암 세포주를 이용한 트랜스미토콘드리아 Cybrid 생성

요약

이 프로토콜은 종양 형성 과정에서 미토콘드리아의 역할을 연구하기 위한 도구로서 현탁액 성장 암세포에서 사이브리드를 생성하는 기술을 설명합니다.

초록

최근 몇 년 동안 미토콘드리아와 암 사이의 연관성을 확인하는 데 전념하는 연구의 수가 크게 증가했습니다. 그러나 미토콘드리아와 종양 형성의 변화와 관련된 연관성을 완전히 이해하고 종양 관련 미토콘드리아 표현형을 식별하기 위해서는 여전히 더 많은 노력이 필요합니다. 예를 들어, 종양 형성 및 전이 과정에서 미토콘드리아의 기여도를 평가하려면 다양한 핵 환경에서 종양 세포에서 미토콘드리아의 영향을 이해하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 가능한 한 가지 접근법은 미토콘드리아를 다른 핵 배경으로 전달하여 소위 사이브리드 세포를 얻는 것입니다. 전통적인 사이브리드화 기술에서, mtDNA가 결여된 세포주(^ρ0, 핵 공여 세포)는 적출된 세포 또는 혈소판에서 유래된 미토콘드리아로 다시 채워집니다. 그러나, 적출 과정은 배양 플레이트에 대한 양호한 세포 부착을 필요로 하며, 이는 침습성 세포에서 많은 경우에 부분적으로 또는 완전히 손실되는 특징이다. 또한, 전통적인 방법에서 발견되는 또 다른 어려움은 생성된 사이브리드에서 두 개의 상이한 mtDNA 종의 존재를 피하면서, 순수한 핵 및 미토콘드리아 DNA 배경을 얻기 위해 미토콘드리아-수용자 세포주로부터 내인성 mtDNA의 완전한 제거를 달성하는 것이다. 이 연구에서 우리는 분리된 미토콘드리아로 로다민 6G 전처리된 세포의 재증식을 기반으로 현탁액 성장 암세포에 적용되는 미토콘드리아 교환 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론을 통해 우리는 전통적인 접근 방식의 한계를 극복할 수 있으므로 암 진행 및 전이에서 미토콘드리아 역할에 대한 이해를 확장하는 도구로 사용할 수 있습니다.

서문

에너지 대사를 재프로그래밍하는^것은 1930년대 오토 바르부르크(Otto Warburg)가 처음으로 관찰한 암의 특징이다². 호기성 조건에서 정상 세포는 포도당을 피루브산으로 전환한 다음 아세틸-coA를 생성하여 미토콘드리아 기계에 연료를 공급하고 세포 호흡을 촉진합니다. 그럼에도 불구하고 Warburg는 정상 산소 조건에서도 대부분의 암세포가 해당 과정에서 얻은 피루브산을 젖산으로 전환하여 에너지를 얻는 방법을 전환한다는 것을 입증했습니다. 이러한 대사 조절은 "바르부르크 효과"로 알려져 있으며, 일부 암세포는 호기성 과정보다 덜 효율적으로 ATP를 생성함에도 불구하고 빠른 성장과 분열에 대한 에너지 요구를 공급할 수 있습니다 ^3,4,5. 최근 수십 년 동안 수많은 연구가 암 진행에서 신진대사 재프로그래밍의 의미를 뒷받침했습니다. 따라서 종양 에너지학은 암에 대한 흥미로운 표적으로 간주됩니다¹. 에너지 대사와 필수 전구체 공급의 중심 허브인 미토콘드리아는 현재까지 우리가 부분적으로만 이해하고 있는 이러한 세포 적응에 핵심적인 역할을 합니다.

위와 같은 맥락에서, 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 돌연변이는 이러한 대사 재프로그래밍의 가능한 원인 중 하나로 제안되었으며, 이는 전자 수송 사슬(ETC) 성능을 손상시킬 수 있으며⁶ 일부 암세포가 생존을 위해 당분해 대사를 향상시키는 이유를 설명할 수 있다. 실제로, mtDNA는 암세포 내에 돌연변이를 축적하여 종양의 적어도 50%에 존재한다고 보고되었다⁷. 예를 들어, Yuan et al.에 의해 수행된 최근 연구에서는 신장암, 결장직장암, 갑상선암에서 과돌연변이 및 절단된 mtDNA 분자의 존재를 보고했다⁸. 더욱이, 많은 연구들은 특정 mtDNA 돌연변이가 보다 공격적인 종양 표현형 및 암세포의 전이성 가능성의 증가와 관련이 있음을 입증하였다 9,10,11,12,13,14,15,16.

암 진행에서 미토콘드리아 게놈의 명백한 관련성에도 불구하고, 이러한 돌연변이에 대한 연구와 질병에 대한 기여는 현재 이용 가능한 실험 모델 및 기술의 한계로 인해 어려웠습니다¹⁷. 따라서 암 질환 발병 및 진행에 미토콘드리아 DNA의 실제 영향을 이해하기 위한 새로운 기술이 필요합니다. 이 연구에서 우리는 전통적인 사이브리드화 방법^18,19의 주요 문제를 극복하는 분리된 미토콘드리아로 로다민 6G 전처리된 세포의 재증식을 기반으로 현탁액 성장 암세포에서 트랜스미토콘드리아 사이브리드 생성을 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 방법론은 해당^ρ0 세포주의 가용성 및 전통적인 기술에 따라 적출이 어려운 세포(즉, 비부착성 세포주)에서 미토콘드리아의 전달에 관계없이 모든 핵 기증자의 사용을 허용합니다.

프로토콜

참고: 모든 배양 배지 및 완충액 조성은 표 1에 명시되어 있습니다. 사이브리드 생성 전에 기증자와 수용자 세포의 미토콘드리아 및 핵 DNA 프로파일을 모두 입력하여 세포주 간의 두 게놈에 유전적 차이가 있는지 확인해야 합니다. 본 연구에서는 상업적으로 이용 가능한 L929 세포주와 그 유래 세포주인 L929dt를 사용하였는데, 이는 본 연구실에서 자발적으로 생성되었다(자세한 내용은¹³ 참조). 이들 세포주는 mt-Nd2 유전자의 염기서열에 두 가지 차이점을 나타내는데, 이는 시브리드화 과정이 끝나면 mtDNA의 순도를 확인하는 데 사용할 수 있다¹³. 이 경우, L929dt 세포와는 달리, L929는 유전 제네신에 내성이 있었기 때문에 핵 배경의 순도는 항생제 감수성에 의해 확인되었다.

1. 로다민 6G 처리에 의한 미토콘드리아 고갈(수용자 세포)

참고: 성공적인 사이브리드 생성을 위한 첫 번째 단계는 수용자 세포에서 미토콘드리아 기능을 완전하고 비가역적으로 폐지하는 것입니다. 이를 위해 각 세포주에 대해 로다 민 6G로 적절한 농도와 치료 기간을 미리 결정할 필요가 있습니다. 이 적절한 농도는 약물로 인한 세포 사멸(치료 중 세포를 죽이지 않는 가장 높은 농도) 바로 아래에 있어야 합니다. 최적 조건이 정의되면 다음을 수행합니다.

1. 6-웰 플레이트에서⁶개의 세포를 시드하여 완전한 배양액(자세한 내용은 표 1 참조)을 사용하고, 세포주에 따라 3-10일 동안 6G의 최적 농도로 매일 처리한다. 전통적인 농도 범위는 3-10일 동안 2에서 5 μg/mL입니다^20,21. 이 연구에서는 L929 유래 세포에 대해 7일 동안 2.5μg/mL 로다민 6G를 선택한 처리^13,22였습니다.
2. 세포를 살아 있게 하려면 세포 배양 배지에 50μg/mL의 우리딘과 100μg/mL의 피루브산을 보충하고 24시간마다 갱신합니다.
3. 처리 후 융합 전에, 로다민 6G가 처리된 세포의 배지를 로다민 6G가 없는 완전한 세포 배양 배지로 변경하고, 이를 5%_CO2로 37°C의 인큐베이터에서 3-4시간 동안 이 배지에 남겨둔다.
   참고: 로다민 6G 독성 효과는 되돌릴 수 없으며 미토콘드리아가 기능하지 않는 세포는 회복되지 않아야 합니다²⁰. 따라서, 처리 후, 기능성 미토콘드리아를 공급받지 못하는 세포는 우리딘이 보충된 배양 배지에서도 죽어야 한다. 따라서 핵 선택이 필요하지 않습니다. 그러나 미토콘드리아가 없는 로다민 6G 처리 세포의 대조군 융합이 권장됩니다.

2. 확장 및 미토콘드리아 분리 (기증자 세포)

1. 시간 경과 동안 미토콘드리아 공여 세포를 확장하여 로다민 6G 처리하여 약 25 x 10⁶ 세포를 얻었다.
2. 7일째에 기하급수적으로 성장하는 세포를 50mL 튜브에서 수확하고 실온(RT)에서 5분 동안 520 x g 에서 원심분리하여 수집합니다. 세포를 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 3배 세척하고 RT에서 5분 동안 520 x g 에서 원심분리하여 침전시킵니다. 이제부터는 차가운 시약을 사용하여 4 °C에서 미토콘드리아 추출의 모든 단계를 수행하고 얼음 위에 세포 또는 미토콘드리아가있는 튜브를 유지합니다.
3. 3차 원심분리 후, 진공 펌프에 결합된 유리 피펫을 사용하여 흡인하여 상층액을 버리고 세포 펠릿 부피의 7배에 해당하는 부피의 저삼투압 완충액에 충전된 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 균질화 튜브로 옮기고 얼음에서 2분 동안 배양하여 세포가 팽창하도록 합니다.
4. 600 rpm으로 회전하는 모터 구동 유봉에 연결된 균질화기에서 8 내지 10 스트로크를 수행하여 세포막을 파괴한다.
   참고: 세포막 파괴 단계는 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 각 세포 유형에 맞게 최적화되어야 합니다.
5. 동일한 부피의 고장성 완충액을 세포 현탁액(세포 펠릿 부피의 7배)에 추가하여 등장성 환경을 생성합니다.
6. 균질액을 15mL 튜브로 옮기고 4°C에서 5분 동안 1,000 x g 로 고정된 로터에서 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿에서 큰 여백을 남기고 상청액의 3/4 만 수집하여 핵 또는 손상되지 않은 세포로 오염되는 것을 방지하고 다른 튜브로 옮깁니다. 같은 과정을 두 번 반복하십시오. 상층액은 보관하고 펠릿은 폐기해야 합니다.
7. 미토콘드리아 분획 (상청액)을 저장하십시오. 1.5 mL 튜브에 옮기고 4 °C에서 2 분 동안 최대 속도 (18,000 x g)로 원심 분리합니다.
8. 상청액을 버리고 미토콘드리아 농축 펠릿을 완충액 A로 세척하고 두 튜브의 함량을 하나로 합치고 2.7 단계에서 설명한 것과 동일한 조건에서 원심 분리합니다. 모든 재료가 하나의 튜브에 들어갈 때까지 동일한 과정을 반복합니다.
9. 300 μL의 완충액 A로 추가로 세척하고, 브래드포드 분석(Bradford assay)을 사용하여 미토콘드리아 단백질 농도를 정량화한다²³. 각 cybridization 분석에 대해, 전달 절차를위한 미토콘드리아의 최적 양이 결정되어야한다 (우리의 경우, 10^{6 세포} 당 미토콘드리아 단백질의 10-40 μg 사이의 농도).
10. 동시에, 융합을 위해 로다민 6G 전처리된 세포를 15mL 튜브에 모으고 RT에서 5분 동안 520 x g 에서 원심분리하여 준비합니다. 펠릿은 로다민 6G 처리로 인해 네온 핑크색을 얻습니다.
11. 수용체 세포의 미토콘드리아 기능 소실과 기증자로부터의 세포 소기관 정제가 모두 제대로 수행되었는지 확인하기 위해 소수의 로다민 6G 처리 세포를 시딩하고 완전한 배양 배지를 사용하여 6웰 플레이트에서 미토콘드리아를 분리하고 한 달 동안 배양하여 웰에 생존 세포가 남아 있지 않은지 확인합니다(그림 2).
12. 병행하여 핵 단백질(즉, 라민 베타, 히스톤 H3 등)의 면역검출 또는 핵 유전자(즉, SDH, 18S rRNA 등)의 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 증폭을 통해 미토콘드리아 분획에 핵 오염 물질이 없는지 평가합니다.
    알림: 오염을 방지하려면 층류 후드 아래에서 작업하는 무균 조건에서 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.

3. 융합 및 사이브리드 생성

1. 융합을 진행하기 위해 로다민 6G로 처리된 세포 10⁶개를 분리된 미토콘드리아 펠릿(미토콘드리아 단백질 10-40μg)에 조심스럽게 추가하고 세포가 미토콘드리아와 혼합되도록 520 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
2. 100 μL의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, 50 %)을 첨가하고 30 초 동안 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 30초 동안 그대로 두십시오.
3. 마지막으로, 혼합물을 신선한 완전 세포 배양 배지가 있는 6-웰 플레이트로 옮기고 5%_CO2와 함께 37°C의 인큐베이터에 넣는다. 며칠(보통 1주일) 후에 트랜스미토콘드리아 사이브리드가 성장하기 시작하여(그림 2), 분석 전에 풀에서 개별적으로 선택하거나 혼합할 수 있는 클론을 생성합니다.

4. 미토콘드리아와 핵 배경의 검증

참고: 새로운 세포주가 확립되고 세포가 기하급수적으로 성장하기 시작하면 미토콘드리아 및 핵 DNA의 순도를 확인해야 합니다. 따라서 원래 세포주는 게놈 내에 다른 돌연변이 또는 다형성을 보유하여 인식할 수 있어야 합니다.

1. 전체 DNA 분리
   1. 시판되는 게놈 DNA 추출 키트( 표 참조)를 사용하거나 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 추출 및 알코올 침전을 사용하여 표준 프로토콜을 수행하여 사이브리드 생성에 사용되는 모든 세포주의 게놈 DNA를 분리합니다²⁴.
2. mtDNA 평가(그림 3)
   참고: mtDNA의 순도를 분석하기 위해 시퀀싱, 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석 또는 대립유전자 특이적 qPCR과 같은 여러 기술을 수행할 수 있습니다. RFLP에 의한 mtDNA 서열 변이의 존재를 확인하려면 다음 프로토콜 단계를 따르십시오.
   1. 뉴클레오티드 변화를 포함하는 mtDNA 단편을 PCR로 증폭한다.
      1. 여기서, L929dt 세포는 L929 세포에 없는 mt-Nd2 유전자(m.4206C>T) 내의 위치 4206에 mtDNA 돌연변이를 나타낸다. 트랜스미토콘드리아 사이브리드에서 이러한 치환의 존재를 확인하기 위해, 표준 프로토콜 및 다음 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 397 bp 단편을 증폭한다: 1) 5'-AAGCTATCGGG
         CCCATACCCCG-3'(위치 3862-3884) 및 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3'(위치 4236-4258).
   2. 서열 변화를 인식하고 두 세포주에 대해 서로 다른 절단 패턴을 생성하는 특정 엔도뉴클레아제를 사용하여 RFLP에 의한 원하는 뉴클레오티드 치환의 존재를 분석합니다.
      참고: L929dt mtDNA 변이체가 존재하는 경우(4206T), 4.2.1단계에서 얻은 앰플리콘은 306bp, 52bp 및 39bp의 3개의 DNA 단편을 생성하는 SspI에 대한 2개의 제한 부위( 재료 표 참조)를 포함합니다. 52 및 39 밴드를 생성하는 제한 부위는 야생형(WT) 버전 C4206이 존재하고 91bp의 새로운 밴드가 나타날 때 중단됩니다. 따라서 SspI에 대한 완전한 소화를 위한 내부 제어가 분석에 포함됩니다. 소화 반응은 제조업체의 지침에 따라 37°C에서 수행됩니다.
   3. 전기영동에 의해 제한효소 단편을 분리하고 밴드 패턴을 비교한다.
      1. 일단 소화가 수행되면, 10% 폴리아크릴아미드-트리스-보레이트-EDTA(TBE) 겔에서 전기영동에 의해 얻어진 제한 단편을 분석한다(1x TBE 조성에 대해서는 표 1 참조). RT에서 1시간 동안 80V에서 전기영동을 실행하고, RT에서 15분 동안 1x TBE의 에티듐 브로마이드 용액에서 겔 염색 후 DNA 단편을 시각화합니다(겔 염색 용액 조성에 대해서는 표 1 참조).
3. 핵 DNA 유전형 분석
   참고: 핵 DNA 유전형 분석은 RFLP 분석에 사용된 이전 DNA 추출 샘플을 사용하여 수행해야 합니다.
   1. 상업적-특이적 올리고뉴클레오티드의 풀을 이용하여 16개 유전자좌(D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 및 AMEL)를 증폭한다( 재료 표 참조).
   2. 이전에 얻은 단편을 분리하기 위해 유전자 분석기를 사용하여 전기영동을 수행합니다.
      참고: 일단 증폭되면 다른 유전자좌는 capilar 시스템을 사용하여 전기 영동으로 분석됩니다( 재료 표 참조). 파편은 상업용 폴리머로 채워진 50cm 길이의 카필라에서 분리됩니다. 음극 및 양극 완충액은 또한 재료 표에 표시된 바와 같이 상업적으로 이용 가능합니다. 전기영동은 60°C에서 20분 동안 19.5kV에서 수행된다.
   3. 생물 정보 도구를 사용하여 증폭된 각 유전자좌에 해당하는 대립 유전자를 결정합니다( 재료 표 참조).
   4. 4.3.3 단계에서 얻은 데이터를 핵 DNA 프로파일 데이터베이스(표 1)와 비교하여 핵 DNA 프로파일이 미토콘드리아 수용체 세포주 프로파일과 일치하는지 확인합니다(그림 4).

결과

위에 제시된 프로토콜을 따른 후, 그림 1 및 그림 2의 개략도에 표시된 바와 같이 보존된 핵 배경을 갖지만 새로운 미토콘드리아 유전자형을 가진 동형질 사이브레드 세포주를 얻어야 합니다. 사이브리드에 존재하는 미토콘드리아 및 핵 DNA의 순도는 그림 3과 같이 RFLP와 그림 4와 같이 핵 DNA 유전자형 분석을 ...

토론

오토 바르부르크(Otto Warburg)가 암세포가 미토콘드리아 호흡을 감소시키면서 신진대사를 변화시키고 "호기성 해당^작용(aerobic glycolysis)"^3,4을 강화한다고 보고한 이후^, 암 변형과 진행에서 미토콘드리아의 역할에 대한 관심이 기하급수적으로 증가했습니다. 최근 몇 년 동안, mtDNA의 돌연변이와 미토콘드리아 기능 장애는 많은 암 유형의 특징으로 가정되었?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750