جيل سايبريد ناقل الغضروف باستخدام خطوط الخلايا السرطانية

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية لتوليد السايبريد من الخلايا السرطانية المعلقة كأداة لدراسة دور الميتوكوندريا في عملية الورم.

Abstract

في السنوات الأخيرة ، ارتفع عدد الدراسات المخصصة للتأكد من العلاقة بين الميتوكوندريا والسرطان بشكل كبير. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من الجهود لفهم العلاقة التي تنطوي على تغييرات في الميتوكوندريا وتكوين الأورام بشكل كامل ، وكذلك لتحديد الأنماط الظاهرية للميتوكوندريا المرتبطة بالورم. على سبيل المثال ، لتقييم مساهمة الميتوكوندريا في عمليات تكوين الأورام وورم خبيث ، من الضروري فهم تأثير الميتوكوندريا من الخلايا السرطانية في البيئات النووية المختلفة. لهذا الغرض ، يتمثل أحد الأساليب الممكنة في نقل الميتوكوندريا إلى خلفية نووية مختلفة للحصول على ما يسمى بالخلايا السايبريدية. في تقنيات cybridization التقليدية ، يتم إعادة ملء خط الخلية الذي يفتقر إلى mtDNA (ρ⁰ ، خلية مانحة نووية) بالميتوكوندريا المشتقة من الخلايا المنزوعة النواة أو الصفائح الدموية. ومع ذلك ، تتطلب عملية الاستئصال التصاق جيد للخلايا بلوحة المزرعة ، وهي ميزة تفقد جزئيا أو كليا في كثير من الحالات في الخلايا الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك صعوبة أخرى موجودة في الطرق التقليدية وهي تحقيق الإزالة الكاملة ل mtDNA الداخلي من خط الخلية المتلقي للميتوكوندريا للحصول على خلفيات الحمض النووي والميتوكوندريا النقية ، وتجنب وجود نوعين مختلفين من mtDNA في cybrid المتولد. في هذا العمل ، نقدم بروتوكول تبادل الميتوكوندريا المطبق على الخلايا السرطانية المعلقة النمو بناء على إعادة توطين الخلايا المعالجة مسبقا للرودامين 6G مع الميتوكوندريا المعزولة. تسمح لنا هذه المنهجية بالتغلب على قيود الأساليب التقليدية ، وبالتالي يمكن استخدامها كأداة لتوسيع فهم دور الميتوكوندريا في تطور السرطان وورم خبيث.

Introduction

إعادة برمجة استقلاب الطاقة هو السمة المميزة للسرطان¹ التي لوحظت لأول مرة من قبل أوتو واربورغ في ثلاثينيات القرن العشرين². في ظل الظروف الهوائية ، تقوم الخلايا الطبيعية بتحويل الجلوكوز إلى بيروفات ، والتي تولد بعد ذلك أسيتيل-CoA ، مما يغذي آلية الميتوكوندريا ويعزز التنفس الخلوي. ومع ذلك ، أظهر واربورغ أنه حتى في ظل الظروف المعيارية ، تقوم معظم الخلايا السرطانية بتحويل البيروفات التي تم الحصول عليها من عملية تحلل السكر إلى لاكتات ، وتحول طريقها للحصول على الطاقة. يعرف هذا التعديل الأيضي باسم "تأثير واربورغ" ويمكن بعض الخلايا السرطانية من توفير مطالبها النشطة للنمو السريع والانقسام ، على الرغم من توليد ATP بكفاءة أقل من العملية الهوائية³،^4،5. في العقود الأخيرة ، دعمت العديد من الأعمال الآثار المترتبة على إعادة برمجة الأيض في تطور السرطان. وبالتالي ، تعتبر طاقة الورم هدفا مثيرا للاهتمام ضد السرطان¹. كمحور مركزي في التمثيل الغذائي النشط وفي توريد السلائف الأساسية ، تلعب الميتوكوندريا دورا رئيسيا في هذه التكيفات الخلوية التي ، حتى الآن ، نفهمها جزئيا فقط.

