Soporte compuesto de matriz extracelular de microgel para la impresión 3D integrada de construcciones neuronales humanas

Resumen

Este trabajo describe un protocolo para la impresión 3D incrustada de forma libre de células madre neurales dentro de compuestos de matriz extracelular de partículas recibles autocurables. El protocolo permite el patrón programable de construcciones de tejido neural humano interconectadas con alta fidelidad.

Resumen

La impresión 3D integrada de células dentro de un medio de soporte granular ha surgido en la última década como un enfoque poderoso para la biofabricación de forma libre de construcciones de tejidos blandos. Sin embargo, las formulaciones de gel granular se han restringido a un número limitado de biomateriales que permiten la generación rentable de grandes cantidades de micropartículas de hidrogel. Por lo tanto, los medios de soporte de gel granular generalmente han carecido de las funciones adhesivas e instructivas celulares que se encuentran en la matriz extracelular nativa (ECM).

Para abordar esto, se ha desarrollado una metodología para la generación de compuestos de matriz extracelular de partículas recleables autorreparables (SHAPE). Los compuestos SHAPE consisten en una fase granular (microgeles) y una fase continua (solución ECM viscosa) que, juntas, permiten tanto la impresión programable de alta fidelidad como un entorno extracelular biofuncional ajustable. Este trabajo describe cómo se puede utilizar la metodología desarrollada para la biofabricación precisa de construcciones neuronales humanas.

En primer lugar, las micropartículas de alginato, que sirven como componente granular en los compuestos SHAPE, se fabrican y combinan con un componente continuo a base de colágeno. Luego, las células madre neurales humanas se imprimen dentro del material de soporte, seguido del recocido del soporte. Las construcciones impresas se pueden mantener durante semanas para permitir la diferenciación de las células impresas en neuronas. Simultáneamente, la fase continua de colágeno permite el crecimiento axonal y la interconexión de regiones. Finalmente, este trabajo proporciona información sobre cómo realizar imágenes de fluorescencia de células vivas e inmunocitoquímica para caracterizar las construcciones neuronales humanas impresas en 3D.

Introducción

La impresión 3D precisa y programable de construcciones de hidrogel cargadas de células que imitan los tejidos blandos in vitro presenta un gran desafío. Por ejemplo, los intentos basados en la extrusión directa de hidrogeles blandos son inherentemente problemáticos, ya que las pobres propiedades mecánicas requeridas para recapitular el microambiente in vivo conducen a una falta de integridad estructural, deformaciones de las características predefinidas o el colapso completo de las estructuras fabricadas. Una solución convencional para este problema es imprimir un andamio de soporte a partir de un material biocompatible más rígido que permita que la construcción final mantenga su forma. Sin embargo, este enfoque limita en gran medida las posibilidades de diseño y requiere un cuidadoso ajuste reológico de las tintas adyacentes.

Para superar las limitaciones de la impresión 3D tradicional basada en extrusión capa por capa, la impresión 3D integrada ha surgido en los últimos años como una poderosa alternativa para la fabricación de materiales blandos y tejidos 1,2,3,4,5,6. En lugar de extruir la tinta en el aire ambiente sobre una superficie, la tinta se deposita directamente a través de una aguja de jeringa dentro de un baño de soporte que es sólido en reposo, pero se fluidiza reversiblemente alrededor de la punta de la aguja en movimiento para permitir la deposición precisa de material cargado de células blandas. El material depositado se mantiene en su lugar a medida que el soporte se resolidifica en la estela de la aguja. Como tal, la impresión 3D integrada permite la fabricación de forma libre de alta resolución de estructuras intrincadas a partir de biomateriales blandos con posibilidades de diseño ampliadas ^7,8.

