微凝胶-细胞外基质复合材料支持人类神经结构的嵌入式3D打印

摘要

这项工作描述了在自修复可退火颗粒 - 细胞外基质复合材料中自由形式嵌入神经干细胞的协议。该协议能够以高保真度对互连的人类神经组织结构进行可编程模式化。

摘要

在过去十年中，颗粒支持介质内细胞的嵌入式3D打印已成为软组织构建体自由形式生物制造的有力方法。然而，颗粒凝胶配方仅限于有限数量的生物材料，这些生物材料允许经济高效地产生大量水凝胶微粒。因此，颗粒凝胶支持培养基通常缺乏天然细胞外基质（ECM）中的细胞粘附和细胞指导功能。

为了解决这个问题，已经开发了一种用于生成自修复可退火颗粒 - 细胞外基质（SHAPE）复合材料的方法。SHAPE复合材料由颗粒相（微凝胶）和连续相（粘性ECM溶液）组成，它们共同允许可编程的高保真打印和可调节的生物功能细胞外环境。这项工作描述了如何利用开发的方法对人类神经结构进行精确的生物制造。

首先，制备作为SHAPE复合材料颗粒组分的藻酸盐微粒，并与基于胶原蛋白的连续组分结合。然后，将人神经干细胞打印在载体材料内部，然后对载体进行退火。打印的构建体可以维持数周，以使打印的细胞分化为神经元。同时，胶原蛋白连续相允许轴突生长和区域互连。最后，这项工作提供了有关如何进行活细胞荧光成像和免疫细胞化学以表征3D打印的人类神经构建体的信息。

引言

在 体外 模拟软组织的含有细胞的水凝胶结构的精确和可编程的3D打印提出了重大挑战。例如，基于软水凝胶的直接挤出的尝试本质上是有问题的，因为概括 体内 微环境所需的不良机械性能导致缺乏结构完整性，预定义特征变形或制造结构完全崩溃。此问题的常规解决方法是用更硬的生物相容性材料打印支撑支架，使最终结构保持其形状。然而，这种方法极大地限制了设计的可能性，并且需要对相邻油墨进行仔细的流变微调。

为了克服传统的逐层挤出3D打印的局限性，嵌入式3D打印近年来已成为软材料和组织制造的有力替代方案¹，²，³，⁴，^5，6。墨水不是在环境空气中挤出在表面上，而是直接通过支撑槽内的注射器针头沉积，支撑槽在静止时呈固体状，但在移动针尖周围可逆地流化，以允许精确沉积软细胞材料。当支撑物在针尾重新凝固时，沉积的材料保持原位。因此，嵌入式3D打印允许从软生物材料中高分辨率自由形式制造复杂的结构，并具有扩展的设计可能性^7，8。

颗粒凝胶已被广泛探索为嵌入式3D打印的支撑浴材料，因为它们可以配制成在低屈^服应力下表现出平滑，局部和可逆的固液转变9，^10，11。虽然颗粒凝胶在高分辨率印刷中表现出优异的流变特性，但仅限于少数生物材料¹²。颗粒凝胶配方缺乏多样性，如果考虑到可用于散装水凝胶配方的广泛生物材料，这一点尤其明显，这是由于需要使用简单的化学方法经济高效地生成大量微凝胶造成的。由于颗粒凝胶载体的生物材料前景有限，因此由打印载体提供的细胞外微环境的调整在该领域提出了挑战。

最近，已经开发了一种用于生成嵌入式3D打印载体的模块化方法，称为自修复退火颗粒 - 细胞外基质（SHAPE）复合材料¹³。这种方法将颗粒凝胶的独特流变特性与块状水凝胶配方的生物功能多功能性相结合。所提出的SHAPE复合载体由填充的藻酸盐微粒（颗粒相，~70%体积分数）组成，增加的间隙空间充满了粘性胶原蛋白基ECM预凝胶溶液（连续相，~30%体积分数）。进一步表明，SHAPE支持物有助于人类神经干细胞（hNSCs）的高分辨率沉积，在支撑浴退火后，可以分化成神经元并保持数周以达到功能成熟。SHAPE支撑槽内的嵌入式3D打印克服了与传统神经组织生物制造技术相关的一些主要限制，同时提供了一个多功能平台。