تماشيا مع ما سبق ، تم اقتراح طفرات الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) كأحد الأسباب المحتملة لإعادة البرمجة الأيضية هذه ، والتي يمكن أن تؤدي إلى ضعف أداء سلسلة نقل الإلكترون (ETC)⁶ وستفسر سبب تعزيز بعض الخلايا السرطانية لعملية التمثيل الغذائي للسكر للبقاء على قيد الحياة. في الواقع ، تم الإبلاغ عن أن mtDNA يتراكم الطفرات داخل الخلايا السرطانية ، حيث يوجد في 50٪ على الأقل من الأورام⁷. على سبيل المثال ، أفادت دراسة حديثة أجراها Yuan et al. بوجود جزيئات mtDNA مفرطة التحور والمقطوعة في سرطان الكلى والقولون والمستقيم والغدة الدرقية⁸. علاوة على ذلك ، أثبتت العديد من الأعمال أن بعض طفرات mtDNA مرتبطة بنمط ظاهري أكثر عدوانية للورم ومع زيادة في الإمكانات النقيلية للخلايا السرطانية⁹،10،11،12،13،¹⁴،^15،16.

على الرغم من الأهمية الواضحة لجينوم الميتوكوندريا في تطور السرطان ، فإن دراسة هذه الطفرات ومساهمتها في المرض كانت صعبة بسبب القيود في النماذج والتقنيات التجريبية المتاحة حاليا¹⁷. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة لفهم التأثير الحقيقي للحمض النووي للميتوكوندريا في تطور مرض السرطان وتطوره. في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا لتوليد cybrid transmitochondrial من الخلايا السرطانية المعلقة النمو ، استنادا إلى إعادة توطين خلايا الرودامين 6G المعالجة مسبقا مع الميتوكوندريا المعزولة ، والتي تتغلب على التحديات الرئيسية لطرق cybridization التقليدية^18,19. تسمح هذه المنهجية باستخدام أي متبرع بالنوى بغض النظر عن توفر خط الخلية ρ⁰ المقابل ونقل الميتوكوندريا من الخلايا التي ، باتباع التقنيات التقليدية ، سيكون من الصعب استئصالها (أي خطوط الخلايا غير الملتصقة).

Protocol

ملاحظة: يتم تحديد جميع وسائط الاستزراع والتراكيب العازلة في الجدول 1. قبل توليد السايبريد ، يجب كتابة كل من ملفات تعريف الحمض النووي للميتوكوندريا والنووية من خلايا المتبرع والمتلقي لتأكيد وجود اختلافات وراثية في كلا الجينومين بين خطوط الخلايا. في هذه الدراسة ، تم استخدام خط خلية L929 متاح تجاريا وخط الخلية المشتق منه ، L929dt ، والذي تم إنشاؤه تلقائيا في مختبرنا (انظر¹³ لمزيد من المعلومات). تقدم خطوط الخلايا هذه اختلافين في تسلسل جين mt-Nd2 الخاص بها والذي يمكن استخدامه لتأكيد نقاء mtDNA بمجرد الانتهاء من عملية التجسير¹³. في هذه الحالة ، تم تأكيد نقاء الخلفية النووية من خلال حساسية المضادات الحيوية ، لأنه على عكس خلايا L929dt ، كان L929 مقاوما للجيناتسين.

1. استنزاف الميتوكوندريا عن طريق علاج الرودامين 6G (الخلايا المتلقية)

ملاحظة: الخطوة الأولى لتوليد cybrid الناجح هي إلغاء وظائف الميتوكوندريا في الخلايا المتلقية بشكل كامل ولا رجعة فيه. لهذا الغرض ، من الضروري أن تحدد مسبقا ، لكل خط خلية ، التركيز المناسب ومدة العلاج باستخدام الرودامين 6G. يجب أن يكون هذا التركيز الكافي أقل بقليل من موت الخلايا الناجم عن المخدرات (أعلى مستوى لا يقتل الخلايا أثناء العلاج). قم بإجراء ما يلي بمجرد تحديد الظروف المثلى.