Los geles granulares se han explorado ampliamente como materiales de baño de soporte para la impresión 3D integrada, ya que pueden formularse para exhibir transiciones suaves, localizadas y reversibles de sólido a líquido a bajas tensiones de rendimiento 9,10,11. Si bien muestran excelentes propiedades reológicas para la impresión de alta resolución, los geles granulares se han restringido a un puñado de biomateriales¹². La falta de diversidad en las formulaciones de gel granular, que es particularmente evidente si se considera la amplia gama de biomateriales disponibles para formulaciones de hidrogel a granel, se debe a la necesidad de generar una gran cantidad de microgeles utilizando químicos simples. Debido al limitado panorama biomaterial de los soportes de gel granular, el ajuste del microambiente extracelular proporcionado por el soporte de impresión presenta un desafío en el campo.

Recientemente, se ha desarrollado un enfoque modular para la generación de soportes de impresión 3D integrados, denominados compuestos de matriz extracelular de partículas recibles autorreparables (SHAPE)¹³. Este enfoque combina las distintas propiedades reológicas de los geles granulares con la versatilidad biofuncional de las formulaciones de hidrogel a granel. El soporte compuesto SHAPE presentado consiste en micropartículas de alginato empaquetadas (fase granular, fracción de volumen ~70%) con un espacio intersticial aumentado lleno de una solución de pregel ECM a base de colágeno viscoso (fase continua, fracción de volumen ~30%). Además, se ha demostrado que el soporte SHAPE facilita la deposición de alta resolución de células madre neurales humanas (hNSC) que, después del recocido del baño de soporte, pueden diferenciarse en neuronas y mantenerse durante semanas para alcanzar la maduración funcional. La impresión 3D integrada dentro del baño de soporte SHAPE supera algunas de las principales limitaciones relacionadas con las técnicas convencionales para la biofabricación de tejidos neuronales al tiempo que proporciona una plataforma versátil.

Este trabajo detalla los pasos para la impresión 3D embebida de hNSCs dentro del soporte SHAPE y su posterior diferenciación en neuronas funcionales (Figura 1). En primer lugar, las micropartículas de alginato se generan mediante cizallamiento durante la gelificación interna. Este enfoque permite la fácil generación de grandes volúmenes de micropartículas sin necesidad de equipos especializados y reactivos citotóxicos. Además, el alginato es una fuente de material ampliamente disponible y económica para la formación de sustratos de hidrogel biocompatibles para una amplia gama de tipos de células. Las micropartículas de alginato generadas se combinan con una solución de colágeno para formar el material de soporte compuesto SHAPE. Luego, las hNSC se cosechan y se cargan en una jeringa como una biotinta celular para la impresión 3D. Una bioimpresora 3D se utiliza para la impresión integrada basada en extrusión de hNSC dentro del compuesto SHAPE. Las células impresas en 3D se diferencian en neuronas para dar lugar a construcciones neuronales humanas espacialmente definidas y funcionales. Finalmente, el protocolo describe cómo se pueden caracterizar las construcciones de tejido generado utilizando imágenes de células vivas e inmunocitoquímica. Además, se proporcionan consejos para la optimización y la solución de problemas. En particular, tanto los componentes de la fase granular como la continua podrían intercambiarse con otras formulaciones de hidrogel para acomodar diferentes restos biofuncionales, propiedades mecánicas y mecanismos de reticulación, según lo requerido por otros tipos de células y tejidos más allá de las aplicaciones neuronales.

Protocolo

1. Preparación de los tampones y reactivos

1. Preparar el medio de crecimiento celular añadiendo los siguientes suplementos a DMEM/F12 con L-alanil-L-glutamina dipéptido: 30 mM de glucosa, 5 μM de HEPES, 0,5% p/v de albúmina sérica bovina rica en lípidos, 40 μM L-alanina, 40 μM L-asparagina monohidrato, 40 μM de ácido L-aspártico, 40 μM de ácido L-glutámico, 40 μM L-prolina, 1% de suplemento N2, 1% de penicilina-estreptomicina y 20 ng/L de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Realice estos pasos en un banco de flujo de aire laminar (LAF).
2. Preparar una solución de alginato al 1% p/v en agua ultrapura agitando vigorosamente durante 4 h a 60 °C. Filtre estéril la solución disuelta de alginato caliente con un filtro de 0,45 μm de tamaño de poro en un banco LAF. Almacénelo a 4 °C.
   NOTA: Si la temperatura de la solución de alginato es inferior a 60 °C, no será posible pasarla a través del filtro.
3. Prepare una solución de NaHCO₃ de 37 g/L en agua ultrapura. Ajuste el pH de la solución a 9,5 usando NaOH y esterilice el filtro en un banco LAF. Conservar la solución a 4 °C.

