Генерация трансмитохондриальных цибридов с использованием линий раковых клеток

Резюме

В этом протоколе описывается метод генерации цибрид из раковых клеток, растущих в суспензии, в качестве инструмента для изучения роли митохондрий в онкогенном процессе.

Аннотация

В последние годы значительно возросло количество исследований, посвященных выяснению связи между митохондриями и раком. Тем не менее, все еще необходимы дополнительные усилия, чтобы полностью понять связь, связанную с изменениями в митохондриях и онкогенезе, а также для выявления митохондриальных фенотипов, связанных с опухолью. Например, чтобы оценить вклад митохондрий в процессы онкогенеза и метастазирования, важно понять влияние митохондрий опухолевых клеток в различных ядерных средах. Для этой цели один из возможных подходов состоит в переносе митохондрий в другой ядерный фон для получения так называемых клеток кибридов. В традиционных методах цибридизации клеточная линия, лишенная мтДНК (ρ⁰, ядерная донорская клетка), заселяется митохондриями, полученными либо из энуклеированных клеток, либо из тромбоцитов. Однако процесс энуклеации требует хорошей клеточной адгезии к культуральной пластине, особенность, которая частично или полностью теряется во многих случаях в инвазивных клетках. Кроме того, еще одна трудность, встречающаяся в традиционных методах, заключается в достижении полного удаления эндогенной мтДНК из клеточной линии митохондрий-реципиентов для получения чистых ядерных и митохондриальных фонов ДНК, избегая присутствия двух разных видов мтДНК в сгенерированном цибриде. В этой работе мы представляем протокол митохондриального обмена, применяемый к раковым клеткам, выращивающим суспензию, на основе репопуляции клеток, предварительно обработанных родамином 6G, изолированными митохондриями. Эта методология позволяет преодолеть ограничения традиционных подходов и, таким образом, может быть использована в качестве инструмента для расширения понимания роли митохондрий в прогрессировании рака и метастазировании.

Введение

Перепрограммирование энергетического метаболизма является отличительной чертой рака¹, который впервые наблюдался Отто Варбургом в 1930-х годах². В аэробных условиях нормальные клетки превращают глюкозу в пируват, который затем генерирует ацетил-КоА, подпитывая митохондриальный механизм и способствуя клеточному дыханию. Тем не менее, Варбург продемонстрировал, что даже в нормоксических условиях большинство раковых клеток превращают пируват, полученный в процессе гликолиза, в лактат, изменяя свой путь к получению энергии. Эта метаболическая корректировка известна как «эффект Варбурга» и позволяет некоторым раковым клеткам удовлетворять свои энергетические потребности для быстрого роста и деления, несмотря на то, что генерация АТФ менее эффективна, чем аэробный процесс ^3,4,5. В последние десятилетия многочисленные работы подтвердили влияние перепрограммирования метаболизма на прогрессирование рака. Следовательно, опухолевая энергетика считается интересной мишенью против рака¹. Как центральный узел в энергетическом метаболизме и в поставке необходимых предшественников, митохондрии играют ключевую роль в этих клеточных адаптациях, которые на сегодняшний день мы понимаем лишь частично.

В соответствии с вышесказанным, мутации митохондриальной ДНК (мтДНК) были предложены в качестве одной из возможных причин этого метаболического перепрограммирования, что может привести к нарушению производительности цепи переноса электронов (ETC)⁶ и объяснить, почему некоторые раковые клетки усиливают свой гликолитический метаболизм, чтобы выжить. Действительно, сообщалось, что мтДНК накапливает мутации в раковых клетках, присутствуя, по крайней мере, в 50% опухолей⁷. Например, в недавнем исследовании, проведенном Yuan et al., сообщалось о наличии гипермутированных и усеченных молекул мтДНК при раке почек, толстой кишки и щитовидной железы⁸. Более того, во многих работах было продемонстрировано, что определенные мутации мтДНК связаны с более агрессивным фенотипом опухоли и с увеличением метастатического потенциала раковых клеток 9,10,11,12,13,14,15,16.

