest-Flüssig-Übergänge bei niedrigen Streckspannungen aufweisen 9,10,11. Während sie hervorragende rheologische Eigenschaften für den hochauflösenden Druck aufweisen, wurden granulare Gele bisher auf eine Handvoll Biomaterialien beschränkt¹². Die mangelnde Vielfalt an granulierten Gelformulierungen, die besonders deutlich wird, wenn man die breite Palette von Biomaterialien betrachtet, die für Hydrogel-Bulk-Formulierungen zur Verfügung stehen, wird durch die Notwendigkeit der kostengünstigen Herstellung einer großen Anzahl von Mikrogelen mit einfachen Chemikalien verursacht. Aufgrund der begrenzten Biomateriallandschaft granularer Gelträger stellt die Abstimmung der extrazellulären Mikroumgebung, die durch den Druckträger bereitgestellt wird, eine Herausforderung in diesem Bereich dar.

In jüngster Zeit wurde ein modularer Ansatz für die Erzeugung von eingebetteten 3D-Druckträgern entwickelt, der als selbstheilende annealable particle-extracellular matrix (SHAPE)-Verbundwerkstoffe^{bezeichnet wird 13}. Dieser Ansatz kombiniert die unterschiedlichen rheologischen Eigenschaften von granularen Gelen mit der biofunktionellen Vielseitigkeit von Bulk-Hydrogel-Formulierungen. Der vorgestellte SHAPE-Composite-Träger besteht aus gepackten Alginat-Mikropartikeln (granulare Phase, ~70% Volumenanteil) mit einem vergrößerten interstitiellen Raum, der mit einer viskosen kollagenbasierten ECM-Pregellösung (kontinuierliche Phase, ~30% Volumenanteil) gefüllt ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der SHAPE-Träger die hochauflösende Ablagerung von humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) ermöglicht, die nach dem Ausglühen des Trägerbades zu Neuronen differenziert und wochenlang aufrechterhalten werden können, um eine funktionelle Reifung zu erreichen. Der eingebettete 3D-Druck im Inneren des SHAPE-Stützbades überwindet einige der wichtigsten Einschränkungen im Zusammenhang mit herkömmlichen Techniken für die Biofabrikation von Nervengewebe und bietet gleichzeitig eine vielseitige Plattform.

Diese Arbeit beschreibt die Schritte für den eingebetteten 3D-Druck von hNSCs innerhalb des SHAPE-Trägers und ihre anschließende Differenzierung in funktionelle Neuronen (Abbildung 1). Zunächst werden Alginat-Mikropartikel durch Scherung während der internen Gelierung erzeugt. Dieser Ansatz ermöglicht die einfache Erzeugung großer Mengen von Mikropartikeln, ohne dass spezielle Geräte und zytotoxische Reagenzien erforderlich sind. Darüber hinaus ist Alginat eine weit verbreitete und kostengünstige Materialquelle für die Bildung biokompatibler Hydrogelsubstrate für eine Vielzahl von Zelltypen. Die erzeugten Alginat-Mikropartikel werden mit einer Kollagenlösung kombiniert, um das SHAPE-Komposit-Trägermaterial zu bilden. Anschließend werden die hNSCs geerntet und als zelluläre Biotinte für den 3D-Druck in eine Spritze geladen. Ein 3D-Biodrucker wird für den extrusionsbasierten eingebetteten Druck von hNSCs im Inneren des SHAPE-Verbundwerkstoffs verwendet. Die 3D-gedruckten Zellen werden zu Neuronen differenziert, so dass räumlich definierte und funktionelle menschliche neuronale Konstrukte entstehen. Schließlich beschreibt das Protokoll, wie die erzeugten Gewebekonstrukte mittels Lebendzellbildgebung und Immunzytochemie charakterisiert werden können. Zusätzlich werden Tipps zur Optimierung und Fehlerbehebung gegeben. Insbesondere konnten sowohl die Komponenten der granularen als auch der kontinuierlichen Phase mit anderen Hydrogelformulierungen ausgetauscht werden, um unterschiedliche biofunktionelle Einheiten, mechanische Eigenschaften und Vernetzungsmechanismen zu berücksichtigen, wie sie von anderen Zell- und Gewebetypen jenseits neuronaler Anwendungen benötigt werden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Puffer und Reagenzien

1. Stellen Sie Zellwachstumsmedium her, indem Sie DMEM/F12 die folgenden Ergänzungen mit L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid hinzufügen: 30 mM Glukose, 5 μM HEPES, 0,5 % w/v lipidreiches Rinderserumalbumin, 40 μM L-Alanin, 40 μM L-Asparagin-Monohydrat, 40 μM L-Asparaginsäure, 40 μM L-Glutaminsäure, 40 μM L-Prolin, 1 % N2-Ergänzung, 1 % Penicillin-Streptomycin und je 20 ng/l epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF). Führen Sie diese Schritte in einer LAF-Bank (Laminar Air-Flow) durch.
2. 1%ige w/v Alginatlösung in Reinstwasser unter kräftigem Rühren 4 h bei 60 °C herstellen. Sterilfiltrieren Sie die gelöste, heiße Alginatlösung mit einem 0,45 μm porengroßen Filter in einer LAF-Bank. Bei 4 °C lagern.
   Anmerkungen: Wenn die Temperatur der Alginatlösung unter 60 °C liegt, kann sie nicht durch den Filter geleitet werden.
3. Bereiten Sie eine 37 g/L NaHCO₃ Lösung in Reinstwasser vor. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit NaOH auf 9,5 ein und filtern Sie sie in einem LAF-Labor. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.

2. SHAPE-Verbundwerkstoffvorbereitung

1. Erzeugung von Alginat-Mikropartikeln
   1. Bereiten Sie eine 2 mg/ml CaCO_3-Lösung in Reinstwasser in einem sterilen Becherglas zu. 1:1 mit der Alginatlösung mischen und 1 h bei Raumtemperatur mit einem Magnetrührer rühren.
   2. Fügen Sie Essigsäure im Verhältnis 1:500 hinzu und rühren Sie über Nacht bei 650 U/min.
      Anmerkungen: Die Alginatlösung beginnt sofort zu gelieren. Achten Sie darauf, einen Rührmagneten zu verwenden, der die gleiche Länge wie der Durchmesser der verwendeten Gläser hat, um ein optimales, homogenes Rühren des Formgels zu gewährleisten. Am nächsten Tag erscheint die durch Rühren während der Gelierung erzeugte Lösung viskos (Abbildung 2A).
   3. Fragmentieren Sie die gelierte Alginatlösung mechanisch in Mikropartikel, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 15.000 U/min mit einem Homogenisator in einer LAF-Bank homogenisieren (Abbildung 2B).
   4. Zentrifugieren Sie die Mikropartikel bei 18.500 × g für 20 min (Abbildung 2C) bei Raumtemperatur.
   5. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig in der LAF-Bank, resuspendieren Sie die Partikel in DMEM, die 2 mM NaOH und 1 % P/S enthalten, und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 4 °C (Abbildung 2D).
      Anmerkungen: Die Farbe der Aufhängung sollte wieder rot sein. Wenn die Suspension gelb bleibt, fügen Sie NaOH tropfenweise hinzu und mischen Sie, bis es rot wird (Abbildung 2E).
   6. Homogenisieren Sie die Partikel bei 15.000 U/min für 3 min und zentrifugieren Sie sie bei 18.500 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
   7. Beobachten Sie das Pellet (Abbildung 2F) und entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
      Anmerkungen: Das Pellet aus dicht gepackten Alginat-Mikropartikeln kann bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert werden. Wenn die Alginatlösung nicht filtersterilisiert wurde, sollten die Mikropartikel innerhalb von 1 Woche aufgebraucht werden.
2. SHAPE-Composite-Formulierung
   1. Am Tag vor dem Druck wird das Alginat-Mikropartikelpellet in der doppelten Menge des Wachstumsmediums, das 4 % HEPES (1 Mio. Material) und 4 % NaHCO_3-Lösung enthält, in einer LAF-Bank resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
   2. Zentrifugieren Sie die Mikrogelsuspension bei 18.500 × g für 10 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
   3. Neutralisieren Sie das Kollagen, das mit den Alginat-Mikropartikeln in einer LAF-Bank gemischt werden soll. Verdünnen Sie die Kollagenstammlösung, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu erreichen, und neutralisieren Sie sie durch Zugabe von 4 % HEPES und 4 % NaHCO₃. Mischen Sie beispielsweise für 3 ml SHAPE-Komposit 2 ml Alginat-Mikropartikel mit 1 ml neutralisiertem Kollagen (0,12 ml HEPES, 0,12 ml NaHCO₃, 0,16 ml Wachstumsmedium und 0,6 ml Kollagen).
      Anmerkungen: Alle Materialien, die mit Kollagen gemischt werden, müssen auf Eis gehandhabt werden, um eine Kollagenpolymerisation zu vermeiden. Sobald das Kollagen neutralisiert ist, beginnt langsam die Polymerisation.
   4. Erzeugen Sie das SHAPE-Komposit, indem Sie das Alginat-Mikropartikelpellet mit dem verdünnten und neutralisierten Kollagen im Verhältnis 2:1 mischen. Mischen Sie das Gel gründlich, indem Sie es langsam auf Eis in einer LAF-Bank auf und ab pipettieren.
      Anmerkungen: Wirbeln Sie nicht, da dadurch Blasen in das Trägermaterial gelangen.
   5. In einer LAF-Bank wird das erzeugte Verbundmaterial in eine gekühlte Mikrotiterplatte oder einen geeigneten Druckbehälter überführt und innerhalb von 30 Minuten verwendet (Abbildung 3E, F).