2. Preparación del material compuesto SHAPE

1. Generación de micropartículas de alginato
   1. Prepare una solución de CaCO₃ de 2 mg/ml en agua ultrapura en un vaso de precipitados estéril. Mezclar 1:1 con la solución de alginato, y remover durante 1 h a temperatura ambiente con un agitador magnético.
   2. Agregue ácido acético en una proporción de 1:500 y deje remover durante la noche a 650 rpm.
      NOTA: La solución de alginato comenzará a gelificarse inmediatamente. Asegúrese de utilizar un imán de agitación con la misma longitud que el diámetro de la cristalería utilizada para garantizar una agitación óptima y homogénea del gel formador. Al día siguiente, la solución generada por agitación durante la gelificación aparecerá viscosa (Figura 2A).
   3. Fragmentar mecánicamente la solución de alginato gelificado en micropartículas homogeneizándola a 15.000 rpm durante 10 min con un homogeneizador colocado en un banco LAF (Figura 2B).
   4. Centrifugar las micropartículas a 18.500 × g durante 20 min (Figura 2C) a temperatura ambiente.
   5. Desechar cuidadosamente el sobrenadante dentro del banco LAF, resuspender las partículas en DMEM que contiene 2 mM NaOH y 1% P/S, e incubar durante la noche a 4 °C (Figura 2D).
      NOTA: El color de la suspensión debe volver a rojo. Si la suspensión permanece amarilla, agregue NaOH gota a gota y mezcle hasta que se vuelva roja (Figura 2E).
   6. Homogeneizar las partículas a 15.000 rpm durante 3 min, y centrifugar a 18.500 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
   7. Observe el pellet (Figura 2F) y retire el sobrenadante con cuidado.
      NOTA: El pellet de micropartículas de alginato apretadas puede almacenarse a 4 °C hasta su uso posterior. Si la solución de alginato no fue esterilizada por filtro, las micropartículas deben usarse dentro de 1 semana.
2. Formulación compuesta SHAPE
   1. El día antes de la impresión, resuspender el pellet de micropartículas de alginato en el doble del volumen del medio de crecimiento que contiene 4% de HEPES (stock de 1 M) y 4% de solución de NaHCO₃ en un banco LAF, e incubarlo durante la noche a temperatura ambiente.
   2. Centrifugar la suspensión de microgel a 18.500 × g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
   3. Neutralizar el colágeno a mezclar con las micropartículas de alginato en un banco LAF. Diluir la solución madre de colágeno para alcanzar una concentración final de 1 mg/ml y neutralizarla añadiendo 4% de HEPES y 4% de NaHCO₃. Por ejemplo, para 3 ml de compuesto SHAPE, mezcle 2 ml de micropartículas de alginato con 1 ml de colágeno neutralizado (0,12 ml de HEPES, 0,12 ml de NaHCO₃, 0,16 ml de medio de crecimiento y 0,6 ml de colágeno).
      NOTA: Todos los materiales que se mezclan con colágeno deben manipularse en hielo para evitar la polimerización del colágeno. Tan pronto como se neutralice el colágeno, la polimerización comenzará lentamente.
   4. Genere el compuesto SHAPE mezclando el pellet de micropartículas de alginato con el colágeno diluido y neutralizado en una proporción de 2:1. Mezcle bien el gel pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo sobre hielo en un banco LAF.
      NOTA: No voreje, ya que esto introducirá burbujas en el material de soporte.
   5. En un banco LAF, transfiera el material compuesto generado a una placa de micropocillos enfriada o a cualquier recipiente de impresión adecuado, y utilícelo en un plazo de 30 minutos (Figura 3E, F).