Несмотря на очевидную значимость митохондриального генома в прогрессировании рака, изучение этих мутаций и их вклада в заболевание было сложным из-за ограничений в экспериментальных моделях и технологиях, доступных в настоящее время¹⁷. Таким образом, необходимы новые методы для понимания реального влияния митохондриальной ДНК на развитие и прогрессирование раковых заболеваний. В этой работе мы представляем протокол генерации трансмитохондриальных цибридов из раковых клеток, растущих в суспензии, основанный на репопуляции клеток, предварительно обработанных родамином 6G, изолированными митохондриями, что позволяет преодолеть основные проблемы традиционных методов кибридизации^18,19. Эта методология позволяет использовать любого донора ядер независимо от наличия соответствующей им клеточной линии ρ⁰ и переноса митохондрий из клеток, которые, следуя традиционным методам, было бы трудно энуклеировать (т.е. неадгезивные клеточные линии).

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все питательные среды и буферные композиции указаны в таблице 1. Перед генерацией цибридов должны быть типированы как митохондриальные, так и ядерные профили ДНК из донорских и реципиентных клеток, чтобы подтвердить наличие генетических различий в обоих геномах между клеточными линиями. В этом исследовании использовалась коммерчески доступная клеточная линия L929 и производная от нее клеточная линия L929dt, которая была спонтанно сгенерирована в нашей лаборатории (см.¹³ для получения дополнительной информации). Эти клеточные линии имеют два различия в последовательности их гена mt-Nd2 , которые могут быть использованы для подтверждения чистоты мтДНК после завершения процесса кибридизации¹³. При этом чистота ядерного фона была подтверждена чувствительностью к антибиотикам, поскольку, в отличие от клеток L929dt, L929 были устойчивы к генетику.

1. Истощение митохондрий при обработке родамином 6G (клетки-реципиенты)

ПРИМЕЧАНИЕ: Первым шагом для успешной генерации цибридов является полная и необратимая отмена митохондриальных функций в клетках-реципиентах. Для этого необходимо предварительно определить для каждой клеточной линии соответствующую концентрацию и продолжительность лечения родамином 6G. Эта адекватная концентрация должна быть чуть ниже вызванной лекарственным препаратом гибели клеток (самая высокая, которая не убивает клетки во время лечения). После определения оптимальных условий выполните следующие действия.

1. Засейте 10⁶ клеток в 6-луночную пластину, используя полную питательную среду (подробнее см. Таблицу 1) и ежедневно обрабатывайте их оптимальной концентрацией родамина 6G в течение 3-10 дней, в зависимости от клеточной линии. Традиционные концентрации колеблются от 2 до 5 мкг/мл в течение 3-10 дней^20,21. В этом исследовании для клеток, полученных из L929, 2,5 мкг / мл родамина 6G в течение 7 дней было выбранным лечением^13,22.
2. Чтобы сохранить клетки живыми, дополните питательную среду 50 мкг/мл уридина и 100 мкг/мл пирувата и обновляйте его каждые 24 часа.
3. После обработки и до слияния меняют среду клеток, обработанных родамином 6G, на полную среду для культивирования клеток без родамина 6G и оставляют их в этой среде на 3-4 ч в инкубаторе при 37 °C с 5%_CO2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Токсическое действие родамина 6G необратимо, и клетки с нефункционирующими митохондриями не должны восстанавливаться²⁰. Таким образом, после лечения клетки, не получающие функциональных митохондрий, должны погибнуть даже в питательной среде, дополненной уридином. Поэтому никакой ядерный отбор не должен быть необходим. Тем не менее, рекомендуется контрольное слияние клеток, обработанных родамином 6G, без митохондрий.