这项工作详细介绍了在SHAPE支持内嵌入hNSCs的步骤，以及它们随后分化为功能性神经元的步骤（图1）。首先，在内部凝胶化过程中 通过剪切产生 藻酸盐微粒。这种方法可以轻松生成大量微粒，而无需专门的设备和细胞毒性试剂。此外，海藻酸盐是一种广泛可用且经济的材料来源，用于形成适用于各种细胞类型的生物相容性水凝胶底物。生成的藻酸盐微粒与胶原溶液结合，形成SHAPE复合支撑材料。然后，收集hNSCs并作为细胞生物墨水加载到注射器中进行3D打印。3D生物打印机用于基于挤出的嵌入式打印hNSCs在SHAPE复合材料内。3D打印的细胞被分化成神经元，以产生空间定义和功能性的人类神经结构。最后，该协议描述了如何使用活细胞成像和免疫细胞化学表征生成的组织构建体。此外，还提供了有关优化和故障排除的提示。值得注意的是，颗粒相和连续相的组分都可以与其他水凝胶配方交换，以适应不同的生物功能部分、机械性能和交联机制，以满足神经应用以外的其他细胞和组织类型的需求。

研究方案

1. 缓冲液和试剂的制备

1. 通过将以下补充剂加入带有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的DMEM / F12来制备细胞生长培养基:30mM葡萄糖，5μM HEPES，0.5%w / v富含脂质的牛血清蛋白，40μM L-丙氨酸，40μM L-天冬酰胺一水合物，40μM L-天冬氨酸，40μM L-谷氨酸，40μM L-脯氨酸，1%N 2补充剂，1%青霉素 - 链霉素和表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）各20ng / L。在层流气流 （LAF） 工作台中执行这些步骤。
2. 在超纯水中制备1%w / v海藻酸盐溶液，在60°C下剧烈搅拌4小时。 在LAF工作台上用0.45μm孔径过滤器无菌过滤溶解的热藻酸盐溶液。将其储存在4°C。
   注意:如果藻酸盐溶液的温度低于60°C，则无法通过过滤器。
3. 在超纯水中制备 37 g/L NaHCO₃ 溶液。使用NaOH将溶液的pH值调节至9.5，并在LAF工作台中进行过滤灭菌。将溶液储存在4°C。

2. 成型复合材料制备

1. 海藻酸盐微粒生成
   1. 在无菌烧杯中制备 2 mg/mL CaCO₃ 溶液的超纯水中。将其与藻酸盐溶液1:1混合，并使用磁力搅拌器在室温下搅拌1小时。
   2. 以1:500的比例加入乙酸，并以650rpm搅拌过夜。
      注意:海藻酸盐溶液将立即开始凝胶化。确保使用与所用玻璃器皿直径长度相同的搅拌磁铁，以确保成型凝胶的最佳、均匀搅拌。第二天，在凝胶过程中通过搅拌 产生的 溶液将呈现粘稠（图2A）。
   3. 通过将凝胶海藻酸盐溶液以15，000rpm均匀化10分钟，将凝胶海藻酸盐溶液机械地破碎成微粒，并将均质器置于LAF工作台中（图2B）。
   4. 在室温下以18，500× g 离心微粒20分钟（图2C）。
   5. 小心地将上清液丢弃在LAF工作台内，将颗粒重悬于含有2mM NaOH和1%P / S的DMEM中，并在4°C下孵育过夜（图2D）。
      注意:悬架的颜色应恢复为红色。如果悬浮液保持黄色，则滴加NaOH，并混合直至变为红色（图2E）。
   6. 以 15，000 rpm 的速度均质颗粒 3 分钟，并在室温下以 18，500 × g 离心 10 分钟。
   7. 观察沉淀（图2F），并小心除去上清液。
      注意:紧密包装的藻酸盐微粒的颗粒可以储存在4°C直到进一步使用。如果藻酸盐溶液没有经过过滤灭菌，微粒应在1周内用完。
2. 形状复合配方
   1. 打印前一天，将藻酸盐微粒颗粒重悬于含有4%HEPES（1M储备液）和4%NaHCO₃ 溶液的两倍体积的生长培养基中，并在室温下孵育过夜。
   2. 在室温下以18，500× g 离心微凝胶悬液10分钟，并弃去上清液。
   3. 在LAF工作台中和胶原蛋白与藻酸盐微粒混合。稀释胶原蛋白储备溶液以达到 1 mg/mL 的最终浓度，并通过加入 4% HEPES 和 4% NaHCO₃ 将其中和。例如，对于 3 mL 的 SHAPE 复合材料，将 2 mL 海藻酸盐微粒与 1 mL 中和胶原蛋白（0.12 mL HEPES、0.12 mL NaHCO₃、0.16 mL 生长培养基和 0.6 mL 胶原蛋白）混合。
      注意:所有与胶原蛋白混合的材料都需要在冰上处理，以避免胶原蛋白聚合。一旦胶原蛋白被中和，聚合就会慢慢开始。
   4. 通过将藻酸盐微粒颗粒与稀释和中和的胶原蛋白以 2:1 的比例混合来生成 SHAPE 复合材料。通过在LAF工作台上缓慢上下移液，彻底混合凝胶。
      注意:不要涡旋，因为这会在支撑材料中引入气泡。
   5. 在LAF工作台中，将生成的复合材料转移到冷却的微孔板或任何合适的打印容器中，并在30分钟内使用（图3E，F）。