1. قم بزرع 10 6 خلايا في صفيحة ذات⁶ آبار باستخدام وسط استزراع كامل (انظر الجدول 1 للحصول على التفاصيل) ومعالجتها يوميا بالتركيز الأمثل للرودامين 6G لمدة 3-10 أيام ، اعتمادا على خط الخلية. تتراوح التركيزات التقليدية من 2 إلى 5 ميكروغرام / مل لمدة 3-10 أيام^20,21. في هذه الدراسة ، بالنسبة للخلايا المشتقة من L929 ، كان 2.5 ميكروغرام / مل رودامين 6G لمدة 7 أيام هو العلاج المختار^13،22.
2. للحفاظ على الخلايا على قيد الحياة ، استكمل وسط زراعة الخلايا ب 50 ميكروغرام / مل من اليوريدين و 100 ميكروغرام / مل من البيروفات وتجديده كل 24 ساعة.
3. بعد العلاج وقبل الانصهار ، قم بتغيير وسط الخلايا المعالجة بالرودامين 6G لإكمال وسط زراعة الخلايا بدون رودامين 6G ، واتركها في هذا الوسط لمدة 3-4 ساعات في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
   ملاحظة: التأثير السام للرودامين 6G لا رجعة فيه ، ويجب ألا تتعافى الخلايا ذات الميتوكوندريا غير الوظيفية²⁰. وهكذا ، بعد العلاج ، يجب أن تموت الخلايا التي لا تتلقى الميتوكوندريا الوظيفية حتى في وسط الثقافة المكمل باليوريدين. ولذلك، لا ينبغي أن يكون من الضروري اختيار الأسلحة النووية. ومع ذلك ، يوصى بدمج التحكم في الخلايا المعالجة بالرودامين 6G بدون الميتوكوندريا.

2. التوسع وعزل الميتوكوندريا (الخلايا المانحة)

1. قم بتوسيع الخلايا المانحة للميتوكوندريا خلال الفاصل الزمني لعلاج رودامين 6G للحصول على حوالي 25 × 10⁶ خلايا.
2. في اليوم السابع ، احصد الخلايا التي تنمو بشكل كبير في أنبوب سعة 50 مل واجمعها عن طريق الطرد المركزي عند 520 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). اغسل الخلايا 3 مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) وقم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي عند 520 × جم لمدة 5 دقائق في RT. من الآن فصاعدا ، قم بتنفيذ جميع خطوات استخراج الميتوكوندريا عند 4 درجات مئوية ، باستخدام الكواشف الباردة والحفاظ على الأنابيب مع الخلايا أو الميتوكوندريا على الجليد.
3. بعد الطرد المركزي الثالث ، تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط باستخدام ماصة زجاجية مقترنة بمضخة تفريغ وأعد تعليق الخلايا المعبأة في حجم مخزن مؤقت منخفض التوتر يساوي 7 أضعاف حجم حبيبات الخلية. ثم ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب خالط واترك الخلايا تنتفخ عن طريق احتضانها على الجليد لمدة 2 دقيقة.
4. كسر أغشية الخلايا عن طريق إجراء 8 إلى 10 ضربات في الخالط إلى جانب مدقة مدفوعة بمحرك تدور عند 600 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف خطوة اضطراب غشاء الخلية بين أنواع الخلايا. وبالتالي ، يجب تحسينه لكل نوع خلية.
5. أضف نفس الحجم من المخزن المؤقت مفرط التوتر إلى تعليق الخلية (7x حجم حبيبات الخلية) لتوليد بيئة متساوية التوتر.
6. انقل المجانس إلى أنبوب سعة 15 مل وطرده مركزيا في دوار ثابت عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، اجمع فقط 3/4 من المادة الطافية التي تترك هامشا كبيرا من الحبيبات ، لتجنب التلوث بالنوى أو الخلايا السليمة ، ونقلها إلى أنبوب آخر. كرر نفس العملية مرتين. لاحظ أنه يجب الاحتفاظ بالمادة الطافية والتخلص من الحبيبات.
7. احفظ جزء الميتوكوندريا (طاف). انقله إلى أنابيب 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي بأقصى سرعة (18000 × جم) لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
8. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات المخصبة بالميتوكوندريا بالمخزن المؤقت A ، مع الجمع بين محتوى الأنبوبين في أنبوب واحد والطرد المركزي في نفس الظروف الموضحة في الخطوة 2.7. كرر نفس العملية حتى تصبح جميع المواد في أنبوب واحد فقط.
9. قم بغسل إضافي باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A وحدد تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام اختبار برادفورد²³. لكل مقايسة cybridization ، يجب تحديد الكمية المثلى من الميتوكوندريا لإجراء النقل (في حالتنا ، تركيز يتراوح بين 10-40 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا لكل 10⁶ خلايا).
10. في الوقت نفسه ، قم بإعداد خلايا الرودامين 6G المعالجة مسبقا للاندماج عن طريق جمعها في أنبوب سعة 15 مل والطرد المركزي عند 520 × جم لمدة 5 دقائق في RT. لاحظ أن الحبيبات تكتسب لونا ورديا نيون بسبب علاج الرودامين 6G.
11. للتأكد من أن كلا من إلغاء وظيفة الميتوكوندريا في خلايا المستقبلات وكذلك تنقية العضيات من المتبرعين قد تم إجراؤها بشكل صحيح ، قم بزرع عدد صغير من الخلايا المعالجة بالرودامين 6G وعزل الميتوكوندريا باستخدام وسط الاستزراع الكامل في لوحة 6 آبار واستزراعها لمدة شهر للتحقق من عدم بقاء أي خلايا باقية في أي من الآبار (الشكل 2).
12. في موازاة ذلك ، قم بتقييم عدم وجود ملوثات النوى في جزء الميتوكوندريا عن طريق الكشف المناعي للبروتينات النووية (أي لامين بيتا ، هيستون H3 ، إلخ) أو عن طريق تضخيم تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) لجين نووي (أي SDH ، 18S rRNA ، إلخ).
    ملاحظة: لتجنب التلوث ، يوصى بتنفيذ جميع الخطوات في ظروف معقمة تعمل تحت غطاء التدفق الصفحي.