2. Экспансия и изоляция митохондрий (донорские клетки)

1. Расширьте донорские клетки митохондрий во время лечения родамином 6G, чтобы получить около 25 x 10⁶ клеток.
2. На 7-й день собирают экспоненциально растущие клетки в пробирку объемом 50 мл и собирают их центрифугированием при 520 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Промойте клетки 3 раза холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и осаждайте их центрифугированием при 520 x g в течение 5 мин при RT. С этого момента выполняйте все этапы митохондриальной экстракции при температуре 4 °C, используя холодные реагенты и держа пробирки с клетками или митохондриями на льду.
3. После третьего центрифугирования откажитесь от надосадочной жидкости путем аспирации с помощью стеклянной пипетки, соединенной с вакуумным насосом, и ресуспендируйте упакованные клетки в объеме гипотонического буфера, равном 7-кратному объему клеточной гранулы. Затем перенесите клеточную суспензию в пробирку гомогенизатора и дайте клеткам набухнуть, инкубируя их на льду в течение 2 минут.
4. Разорвите клеточные мембраны, выполнив от 8 до 10 ударов в гомогенизаторе, соединенном с пестиком с моторным приводом, вращающимся со скоростью 600 об / мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стадия разрушения клеточной мембраны может варьироваться в зависимости от типа клеток; Таким образом, он должен быть оптимизирован для каждого типа клеток.
5. Добавьте тот же объем гипертонического буфера к клеточной суспензии (в 7 раз больше объема клеточной гранулы) для создания изотонической среды.
6. Перелейте гомогенат в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте его в неподвижном роторе при 1000 x g в течение 5 мин при 4 °C. Затем соберите только 3/4 надосадочной жидкости, оставив большой запас от гранулы, чтобы избежать загрязнения ядрами или неповрежденными клетками, и перенесите ее в другую пробирку. Повторите тот же процесс дважды. Обратите внимание, что надосадочную жидкость необходимо сохранить, а гранулы выбросить.
7. Сохранить митохондриальную фракцию (надосадочную жидкость). Переложите его в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугу на максимальной скорости (18 000 x g) в течение 2 мин при 4 °C.
8. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте обогащенную митохондриями гранулу буфером А, объединив содержимое двух пробирок в одну и центрифугируя в тех же условиях, которые описаны на шаге 2.7. Повторяйте тот же процесс до тех пор, пока весь материал не окажется только в одной трубке.
9. Сделайте дополнительную промывку 300 мкл буфера А и количественно определите концентрацию митохондриального белка с помощью анализа^{Брэдфорда 23}. Для каждого анализа цибридизации необходимо определить оптимальное количество митохондрий для процедуры переноса (в нашем случае концентрация между 10-40 мкг митохондриального белка на^10-6 клеток).
10. Одновременно подготовьте предварительно обработанные родамином 6G клетки к слиянию, собрав их в пробирку объемом 15 мл и центрифугируя при 520 x g в течение 5 мин при RT. Обратите внимание, что гранулы приобретают неоново-розовый цвет из-за обработки родамином 6G.
11. Чтобы убедиться, что как отмена митохондриальной функции в рецепторных клетках, так и очистка органелл от доноров были выполнены должным образом, засейте небольшое количество клеток, обработанных родамином 6G, и изолированных митохондрий, используя полную питательную среду, в 6-луночную пластину и культивируйте их в течение месяца, чтобы убедиться, что ни в одной из лунок не осталось выживших клеток (рис. 2).
12. Параллельно оценивают отсутствие контаминантов ядер в митохондриальной фракции путем иммунодетекции ядерных белков (например, бета-ламина, гистона H3 и т. д.) или количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) амплификации ядерного гена (т. е. SDH, 18S рРНК и т. д.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание загрязнений рекомендуется выполнять все этапы в асептических условиях, работая под ламинарным колпаком.