3. Cultivo de hNSC y preparación de biotinta

1. Cultivar las células en un matraz T75 recubierto con extracto de membrana basal en medio de crecimiento. Pase las células al menos dos veces después de descongelarlas antes de usarlas para un experimento de impresión 3D.
2. Antes de imprimir, disociar las células enzimáticamente utilizando una solución de tripsina al 0,025% durante 5 min a 37 °C, neutralizar la tripsina con medio de crecimiento y centrifugar la suspensión celular a 400 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 2-3 ml de medio de crecimiento.
3. Realizar un recuento celular, centrifugar las células a 400 × g, y resuspender el pellet en medio de crecimiento suplementado con goma xantana al 0,1% (para evitar que las células sedimenten) a una concentración final de 9 × 10⁶ células/mL.
4. Utilice una aguja de metal romo de 21 G para cargar 100 μL de micropartículas de alginato apretadas en una jeringa (Figura 3A).
   NOTA: La creación de un tapón con las micropartículas de alginato tiene dos propósitos: ayuda a mantener la estabilidad de la extrusión durante la impresión y permite la extrusión completa de la tinta celular cargada (sin volumen muerto).
5. Con la misma aguja, cargue la suspensión celular preparada en la jeringa (figura 3B).
   NOTA: Tenga especial cuidado de no introducir burbujas de aire durante los pasos de carga de la jeringa. Las burbujas de aire causarán inestabilidades durante la impresión.
6. Reemplace la aguja de carga con una aguja de metal romo de 27 G, que se utilizará para imprimir (Figura 3C).

4. Impresión 3D integrada

1. Diseñe una estructura para imprimir utilizando el software al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Asegúrese de ajustar la altura inicial de la estructura impresa dentro de la profundidad del soporte compuesto SHAPE. Las sugerencias de diseño se pueden encontrar en la Figura 4A (diseños en espiral y pilas de madera).
2. Genere un G-Code haciendo clic en Generar.
3. Inserte la jeringa de vidrio cargada de células en un cabezal de extrusión volumétrica en una bioimpresora basada en extrusión (Figura 3D).
4. Mida la longitud de la aguja de la jeringa de vidrio cargada de células haciendo clic en Medición de la longitud de la aguja.
5. Coloque la placa o el recipiente de micropocillos cargado con el compuesto SHAPE en la impresora.
   NOTA: Mantenga la placa celular o el recipiente a 4 °C hasta la impresión para evitar la reticulación prematura del soporte.
6. Mida la altura de la superficie de un pozo vacío dentro de la misma placa o recipiente de micropocillos en el que se carga el gel SHAPE haciendo clic en SHM (medición de altura de superficie).
   NOTA: Alternativamente, determine la altura de la superficie manualmente midiendo la altura del pozo con la aguja.
7. Ajuste la velocidad de extrusión a 3,6 μL/min y la velocidad de avance a 0,3 mm/s.
   NOTA: Asegúrese de probar la extrusión antes de imprimir. La sedimentación celular puede causar obstrucción de la boquilla y puede evitarse preextruyendo un pequeño volumen antes de la impresión incrustada real o agregando un volumen de retracción a la jeringa volumétrica. En algunos casos, la velocidad de avance debe mantenerse por debajo de 0,5 mm/s cuando la aguja se inserta o sale del gel SHAPE para evitar el arrastre de la tinta.
8. Cargue el G-Code en la interfaz de usuario de la impresora.
   NOTA: Es necesario generar un nuevo código G cada vez que se realizan cambios en la estructura diseñada.
9. Inicie el procedimiento de impresión haciendo clic en Ejecutar (Figura 3G).
10. Inmediatamente después de la impresión, colocar el gel SHAPE a 37 °C en una incubadora de cultivo celular durante 30 minutos para recocido.
11. Agregue el medio de crecimiento suavemente sobre el soporte de gel SHAPE recocido.
12. Al día siguiente, sustituir el medio de cultivo por un medio de diferenciación formulado de la siguiente manera: DMEM/F12 con dipéptido L-alanil-L-glutamina con 30 mM de glucosa, 5 μM de HEPES, 0,5% p/v de albúmina sérica bovina rica en lípidos, 40 μM L-alanina, 40 μM L-asparagina monohidrato, 40 μM de ácido L-aspártico, 40 μM de ácido L-glutámico, 40 μM L-prolina, 1% de suplemento N2, 1% de penicilina-estreptomicina, 100 μM de dibutilril-adenosina monofosfato cíclico (dibutilil-cAMP), y factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF) de 2 ng/ml.
    NOTA: Asegúrese de no dañar el hidrogel durante los cambios de medio. Incline la placa y retire suavemente el medio viejo. Agregue un medio fresco gota a gota a la pared del pozo que contiene el gel en lugar de directamente encima del gel. No use un aspirador para extraer el medio.
13. Actualice el medio de diferenciación cada 2 días hasta el punto final experimental.