3. hNSC培养和生物墨水制备

1. 在生长培养基中的基底膜提取物包被的T75烧瓶中培养细胞。解冻后至少传代细胞两次，然后再将它们用于3D打印实验。
2. 打印前，使用0.025%胰蛋白酶溶液在37°C下酶解离细胞5分钟，用生长培养基中和胰蛋白酶，并在室温下以400× g 离心细胞悬液5分钟。离心后，吸出上清液，并将沉淀重悬于2-3mL生长培养基中。
3. 进行细胞计数，以400 × g离心细胞，并将沉淀重悬于补充有0.1%黄原胶（以防止细胞沉降）的生长培养基中，终浓度为9×10⁶ 个细胞/ mL。
4. 使用 21 G 钝金属针将 100 μL 紧密包装的藻酸盐微粒加载到注射器中（图 3A）。
   注意:用海藻酸盐微粒创建塞子有两个目的:它有助于在印刷过程中保持挤出稳定性，并允许完全挤出装载的多孔墨水（无死体积）。
5. 使用相同的针头，将制备的细胞悬液装入注射器中（图3B）。
   注意:在注射器装载步骤中要格外小心，不要引入任何气泡。气泡会导致打印过程中不稳定。
6. 用27 G钝金属针代替装载针，该针将用于打印（图3C）。

4. 嵌入式3D打印

1. 使用参考软件设计要打印的结构（请参阅 材料表）。
   注意: 确保将打印结构的初始高度调整到 SHAPE 复合支撑的深度范围内。设计建议可在 图4A （螺旋和木桩设计）中找到。
2. 通过单击生成生成 G 代码。
3. 将装有细胞的玻璃注射器插入基于挤出的生物打印机上的容积式挤出头中（图3D）。
4. 通过单击"针头长度测量"来测量装有细胞的玻璃注射器的 针头长度。
5. 将装有SHAPE复合材料的微孔板或容器放在打印机上。
   注意:将细胞板或容器保持在4°C直至打印，以防止载体过早交联。
6. 通过单击 SHM（表面高度测量）测量加载SHAPE凝胶的同一微孔板或容器内空孔的表面高度。
   注意:或者，通过用针测量孔的高度来手动确定表面高度。
7. 将挤出速率设置为 3.6 μL/分钟，将进料速率设置为 0.3 mm/s。
   注意:确保在打印前测试挤出。细胞沉降会导致喷嘴堵塞，可以通过在实际嵌入印刷之前预先挤出少量体积或向容量注射器添加回缩体积来避免。在某些情况下，当针头插入或退出SHAPE凝胶时，进给速率需要保持在 0.5 mm / s以下 ，以避免墨水的拖曳。
8. 将 G 代码加载到打印机的用户界面中。
   注意:每次对设计结构进行更改时，都需要生成新的G代码。
9. 通过单击 "运行 "启动打印过程（图3G）。
10. 打印后立即将SHAPE凝胶在37°C的细胞培养箱中放置30分钟进行退火。
11. 在退火的SHAPE凝胶载体上轻轻添加生长培养基。
12. 第二天，用配制如下的分化培养基替换生长培养基:DMEM / F12与L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽与30mM葡萄糖，5μMHEPES，0.5%w / v富含脂质的牛血清蛋白，40μM L-丙氨酸，40μML-天冬酰胺一水合物，40μM L-天冬氨酸，40μM L-谷氨酸，40μML-脯氨酸，1%N2补充剂，1%青霉素链霉素，100μM二丁酰环磷酸腺苷（二丁酰-cAMP）， 和 2 ng/mL 神经胶质细胞系衍生的神经营养因子 （GDNF）。
    注意:确保在更换培养基期间不要损坏水凝胶。倾斜盘子，轻轻取出旧介质。将新鲜培养基滴加到含有凝胶的孔壁上，而不是直接添加到凝胶顶部。不要使用吸气器去除介质。
13. 每2天刷新一次分化培养基，直到实验终点。