3. الانصهار وتوليد cybrid

1. للمضي قدما في الاندماج ، أضف بعناية 10⁶ من الخلايا المعالجة بالرودامين 6G إلى حبيبات الميتوكوندريا المعزولة (10-40 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا) وأجهزة الطرد المركزي عند 520 × جم لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا بالاختلاط مع الميتوكوندريا.
2. أضف 100 ميكرولتر من البولي إيثيلين جلايكول (PEG ، 50٪) وأعد تعليق الحبيبات برفق لمدة 30 ثانية. ثم اتركيه يرتاح دون أن يمسه أحد لمدة 30 ثانية أخرى.
3. أخيرا ، انقل المزيج إلى طبق مكون من 6 آبار مع وسط زراعة خلايا كاملة طازجة وضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. بعد بضعة أيام (عادة أسبوع واحد) ، يجب أن تبدأ cybrids transmitochondrial في النمو (الشكل 2) ، مما يؤدي إلى استنساخ يمكن اختياره بشكل فردي أو خلطه في بركة قبل تحليلها.

4. التحقق من كل من الخلفية الميتوكوندريا والنووية

ملاحظة: بمجرد إنشاء خط الخلية الجديد وتبدأ الخلايا في النمو بشكل كبير ، يجب التحقق من نقاء الحمض النووي للميتوكوندريا والنووي. وبالتالي ، يجب أن تحتوي خطوط الخلايا الأصلية على طفرات مختلفة أو تعدد أشكال داخل جينوماتها لجعلها قابلة للتمييز.