3. hNSC-Kultur und Biotintenpräparation

1. Kultivieren Sie die Zellen in einem mit Basalmembranextrakt beschichteten T75-Kolben in Wachstumsmedium. Passieren Sie die Zellen nach dem Auftauen mindestens zweimal, bevor Sie sie für ein 3D-Druckexperiment verwenden.
2. Dissoziieren Sie die Zellen vor dem Drucken enzymatisch mit einer 0,025%igen Trypsinlösung für 5 min bei 37 °C, neutralisieren Sie das Trypsin mit Wachstumsmedium und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und das Pellet in 2-3 ml Wachstumsmedium resuspendiert.
3. Führen Sie eine Zellzählung durch, zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 × g und resuspendieren Sie das Pellet in einem mit 0,1 % Xanthan angereicherten Wachstumsmedium (um eine Ablagerung der Zellen zu verhindern) in einer Endkonzentration von 9 × 10⁶ Zellen/ml.
4. Verwenden Sie eine stumpfe 21-G-Metallnadel, um 100 μl dicht gepackte Alginat-Mikropartikel in eine Spritze zu laden (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Die Herstellung eines Stopfens mit den Alginat-Mikropartikeln dient zwei Zwecken: Es trägt zur Aufrechterhaltung der Extrusionsstabilität während des Drucks bei und ermöglicht die vollständige Extrusion der geladenen Zelltinte (kein totes Volumen).
5. Laden Sie mit derselben Nadel die vorbereitete Zellsuspension in die Spritze (Abbildung 3B).
   Anmerkungen: Achten Sie besonders darauf, dass während der Spritzenladeschritte keine Luftblasen entstehen. Luftblasen verursachen Instabilitäten während des Drucks.
6. Ersetzen Sie die Ladenadel durch eine stumpfe 27-G-Metallnadel, die zum Drucken verwendet wird (Abbildung 3C).