5. 活细胞荧光成像

1. 从凝胶中除去多余的培养基。
2. 向支持凝胶的体积中加入等体积的20μM钙黄绿素AM（在储备溶液的分化培养基中稀释）。
3. 在37°C孵育40分钟。
4. 取出钙黄绿素AM溶液，并加入适量的新鲜分化培养基。
5. 将板转移到显微镜上进行成像。

6. 免疫细胞化学

1. 从凝胶中除去多余的培养基。
2. 使用小刮刀将凝胶转移到含有DPBS的较大容器中。
3. 用DPBS洗涤三次，每次20分钟，然后将盘子转移到通风橱中。
4. 取出DPBS，加入足够的4%甲醛溶液以覆盖凝胶，并在室温下孵育1小时。
5. 用DPBS洗涤三次，每次20分钟。
6. 在DPBS中制备由5%驴血清，0.25%洗涤剂和0.02%叠氮化钠组成的封闭溶液。
   注意:准备覆盖凝胶所需体积的三倍;稍后将用作一抗和二抗溶液的基础。
7. 用DPBS洗涤后，将封闭溶液加入凝胶中，并在室温下孵育6小时以防止非特异性结合。轻轻摇晃盘子。
8. 通过将TUBB3抗体以1:1，000的比例稀释在封闭溶液中来制备一抗溶液。
9. 从凝胶中取出封闭溶液，加入一抗溶液，并在4°C孵育48小时。 轻轻摇晃盘子。
10. 用DPBS洗涤三次，每次20分钟。
11. 通过在封闭溶液中稀释4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:1，000）和二抗（1:200）来制备二抗溶液。
12. 用DPBS洗涤后，将凝胶在4°C下在二抗溶液中孵育24小时。 轻轻摇晃盘子。
13. 用DPBS洗涤三次，每次20分钟，并在4°C下储存直至成像。
14. 成像前，用刮刀将染色凝胶转移到具有薄成像底部的培养皿或孔板上。

结果

海藻酸盐微 凝胶制备在 内部凝胶过程中通过剪切稀化然后进行机械碎裂，得到尺寸多分散且形状呈片状的藻酸盐微凝胶，如图 2G所示。这些不规则颗粒的直径范围从小于1μm到大约40μm。当紧密包装时，微粒形成透明的块状材料，仅比相应的细胞培养基略微不透明（图2F）。载体材料的透明度是该平台的一个重要方面，因为它允许在培养期间可视...

讨论

SHAPE复合材料方法为配制用于蜂窝油墨嵌入式3D打印的可退火和生物功能支撑浴提供了一种通用途径。虽然该协议提供了神经构建体3D打印的示例，但SHAPE工具箱可以很容易地适应与其他细胞来源的生物制造，以精确设计一系列目标组织类型。打印方法还将允许对多种细胞类型进行精确图案化，以研究它们的相互作用或设计具有细胞区室（例如神经元和神经胶质细胞）定义空间排列的组织。与传统?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253