1. عزل الحمض النووي الكلي
   1. عزل الحمض النووي الجينومي لجميع خطوط الخلايا المستخدمة لتوليد cybrid عن طريق استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي التجارية (انظر جدول المواد) أو عن طريق تنفيذ بروتوكول قياسي باستخدام استخراج كحول الفينول - كلوروفورم - إيزو أميل وترسيب^{الكحول 24}.
2. تقييم mtDNA (الشكل 3)
   ملاحظة: يمكن إجراء العديد من التقنيات ، مثل التسلسل ، أو تحليل تعدد الأشكال بطول جزء التقييد (RFLP) ، أو qPCR الخاص بالأليل ، لتحليل نقاء mtDNA. للتأكد من وجود اختلافات تسلسل mtDNA بواسطة RFLP ، اتبع خطوات البروتوكول التالية.
   1. تضخيم جزء mtDNA يحتوي على تغيير النوكليوتيدات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
      1. هنا ، تقدم خلايا L929dt طفرة mtDNA في الموضع 4206 ، داخل جين mt-Nd2 (m.4206C >T) الغائب في خلايا L929. لتأكيد وجود هذا الاستبدال في cybrids transmitochondrial ، قم بتضخيم جزء 397 bp بواسطة PCR باستخدام بروتوكول قياسي والبادئات التالية: 1) 5'-AAGCTATCGGG
         CCCATACCCCG-3 '(المواضع 3862-3884) و 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (المواضع 4236-4258).
   2. تحليل وجود استبدال النوكليوتيدات المطلوب بواسطة RFLP ، باستخدام نوكلياز داخلي محدد يتعرف على تغيير التسلسل ويولد نمط قطع مختلف لكلا خطي الخلية.
      ملاحظة: عند وجود متغير mtDNA L929dt (4206T) ، يحتوي amplicon الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.2.1 على موقعين تقييد ل SspI (انظر جدول المواد) ينتج ثلاثة أجزاء من الحمض النووي من 306 bp و 52 bp و 39 bp. يتم تعطيل موقع التقييد الذي يولد النطاقين 52 و 39 عند وجود الإصدار C4206 من النوع البري (WT) ، ويظهر نطاق جديد من 91 نقطة أساس. لذلك ، يتم تضمين الرقابة الداخلية للهضم الكامل ل SspI في التحليل. يتم إجراء تفاعل الهضم عند 37 درجة مئوية ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   3. افصل شظايا التقييد عن طريق الرحلان الكهربائي وقارن نمط الشريط.
      1. بمجرد إجراء عملية الهضم ، قم بتحليل شظايا التقييد التي تم الحصول عليها عن طريق الرحلان الكهربائي في 10٪ من المواد الهلامية بولي أكريلاميد-تريس-بورات-EDTA (TBE) (انظر الجدول 1 لتكوين 1x TBE). قم بتشغيل الكهربائي عند 80 فولت لمدة 1 ساعة في RT. تصور شظايا الحمض النووي بعد تلطيخ الهلام في محلول بروميد الإيثيديوم في 1x TBE لمدة 15 دقيقة في RT (انظر الجدول 1 لتكوين محلول تلطيخ الهلام).
3. التنميط الجيني للحمض النووي النووي
   ملاحظة: يجب إجراء التنميط الجيني للحمض النووي النووي باستخدام عينة استخراج الحمض النووي السابقة المستخدمة في تحليل RFLP.
   1. تضخيم 16 موقعا (D21S11 وCSF1PO وvWA و D8S1179 وTH01 وD18S51 وD5S818 و D16S539 و D3S1358 و D2S1338 و TPOX و FGA و D7S820 و D13S317 و D19S433 و AMEL) باستخدام مجموعة من قليل النيوكليوتيدات الخاصة بالتجارة (انظر جدول المواد).
   2. إجراء الكهربائي باستخدام محلل وراثي من أجل فصل الشظايا التي تم الحصول عليها مسبقا.
      ملاحظة: بمجرد تضخيمها ، يتم تحليل المواضع المختلفة عن طريق الرحلان الكهربائي باستخدام نظام شعري (انظر جدول المواد). يتم فصل الشظايا في شعري بطول 50 سم مملوء ببوليمر تجاري. تتوفر أيضا مخازن الكاثود والأنود تجاريا ، كما هو موضح في جدول المواد. يتم إجراء الرحلان الكهربائي عند 19.5 كيلو فولت لمدة 20 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
   3. استخدم أدوات المعلوماتية الحيوية لتحديد الأليلات المقابلة لكل موضع تضخيم (انظر جدول المواد).
   4. قارن البيانات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.3.3 مع قاعدة بيانات ملف تعريف الحمض النووي النووي (الجدول 1) ، للتحقق مما إذا كان ملف تعريف الحمض النووي النووي يتطابق مع ملف تعريف خط خلية مستقبلات الميتوكوندريا (الشكل 4).

النتائج

بعد اتباع البروتوكول المقدم أعلاه ، يجب الحصول على خط خلية سايبريد متجانسة ذات خلفية نووية محفوظة ولكن مع نمط وراثي جديد للميتوكوندريا ، كما هو موضح في المخططات في الشكل 1 والشكل 2. يمكن تأكيد نقاء الحمض النووي والميتوكوندريا والنووي الموجود في الجابريدات ?...

Discussion

منذ أن أفاد أوتو واربورغ أن الخلايا السرطانية تحول عملية التمثيل الغذائي وتحفز "تحلل السكر الهوائي"^3,4 مع تقليل تنفس الميتوكوندريا ، نما الاهتمام بدور الميتوكوندريا في تحول السرطان وتطوره بشكل كبير. في السنوات الأخيرة ، تم افتراض الطفرات في mtDNA واختلال المي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750