5. Imágenes de fluorescencia de células vivas

1. Retire el exceso de medio del gel.
2. Añadir un volumen igual de 20 μM Calcein AM (diluido en medio de diferenciación de la solución madre) al volumen del gel de soporte.
3. Incubar durante 40 min a 37 °C.
4. Retire la solución de Calcein AM y agregue un volumen apropiado de medio de diferenciación fresco.
5. Transfiera la placa al microscopio para obtener imágenes.

6. Inmunocitoquímica

1. Retire el exceso de medio del gel.
2. Usando una espátula pequeña, transfiera el gel a un recipiente más grande que contenga DPBS.
3. Lave tres veces durante 20 minutos cada vez con DPBS y transfiera la placa a una campana extractora.
4. Retire el DPBS, agregue suficiente solución de formaldehído al 4% para cubrir el gel e incube durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Lave tres veces con DPBS durante 20 minutos cada vez.
6. Prepare una solución de bloqueo que consiste en 5% de suero de burro, 0,25% de detergente y azida de sodio al 0,02% en DPBS.
   NOTA: Prepare tres veces el volumen necesario para cubrir el gel; Se utilizará más adelante como base para las soluciones de anticuerpos primarios y secundarios.
7. Después del lavado con DPBS, agregue la solución de bloqueo al gel e incube durante 6 h a temperatura ambiente para evitar una unión inespecífica. Mece el plato suavemente.
8. Preparar la solución de anticuerpos primarios diluyendo el anticuerpo TUBB3 en solución de bloqueo en una proporción de 1:1.000.
9. Retirar la solución bloqueante del gel, añadir la solución de anticuerpos primarios e incubar durante 48 h a 4 °C. Mece el plato suavemente.
10. Lave tres veces con DPBS durante 20 minutos cada vez.
11. Preparar la solución de anticuerpos secundarios diluyendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:1.000) y el anticuerpo secundario (1:200) en solución de bloqueo.
12. Después del lavado con DPBS, incubar el gel en la solución de anticuerpos secundarios durante 24 h a 4 °C. Mece el plato suavemente.
13. Lavar tres veces con DPBS durante 20 minutos cada vez y conservar a 4 °C hasta obtener imágenes.
14. Antes de la toma de imágenes, transfiera el gel manchado con una espátula a un plato o a un plato de pocillo con un fondo delgado de imágenes.

Resultados

La preparación de microgel de alginato a través del adelgazamiento por cizallamiento durante la gelificación interna seguida de fragmentación mecánica produce microgeles de alginato que son polidispersos en tamaño y forma de escamas como se ve en la Figura 2G. El tamaño de estas partículas irregulares varía de menos de 1 μm a aproximadamente 40 μm de diámetro. Cuando están apretadas, las micropartículas forman un material a granel transparente que es solo ligeramente m...

Discusión

El enfoque de material compuesto SHAPE proporciona una ruta versátil para la formulación de baños de soporte recocibles y biofuncionales para la impresión 3D incrustada de tintas celulares. Si bien este protocolo proporciona un ejemplo de la impresión 3D de construcciones neuronales, la caja de herramientas SHAPE podría adaptarse fácilmente a la biofabricación con otras fuentes celulares para la ingeniería precisa de una gama de tipos de tejidos objetivo. El enfoque de impresión también permitiría el patrón ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253