4. Eingebetteter 3D-Druck

1. Entwerfen Sie eine Struktur zum Drucken mit der referenzierten Software (siehe Materialtabelle).
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass Sie die Anfangshöhe der gedruckten Struktur so einstellen, dass sie innerhalb der Tiefe der SHAPE-Verbundstütze liegt. Ausführungsvorschläge finden Sie in Abbildung 4A (Spiral- und Holzstapelausführungen).
2. Generieren Sie einen G-Code, indem Sie auf Generieren klicken.
3. Führen Sie die mit Zellen beladene Glasspritze in einen volumetrischen Extrusionskopf auf einem extrusionsbasierten Biodrucker ein (Abbildung 3D).
4. Messen Sie die Nadellänge der zellbeladenen Glasspritze, indem Sie auf Nadellängenmessung klicken.
5. Legen Sie die Mikrotiterplatte oder den mit dem SHAPE-Komposit bestückten Behälter auf den Drucker.
   Anmerkungen: Halten Sie die Zellplatte oder den Behälter bis zum Druck bei 4 °C, um eine vorzeitige Vernetzung des Trägers zu verhindern.
6. Messen Sie die Oberflächenhöhe einer leeren Vertiefung innerhalb derselben Mikrotiterplatte oder desselben Behälters, in die das SHAPE-Gel geladen ist, indem Sie auf SHM (Oberflächenhöhenmessung) klicken.
   Anmerkungen: Alternativ können Sie die Oberflächenhöhe manuell bestimmen, indem Sie die Höhe der Vertiefung mit der Nadel messen.
7. Stellen Sie die Extrusionsrate auf 3,6 μL/min und die Vorschubgeschwindigkeit auf 0,3 mm/s ein.
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass Sie die Extrusion vor dem Drucken testen. Zellsedimentation kann zu einer Verstopfung der Düse führen und kann vermieden werden, indem ein kleines Volumen vor dem eigentlichen eingebetteten Druck vorextrudiert oder der volumetrischen Spritze ein Retraktionsvolumen hinzugefügt wird. In einigen Fällen muss die Vorschubgeschwindigkeit beim Einführen oder Verlassen des SHAPE-Gels unter 0,5 mm/s gehalten werden, um ein Ziehen der Tinte zu vermeiden.
8. Laden Sie den G-Code in die Benutzeroberfläche des Druckers.
   HINWEIS: Jedes Mal, wenn Änderungen an der entworfenen Struktur vorgenommen werden, muss ein neuer G-Code generiert werden.
9. Starten Sie den Druckvorgang, indem Sie auf Ausführen klicken (Abbildung 3G).
10. Unmittelbar nach dem Druck wird das SHAPE-Gel bei 37 °C für 30 min in einen Zellkultur-Inkubator zum Glühen gegeben.
11. Geben Sie das Nährmedium vorsichtig auf die geglühte SHAPE-Gelstütze.
12. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium am nächsten Tag durch ein Differenzierungsmedium, das wie folgt formuliert ist: DMEM/F12 mit L-Alanyl-L-glutamin-Dipeptid mit 30 mM Glukose, 5 μM HEPES, 0,5 % w/v lipidreiches Kälberserumalbumin, 40 μM L-Alanin, 40 μM L-Asparagin-Monohydrat, 40 μM L-Asparaginsäure, 40 μM L-Glutaminsäure, 40 μM L-Prolin, 1% N2-Supplement, 1% Penicillin-Streptomycin, 100 μM Dibutyrylcyclisches Adenosinmonophosphat (Dibutyryl-cAMP), und 2 ng/ml Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF).
    Anmerkungen: Achten Sie darauf, das Hydrogel während des Mediumwechsels nicht zu beschädigen. Kippen Sie die Platte und entfernen Sie das alte Medium vorsichtig. Geben Sie frisches Medium tropfenweise auf die Wand der Vertiefung, die das Gel enthält, anstatt direkt auf das Gel. Verwenden Sie keinen Absauger, um das Medium zu entfernen.
13. Aktualisieren Sie das Differenzierungsmedium alle 2 Tage bis zum experimentellen Endpunkt.

5. Lebendzell-Fluoreszenz-Bildgebung

1. Entfernen Sie überschüssiges Medium aus dem Gel.
2. Fügen Sie dem Volumen des Trägergels ein gleiches Volumen von 20 μM Calcein AM (verdünnt in Differenzierungsmedium aus der Stammlösung) hinzu.
3. 40 min bei 37 °C inkubieren.
4. Entfernen Sie die Calcein AM-Lösung und fügen Sie eine angemessene Menge frisches Differenzierungsmedium hinzu.
5. Übertragen Sie die Platte zur Bildgebung auf das Mikroskop.

6. Immunzytochemie

1. Entfernen Sie das überschüssige Medium aus dem Gel.
2. Übertragen Sie das Gel mit einem kleinen Spatel in einen größeren Behälter mit DPBS.
3. Waschen Sie den Teller dreimal für jeweils 20 Minuten mit DPBS und legen Sie den Teller in einen Abzug.
4. Entfernen Sie das DPBS, fügen Sie genügend 4%ige Formaldehydlösung hinzu, um das Gel zu bedecken, und inkubieren Sie es 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
5. Dreimal mit DPBS für jeweils 20 Minuten waschen.
6. Bereiten Sie eine Blockierlösung vor, die aus 5 % Eselsserum, 0,25 % Detergento und 0,02 % Natriumazid in DPBS besteht.
   Anmerkungen: Bereiten Sie das Dreifache des Volumens vor, das zum Abdecken des Gels erforderlich ist. Es wird später als Basis für die primären und sekundären Antikörperlösungen verwendet.
7. Nach dem Waschen mit DPBS die Blockierlösung in das Gel geben und 6 h bei Raumtemperatur inkubieren, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. Schaukeln Sie den Teller vorsichtig.
8. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den TUBB3-Antikörper in Blockierungslösung im Verhältnis 1:1.000 verdünnen.
9. Entfernen Sie die Blockierungslösung aus dem Gel, fügen Sie die primäre Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie sie 48 h lang bei 4 °C. Schaukeln Sie den Teller vorsichtig.
10. Dreimal mit DPBS für jeweils 20 Minuten waschen.
11. Die sekundäre Antikörperlösung wird durch Verdünnen von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1.000) und des sekundären Antikörpers (1:200) in Blockierungslösung hergestellt.
12. Nach dem Waschen mit DPBS wird das Gel in der sekundären Antikörperlösung für 24 h bei 4 °C inkubiert. Schaukeln Sie den Teller vorsichtig.
13. Dreimal mit DPBS für jeweils 20 min waschen und bis zur Bildgebung bei 4 °C lagern.
14. Übertragen Sie das gefärbte Gel vor der Bildgebung mit einem Spatel in eine Schale oder eine Well-Platte mit einem dünnen Bildboden.

Ergebnisse

Die Herstellung von Alginat-Mikrogelen durch Scherverdünnung während der internen Gelierung, gefolgt von mechanischer Fragmentierung, ergibt Alginat-Mikrogele, die polydispergiert und flockenartig geformt sind, wie in Abbildung 2G zu sehen ist. Die Größe dieser unregelmäßigen Partikel reicht von weniger als 1 μm bis zu einem Durchmesser von etwa 40 μm. Dicht gepackt bilden die Mikropartikel ein transparentes Schüttgut, das nur geringfügig undurchsichtiger ist als das entsp...

Diskussion

Der SHAPE-Verbundwerkstoffansatz bietet einen vielseitigen Weg für die Formulierung von glühbaren und biofunktionalen Trägerbädern für den eingebetteten 3D-Druck von zellulären Tinten. Während dieses Protokoll ein Beispiel für den 3D-Druck neuronaler Konstrukte darstellt, könnte die SHAPE-Toolbox leicht an die Biofabrikation mit anderen Zellquellen angepasst werden, um eine Reihe von Zielgewebetypen präzise zu entwickeln. Der Druckansatz würde auch die präzise Strukturierung mehrerer Zelltypen ermöglichen, u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253