Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica para geração de cybrid a partir de células cancerosas em crescimento em suspensão como uma ferramenta para estudar o papel das mitocôndrias no processo tumorigênico.

Resumo

Nos últimos anos, o número de estudos dedicados a determinar a ligação entre mitocôndrias e câncer aumentou significativamente. No entanto, mais esforços ainda são necessários para compreender completamente a ligação envolvendo alterações nas mitocôndrias e tumorigênese, bem como para identificar fenótipos mitocondriais associados ao tumor. Por exemplo, para avaliar a contribuição das mitocôndrias nos processos de tumorigênese e metástases, é essencial entender a influência das mitocôndrias de células tumorais em diferentes ambientes nucleares. Para isso, uma possível abordagem consiste em transferir mitocôndrias para um fundo nuclear diferente para obter as chamadas células cybrid. Nas técnicas tradicionais de cibridização, uma linhagem celular sem mtDNA (ρ⁰, célula doadora nuclear) é repovoada com mitocôndrias derivadas de células enucleadas ou plaquetas. No entanto, o processo de enucleação requer boa adesão celular à placa de cultura, característica que é parcial ou completamente perdida em muitos casos em células invasivas. Além disso, outra dificuldade encontrada nos métodos tradicionais é conseguir a remoção completa do mtDNA endógeno da linhagem celular receptora mitocondrial para obter fundos de DNA nuclear e mitocondrial puro, evitando a presença de duas espécies diferentes de mtDNA no cybrid gerado. Neste trabalho, apresentamos um protocolo de troca mitocondrial aplicado a células cancerosas em crescimento em suspensão, baseado na repopulação de células pré-tratadas com rodamina 6G com mitocôndrias isoladas. Esta metodologia permite superar as limitações das abordagens tradicionais e, assim, pode ser utilizada como uma ferramenta para ampliar a compreensão do papel mitocondrial na progressão e metástase do câncer.

Introdução

A reprogramação do metabolismo energético é uma marca do câncer¹ que foi observada pela primeira vez por Otto Warburg na década de 1930². Em condições aeróbicas, as células normais convertem a glicose em piruvato, que gera acetil-coA, alimentando a maquinaria mitocondrial e promovendo a respiração celular. No entanto, Warburg demonstrou que, mesmo sob condições normóxicas, a maioria das células cancerosas converte piruvato obtido do processo de glicólise em lactato, mudando seu caminho para obter energia. Esse ajuste metabólico é conhecido como "efeito Warburg" e permite que algumas células cancerosas suprim suas demandas energéticas de rápido crescimento e divisão, apesar de gerarem ATP de forma menos eficiente que o processo aeróbio ^3,4,5. Nas últimas décadas, numerosos trabalhos têm apoiado a implicação da reprogramação metabólica na progressão do câncer. Assim, a energética tumoral é considerada um alvo interessante contra o^câncer1. Como um centro central no metabolismo energético e no fornecimento de precursores essenciais, as mitocôndrias desempenham um papel fundamental nessas adaptações celulares que, até o momento, compreendemos apenas parcialmente.

Em consonância com o exposto, mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) têm sido propostas como uma das possíveis causas dessa reprogramação metabólica, o que poderia levar a um comprometimento do desempenho da cadeia de transporte de elétrons (ETC)⁶ e explicaria por que algumas células cancerosas melhoram seu metabolismo glicolítico para sobreviver. De fato, tem sido relatado que o mtDNA acumula mutações dentro das células cancerosas, estando presente em pelo menos 50% dos^tumores7. Por exemplo, um estudo recente realizado por Yuan e col. relatou a presença de moléculas hipermutadas e truncadas do mtDNA em cânceres de rim, colorretal e tireoide⁸. Além disso, muitos trabalhos têm demonstrado que certas mutações no mtDNA estão associadas a um fenótipo tumoral mais agressivo e a um aumento no potencial metastático de células cancerígenas9,10,11,12,13,14,15,16.

Apesar da aparente relevância do genoma mitocondrial na progressão do câncer, o estudo dessas mutações e sua contribuição para a doença têm sido desafiadores devido às limitações dos modelos experimentais e tecnologias atualmente^{disponíveis17}. Assim, novas técnicas para entender o real impacto do DNA mitocondrial no desenvolvimento e progressão da doença oncológica são necessárias. Neste trabalho, apresentamos um protocolo para geração de cibridos transmitocondriais a partir de células cancerosas em suspensão, baseado na repopulação de células pré-tratadas com rodamina 6G com mitocôndrias isoladas, que supera os principais desafios dos métodos tradicionais de cibridização^18,19. Essa metodologia permite o uso de qualquer doador de núcleos independentemente da disponibilidade de sua linhagem celular ρ⁰ correspondente e a transferência de mitocôndrias de células que, seguindo as técnicas tradicionais, seriam difíceis de enuclear (i.e., linhagens celulares não aderentes).

Protocolo

NOTA: Todos os meios de cultura e composições de buffer são especificados na Tabela 1. Antes da geração do cybrid, os perfis de DNA mitocondrial e nuclear das células doadoras e receptoras devem ser tipados para confirmar a presença de diferenças genéticas em ambos os genomas entre as linhagens celulares. Neste estudo, uma linhagem celular L929 comercialmente disponível e sua linhagem celular derivada, L929dt, que foi gerada espontaneamente em nosso laboratório (ver¹³ para mais informações) foram usadas. Essas linhagens celulares apresentam duas diferenças na sequência de seu gene mt-Nd2 que podem ser usadas para confirmar a pureza do mtDNA uma vez terminado o processo de cibridização¹³. Neste caso, a pureza do fundo nuclear foi confirmada pela sensibilidade aos antibióticos, uma vez que, ao contrário das células L929dt, as L929 foram resistentes à geneticina.

1. Depleção mitocondrial pelo tratamento com rodamina 6G (células receptoras)

NOTA: O primeiro passo para a geração bem sucedida de cybrid é abolir completa e irreversivelmente as funções mitocondriais nas células receptoras. Para isso, é necessário determinar previamente, para cada linhagem celular, a concentração adequada e a duração do tratamento com rodamina 6G. Essa concentração adequada deve estar logo abaixo da morte celular induzida por drogas (a mais alta que não mata as células durante o tratamento). Execute o seguinte assim que as condições ideais forem definidas.

1. Semear¹⁰ 6 células em uma placa de 6 poços usando meio de cultura completo (ver Tabela 1 para detalhes) e tratá-las diariamente com a concentração ideal de rodamina 6G por 3-10 dias, dependendo da linhagem celular. As concentrações tradicionais variam de 2 a 5 μg/mL por 3-10 dias^20,21. Neste estudo, para células derivadas de L929, 2,5 μg/mL de rodamina 6G por 7 dias foi o tratamento selecionado^13,22.
2. Para manter as células vivas, complementar o meio de cultura celular com 50 μg/mL de uridina e 100 μg/mL de piruvato e renová-lo a cada 24 h.
3. Após o tratamento e antes da fusão, trocar o meio de células tratadas com rodamina 6G para completar o meio de cultura celular sem rodamina 6G, e deixá-las neste meio por 3-4 h em estufa a 37 °C com 5% de CO₂.
   OBS: O efeito tóxico da rodamina 6G é irreversível, e células com mitocôndrias não funcionais não devem se recuperar²⁰. Assim, após o tratamento, as células que não recebem mitocôndrias funcionais devem morrer mesmo em meio de cultura suplementado com uridina. Portanto, nenhuma seleção nuclear deve ser necessária. No entanto, recomenda-se uma fusão controle de células tratadas com rodamina 6G sem mitocôndrias.

