A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية لتوليد السايبريد من الخلايا السرطانية المعلقة كأداة لدراسة دور الميتوكوندريا في عملية الورم.

Abstract

في السنوات الأخيرة ، ارتفع عدد الدراسات المخصصة للتأكد من العلاقة بين الميتوكوندريا والسرطان بشكل كبير. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من الجهود لفهم العلاقة التي تنطوي على تغييرات في الميتوكوندريا وتكوين الأورام بشكل كامل ، وكذلك لتحديد الأنماط الظاهرية للميتوكوندريا المرتبطة بالورم. على سبيل المثال ، لتقييم مساهمة الميتوكوندريا في عمليات تكوين الأورام وورم خبيث ، من الضروري فهم تأثير الميتوكوندريا من الخلايا السرطانية في البيئات النووية المختلفة. لهذا الغرض ، يتمثل أحد الأساليب الممكنة في نقل الميتوكوندريا إلى خلفية نووية مختلفة للحصول على ما يسمى بالخلايا السايبريدية. في تقنيات cybridization التقليدية ، يتم إعادة ملء خط الخلية الذي يفتقر إلى mtDNA (ρ0 ، خلية مانحة نووية) بالميتوكوندريا المشتقة من الخلايا المنزوعة النواة أو الصفائح الدموية. ومع ذلك ، تتطلب عملية الاستئصال التصاق جيد للخلايا بلوحة المزرعة ، وهي ميزة تفقد جزئيا أو كليا في كثير من الحالات في الخلايا الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك صعوبة أخرى موجودة في الطرق التقليدية وهي تحقيق الإزالة الكاملة ل mtDNA الداخلي من خط الخلية المتلقي للميتوكوندريا للحصول على خلفيات الحمض النووي والميتوكوندريا النقية ، وتجنب وجود نوعين مختلفين من mtDNA في cybrid المتولد. في هذا العمل ، نقدم بروتوكول تبادل الميتوكوندريا المطبق على الخلايا السرطانية المعلقة النمو بناء على إعادة توطين الخلايا المعالجة مسبقا للرودامين 6G مع الميتوكوندريا المعزولة. تسمح لنا هذه المنهجية بالتغلب على قيود الأساليب التقليدية ، وبالتالي يمكن استخدامها كأداة لتوسيع فهم دور الميتوكوندريا في تطور السرطان وورم خبيث.

Introduction

إعادة برمجة استقلاب الطاقة هو السمة المميزة للسرطان1 التي لوحظت لأول مرة من قبل أوتو واربورغ في ثلاثينيات القرن العشرين2. في ظل الظروف الهوائية ، تقوم الخلايا الطبيعية بتحويل الجلوكوز إلى بيروفات ، والتي تولد بعد ذلك أسيتيل-CoA ، مما يغذي آلية الميتوكوندريا ويعزز التنفس الخلوي. ومع ذلك ، أظهر واربورغ أنه حتى في ظل الظروف المعيارية ، تقوم معظم الخلايا السرطانية بتحويل البيروفات التي تم الحصول عليها من عملية تحلل السكر إلى لاكتات ، وتحول طريقها للحصول على الطاقة. يعرف هذا التعديل الأيضي باسم "تأثير واربورغ" ويمكن بعض الخلايا السرطانية من توفير مطالبها النشطة للنمو السريع والانقسام ، على الرغم من توليد ATP بكفاءة أقل من الع....

Protocol

ملاحظة: يتم تحديد جميع وسائط الاستزراع والتراكيب العازلة في الجدول 1. قبل توليد السايبريد ، يجب كتابة كل من ملفات تعريف الحمض النووي للميتوكوندريا والنووية من خلايا المتبرع والمتلقي لتأكيد وجود اختلافات وراثية في كلا الجينومين بين خطوط الخلايا. في هذه الدراسة ، تم استخدام خط خلية L929 متاح تجاريا وخط الخلية المشتق منه ، L929dt ، والذي تم إنشاؤه تلقائيا في مختبرنا (انظر13 لمزيد من المعلومات). تقدم خطوط الخلايا هذه اختلافين في تسلسل جين mt-Nd2 الخاص بها والذي يمكن استخدامه لتأكيد نقاء mtDNA بمجرد الانتهاء من عملية التجسير13. في هذه الحالة ، تم تأكيد نقاء الخلفية النووية من خلال حساسية المضادات الح....

النتائج

بعد اتباع البروتوكول المقدم أعلاه ، يجب الحصول على خط خلية سايبريد متجانسة ذات خلفية نووية محفوظة ولكن مع نمط وراثي جديد للميتوكوندريا ، كما هو موضح في المخططات في الشكل 1 والشكل 2. يمكن تأكيد نقاء الحمض النووي والميتوكوندريا والنووي الموجود في الجابريدات ?.......

Discussion

منذ أن أفاد أوتو واربورغ أن الخلايا السرطانية تحول عملية التمثيل الغذائي وتحفز "تحلل السكر الهوائي"3,4 مع تقليل تنفس الميتوكوندريا ، نما الاهتمام بدور الميتوكوندريا في تحول السرطان وتطوره بشكل كبير. في السنوات الأخيرة ، تم افتراض الطفرات في mtDNA واختلال المي?.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من خلال المنحة رقم PID2019-105128RB-I00 إلى RSA و JMB و AA ، و PGC2018-095795-B-I00 إلى PFS و RML ، وكلاهما ممول من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 وأرقام المنح B31_20R (RSA و JMA و AA) و E35_17R (PFS و RML) وبتمويل من Gobierno de Aragón. وحظي عمل الرابطة بدعم من منحة من الرابطة الإسبانية لمكافحة الكانسر PRDAR21487SOLE. ويود المؤلفان أن يعربا عن تقديرهما لاستخدام الخدمة العامة للدعم والتحقيق في الأجهزة العليا للرقابة المالية، جامعة سرقسطة.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3500XL Genetic Analyzer ThermoFisher Scientific4406016
6-well plateCorning08-772-1B
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification KitThermoFisher Scientific4427368
Anode Buffer Container 3500 SeriesApplied Biosystems4393927
Boric acidPanReac131015
Bradford assayBiorad5000002
Cathode Buffer Container 3500 SeriesApplied Biosystems4408256
Cell culture flasksTPP90076
DMEM high glucoseGibco11965092
EDTAPanReac131026
Ethidium BromideSigma-AldrichE8751
GeneticinGibco10131027
Homogenizer Teflon pestleDeltalab196102
L929 cell lineATCCCCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel SystemBioRad1658004
MOPSSigma-AldrichM1254
PCR primersSigma-AldrichCustom products
Polyacrylamide Solution 30%PanReacA3626
Polyethylene glycolSigma-AldrichP7181
POP-7Applied Biosystems4393714
PyruvateSigma-AldrichP5280
QIAmp DNA Mini KitQiagen51306
Rhodamine-6GSigma-AldrichR4127
Serum Fetal BovineSigma-AldrichF7524
SspINew England BiolabsR3132
Streptomycin/penicillinPAN biotechP06-07100
SucroseSigma-AldrichS3089
TEMEDSigma-AldrichT9281
TrisPanReacP14030b
UridineSigma-AldrichU3750

References

  1. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  2. Wind, F., Warburg, O. H. . The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , (1930).
  3. Warburg, O.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved