암 세포주를 이용한 트랜스미토콘드리아 Cybrid 생성

요약

이 프로토콜은 종양 형성 과정에서 미토콘드리아의 역할을 연구하기 위한 도구로서 현탁액 성장 암세포에서 사이브리드를 생성하는 기술을 설명합니다.

초록

최근 몇 년 동안 미토콘드리아와 암 사이의 연관성을 확인하는 데 전념하는 연구의 수가 크게 증가했습니다. 그러나 미토콘드리아와 종양 형성의 변화와 관련된 연관성을 완전히 이해하고 종양 관련 미토콘드리아 표현형을 식별하기 위해서는 여전히 더 많은 노력이 필요합니다. 예를 들어, 종양 형성 및 전이 과정에서 미토콘드리아의 기여도를 평가하려면 다양한 핵 환경에서 종양 세포에서 미토콘드리아의 영향을 이해하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 가능한 한 가지 접근법은 미토콘드리아를 다른 핵 배경으로 전달하여 소위 사이브리드 세포를 얻는 것입니다. 전통적인 사이브리드화 기술에서, mtDNA가 결여된 세포주(^ρ0, 핵 공여 세포)는 적출된 세포 또는 혈소판에서 유래된 미토콘드리아로 다시 채워집니다. 그러나, 적출 과정은 배양 플레이트에 대한 양호한 세포 부착을 필요로 하며, 이는 침습성 세포에서 많은 경우에 부분적으로 또는 완전히 손실되는 특징이다. 또한, 전통적인 방법에서 발견되는 또 다른 어려움은 생성된 사이브리드에서 두 개의 상이한 mtDNA 종의 존재를 피하면서, 순수한 핵 및 미토콘드리아 DNA 배경을 얻기 위해 미토콘드리아-수용자 세포주로부터 내인성 mtDNA의 완전한 제거를 달성하는 것이다. 이 연구에서 우리는 분리된 미토콘드리아로 로다민 6G 전처리된 세포의 재증식을 기반으로 현탁액 성장 암세포에 적용되는 미토콘드리아 교환 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론을 통해 우리는 전통적인 접근 방식의 한계를 극복할 수 있으므로 암 진행 및 전이에서 미토콘드리아 역할에 대한 이해를 확장하는 도구로 사용할 수 있습니다.

서문

에너지 대사를 재프로그래밍하는^것은 1930년대 오토 바르부르크(Otto Warburg)가 처음으로 관찰한 암의 특징이다². 호기성 조건에서 정상 세포는 포도당을 피루브산으로 전환한 다음 아세틸-coA를 생성하여 미토콘드리아 기계에 연료를 공급하고 세포 호흡을 촉진합니다. 그럼에도 불구하고 Warburg는 정상 산소 조건에서도 대부분의 암세포가 해당 과정에서 얻은 피루브산을 젖산으로 전환하여 에너지를 얻는 방법을 전환한다는 것을 입증했습니다. 이러한 대사 조절은 "바르부르크 효과"로 알려져 있으며, 일부 암세포는 호기성 과정보다 덜 효율적으로 ATP를 생성함에도 불구하고 빠른 성장과 분열에 대한 에너지 요구를 공급할 수 있습니다 ^3,4,5. 최근 수십 년 동안 수많은 연구가 암 진행에서 신진대사 재프로그래밍의 의미를 뒷받침했습니다. 따라서 종양 에너지학은 암에 대한 흥미로운 표적으로 간주됩니다¹. 에너지 대사와 필수 전구체 공급의 중심 허브인 미토콘드리아는 현재까지 우리가 부분적으로만 이해하고 있는 이....

프로토콜

참고: 모든 배양 배지 및 완충액 조성은 표 1에 명시되어 있습니다. 사이브리드 생성 전에 기증자와 수용자 세포의 미토콘드리아 및 핵 DNA 프로파일을 모두 입력하여 세포주 간의 두 게놈에 유전적 차이가 있는지 확인해야 합니다. 본 연구에서는 상업적으로 이용 가능한 L929 세포주와 그 유래 세포주인 L929dt를 사용하였는데, 이는 본 연구실에서 자발적으로 생성되었다(자세한 내용은¹³ 참조). 이들 세포주는 mt-Nd2 유전자의 염기서열에 두 가지 차이점을 나타내는데, 이는 시브리드화 과정이 끝나면 mtDNA의 순도를 확인하는 데 사용할 수 있다¹³. 이 경우, L929dt 세포와는 달리, L929는 유전 제네신에 내성이 있었기 때문에 핵 배경의 순도는 항생제 감수성에 의해 확인되었다.

1. 로다민 6G 처리에 의한 미토콘드리아 고갈(수용자 세포)

참고: 성공적인 사이브리드 생성을 위한 첫 번째 단계는 수용자 세포에서 미토콘드리아 기능을 완전하고 비가역적으로 폐지하는 것입니다. 이를 위해 각 세포주에 대해 로다 민 6G로 적절한 농도와....

토론

오토 바르부르크(Otto Warburg)가 암세포가 미토콘드리아 호흡을 감소시키면서 신진대사를 변화시키고 "호기성 해당^작용(aerobic glycolysis)"^3,4을 강화한다고 보고한 이후^, 암 변형과 진행에서 미토콘드리아의 역할에 대한 관심이 기하급수적으로 증가했습니다. 최근 몇 년 동안, mtDNA의 돌연변이와 미토콘드리아 기능 장애는 많은 암 유형의 특징으로 가정되었?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750