2. Expansão e isolamento mitocondrial (células doadoras)

1. Expandir as células doadoras mitocondriais durante o lapso de tempo do tratamento com rodamina 6G para obter cerca de 25 x 10⁶ células.
2. No dia 7, colher células de crescimento exponencial em um tubo de 50 mL e coletá-las por centrifugação a 520 x g por 5 min à temperatura ambiente (TR). Lavar as células 3x com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) e sedimentá-las por centrifugação a 520 x g por 5 min em RT. A partir de agora, execute todas as etapas da extração mitocondrial a 4 °C, usando reagentes frios e mantendo os tubos com células ou mitocôndrias sobre gelo.
3. Após a terceira centrifugação, descartar o sobrenadante por aspiração utilizando pipeta de vidro acoplada a uma bomba de vácuo e ressuspender as células empacotadas em um volume de tampão hipotônico igual a 7x o volume da pastilha celular. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo homogeneizador e deixe as células incharem incubando-as no gelo por 2 min.
4. Quebre as membranas celulares realizando de 8 a 10 golpes no homogeneizador acoplado a um pilão acionado por motor girando a 600 rpm.
   NOTA: A etapa de ruptura da membrana celular pode variar entre os tipos celulares; assim, ele tem que ser otimizado para cada tipo de célula.
5. Adicione o mesmo volume de tampão hipertônico à suspensão celular (7x o volume da pastilha celular) para gerar um ambiente isotônico.
6. Transferir o homogeneizado para um tubo de 15 mL e centrifuga-lo em um rotor fixo a 1.000 x g por 5 min a 4 °C. Em seguida, colete apenas 3/4 do sobrenadante deixando uma grande margem do pellet, para evitar contaminação com núcleos ou células intactas, e transfira-o para outro tubo. Repita o mesmo processo duas vezes. Observe que o sobrenadante deve ser mantido e o pellet descartado.
7. Salve a fração mitocondrial (sobrenadante). Transferir para tubos de 1,5 ml e centrifugar à velocidade máxima (18.000 x g) durante 2 min a 4 °C.
8. Eliminar o sobrenadante e lavar o pellet enriquecido com mitocôndrias com tampão A, combinando o conteúdo dos dois tubos num só e centrifugando nas mesmas condições descritas no passo 2.7. Repita o mesmo processo até que todo o material esteja em apenas um tubo.
9. Realizar uma lavagem adicional com 300 μL de tampão A e quantificar a concentração de proteínas mitocondriais utilizando o ensaio de Bradford²³. Para cada ensaio de cibridização, a quantidade ideal de mitocôndrias para o procedimento de transferência deve ser determinada (no nosso caso, uma concentração entre 10-40 μg de proteína mitocondrial por 10^{a 6} células).
10. Simultaneamente, prepare as células pré-tratadas com rodamina 6G para a fusão, coletando-as em um tubo de 15 mL e centrifugando a 520 x g por 5 min na RT. Observe que o pellet adquire uma cor rosa neon devido ao tratamento com rodamina 6G.
11. Para garantir que tanto a abolição da função mitocondrial nas células receptoras quanto a purificação da organela dos doadores tenham sido realizadas adequadamente, semeie um pequeno número de células tratadas com rodamina 6G e isole mitocôndrias usando o meio de cultura completo em uma placa de 6 poços e cultive-as por um mês para verificar se nenhuma célula sobrevivente permanece em nenhum dos poços (Figura 2).
12. Em paralelo, avaliar a ausência de contaminantes nucleares na fração mitocondrial por imunodetecção de proteínas nucleares (i.e., lamina beta, histona H3, etc.) ou por amplificação quantitativa por reação em cadeia da polimerase (qPCR) de um gene nuclear (i.e., SDH, 18S rRNA, etc.).
    OBS: Para evitar contaminações, recomenda-se realizar todas as etapas em condições assépticas trabalhando sob uma capela de fluxo laminar.

3. Fusão e geração de cybrid

1. Para prosseguir com a fusão, adicione cuidadosamente 10⁶ das células tratadas com rodamina 6G à pastilha mitocondrial isolada (10-40 μg de proteína mitocondrial) e centrifugar a 520 x g por 5 min para permitir que as células se misturem com as mitocôndrias.
2. Adicionar 100 μL de polietilenoglicol (PEG, 50%) e ressuspender suavemente o pellet por 30 s. Em seguida, deixe descansar intocado por mais 30 s.
3. Finalmente, transfira a mistura para uma placa de 6 poços com meio de cultura de células completo fresco e coloque na incubadora a 37 °C com 5% de CO₂. Após alguns dias (geralmente 1 semana), os cybrids transmitocondriais devem começar a crescer (Figura 2), dando origem a clones que podem ser selecionados individualmente ou misturados em um pool antes de sua análise.

4. Verificação do fundo mitocondrial e nuclear

NOTA: Uma vez que a nova linhagem celular foi estabelecida e as células começam a crescer exponencialmente, a pureza de seus DNAs mitocondriais e nucleares deve ser verificada. Assim, as linhagens celulares originais devem abrigar diferentes mutações ou polimorfismos dentro de seus genomas para torná-las reconhecíveis.

1. Isolamento total do DNA
   1. Isolar o DNA genômico de todas as linhagens celulares usadas para geração de cybrid empregando um kit comercial de extração de DNA genômico (ver Tabela de Materiais) ou realizando um protocolo padrão usando extração de álcool fenol-clorofórmio-isoamílico e precipitação de álcool²⁴.
2. Avaliação do mtDNA (Figura 3)
   NOTA: Várias técnicas, tais como sequenciamento, análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) ou qPCR alelo-específico, podem ser realizadas para analisar a pureza do mtDNA. Para confirmar a presença de variações na sequência do mtDNA por RFLP, siga os próximos passos do protocolo.
   1. Amplificar um fragmento de mtDNA contendo a alteração nucleotídica por PCR.
      1. Aqui, as células L929dt apresentam uma mutação do mtDNA na posição 4206, dentro de um gene mt-Nd2 (m.4206C>T) que está ausente nas células L929. Para confirmar a presença desta substituição nos cíbridos transocondriais, amplificar um fragmento de 397 pb por PCR usando um protocolo padrão e os seguintes primers: 1) 5'-AAGCTATCGGG
         CCCATACCCCG-3' (posições 3862-3884) e 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posições 4236-4258).
   2. Analisar a presença da substituição nucleotídica desejada por RFLP, utilizando uma endonuclease específica que reconhece a mudança de sequência e gera um padrão de corte diferente para ambas as linhagens celulares.
      NOTA: Quando a variante L929dt mtDNA está presente (4206T), o amplicon obtido na etapa 4.2.1 contém dois sítios de restrição para SspI (ver Tabela de Materiais) que produz três fragmentos de DNA de 306 pb, 52 pb e 39 pb. O site de restrição que gera as bandas 52 e 39 é interrompido quando a versão wild-type (WT) C4206 está presente e uma nova banda de 91 bp aparece. Portanto, um controle interno para digestão completa para SspI é incluído na análise. A reação de digestão é realizada a 37 °C, seguindo as instruções do fabricante.
   3. Separe os fragmentos de restrição por eletroforese e compare o padrão de banda.
      1. Uma vez realizada a digestão, analisar os fragmentos de restrição obtidos por eletroforese em géis de poliacrilamida-Tris-borato-EDTA (TBE) a 10% (ver Tabela 1 para composição de 1x TBE). Executar a eletroforese a 80 V por 1 h na RT. Visualize os fragmentos de DNA após a coloração em gel em uma solução de brometo de etídio em 1x TBE por 15 min em RT (ver Tabela 1 para composição da solução de coloração em gel).
3. Genotipagem do DNA nuclear
   NOTA: A genotipagem do DNA nuclear deve ser realizada usando a amostra de extração de DNA anterior empregada para análise de RFLP.
   1. Amplifique 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 e AMEL) usando um pool de oligonucleotídeos específicos comerciais (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Realizar eletroforese utilizando analisador genético para separar os fragmentos previamente obtidos.
      NOTA: Uma vez amplificados, os diferentes loci são analisados por eletroforese usando um sistema capilar (ver Tabela de Materiais). Os fragmentos são separados em um capilar de 50 cm de comprimento preenchido com um polímero comercial. Tampões catódicos e anódicos também estão disponíveis comercialmente, como mostrado na Tabela de Materiais. A eletroforese é realizada a 19,5 kV por 20 min a 60 °C.
   3. Use ferramentas bioinformativas para determinar os alelos correspondentes a cada locus amplificado (ver Tabela de Materiais).
   4. Comparar os dados obtidos na etapa 4.3.3 com o banco de dados de perfil de DNA nuclear (Tabela 1), para verificar se o perfil de DNA nuclear coincide com o perfil de linhagem celular do receptor mitocondrial (Figura 4).

Resultados

Após seguir o protocolo acima apresentado, deve-se obter uma linhagem celular homoplasmática cybrid com fundo nuclear conservado, mas com um novo genótipo mitocondrial, conforme representado nos esquemas da Figura 1 e Figura 2. A pureza do DNA mitocondrial e nuclear presente nos cibrídeos pode ser confirmada por RFLP, como mostrado na Figura 3, e pela análise de genotipagem do DNA nuclear, como mostrado na ...

Discussão

Desde que Otto Warburg relatou que as células cancerosas alteram seu metabolismo e potencializam a "glicólise aeróbica"^3,4 enquanto reduzem a respiração mitocondrial^, o interesse no papel das mitocôndrias na transformação e progressão do câncer tem crescido exponencialmente. Nos últimos anos, mutações no mtDNA e disfunção mitocondrial têm sido postuladas como características de muitos tipos de^câncer25. Até o momento, num...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750