3. Слияние и генерация кибридов

1. Чтобы продолжить слияние, осторожно добавьте 10⁶ клеток, обработанных родамином 6G, в изолированную гранулу митохондрий (10-40 мкг митохондриального белка) и центрифугу при 520 x g в течение 5 мин, чтобы позволить клеткам смешаться с митохондриями.
2. Добавьте 100 мкл полиэтиленгликоля (ПЭГ, 50%) и осторожно ресуспендируйте гранулу в течение 30 с. Затем дайте отдохнуть нетронутым еще 30 секунд.
3. Наконец, переложите смесь в 6-луночную тарелку со свежей полной средой для культивирования клеток и поместите в инкубатор при 37 ° C с 5% CO₂. Через несколько дней (обычно 1 неделя) трансмитохондриальные цибриды должны начать расти (рис. 2), давая начало клонам, которые могут быть индивидуально отобраны или смешаны в пуле перед их анализом.

4. Верификация как митохондриального, так и ядерного фона

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как новая клеточная линия была создана и клетки начали расти экспоненциально, чистота их митохондриальной и ядерной ДНК должна быть проверена. Таким образом, исходные клеточные линии должны содержать различные мутации или полиморфизмы в своих геномах, чтобы сделать их узнаваемыми.

1. Полная изоляция ДНК
   1. Изолируют геномную ДНК всех клеточных линий, используемых для генерации цибридов, используя коммерческий набор для экстракции геномной ДНК (см. Таблицу материалов) или выполняя стандартный протокол с использованием экстракции фенол-хлороформ-изоамиловым спиртом и осаждения^{спирта 24}.
2. Оценка мтДНК (рис. 3)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько методов, таких как секвенирование, анализ полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP) или аллель-специфическая кПЦР, могут быть выполнены для анализа чистоты мтДНК. Чтобы подтвердить наличие вариаций последовательности мтДНК с помощью RFLP, выполните следующие шаги протокола.
   1. Амплифицируйте фрагмент мтДНК, содержащий нуклеотидное изменение, с помощью ПЦР.
      1. Здесь клетки L929dt представляют мутацию мтДНК в положении 4206 в гене mt-Nd2 (m.4206C>T), который отсутствует в клетках L929. Чтобы подтвердить наличие этой замены в трансмитохондриальных цибридах, амплифицируют фрагмент 397.н. методом ПЦР с использованием стандартного протокола и следующих праймеров: 1) 5'-AAGCTATCGGG
         CCCATACCCCG-3' (позиции 3862-3884) и 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (позиции 4236-4258).
   2. Проанализируйте наличие желаемой нуклеотидной замены с помощью RFLP, используя специфическую эндонуклеазу, которая распознает изменение последовательности и генерирует различную схему разреза для обеих клеточных линий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии варианта мтДНК L929dt (4206T) ампликон, полученный на этапе 4.2.1, содержит два сайта рестрикции для SspI (см. Таблицу материалов), которые продуцируют три фрагмента ДНК 306.н., 52.н. и 39.н. Сайт ограничения, который генерирует 52 и 39 диапазоны, нарушается при наличии версии C4206 дикого типа (WT) и появляется новая полоса 91.н. Поэтому в анализ включается внутренний контроль за полным перевариванием SspI. Реакцию сбраживания проводят при 37 °C в соответствии с инструкциями производителя.
   3. Отделите фрагменты рестрикции с помощью электрофореза и сравните полосный рисунок.
      1. После того, как разложение выполнено, проанализируйте полученные фрагменты рестрикции с помощью электрофореза в 10% полиакриламид-трис-борат-ЭДТА (TBE) гелях (см. Таблицу 1 для состава 1x TBE). Проводите электрофорез при 80 В в течение 1 ч при ЛТ. Визуализируйте фрагменты ДНК после окрашивания гелем в растворе бромида этидия в 1x КЭ в течение 15 мин при ЛТ (см. Таблицу 1 для состава раствора для окрашивания геля).
3. Генотипирование ядерной ДНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Генотипирование ядерной ДНК должно быть выполнено с использованием предыдущего образца экстракции ДНК, используемого для анализа RFLP.
   1. Амплификация 16 локусов (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 и AMEL) с использованием пула коммерчески специфических олигонуклеотидов (см. Таблицу материалов).
   2. Проведите электрофорез с помощью генетического анализатора, чтобы отделить ранее полученные фрагменты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После амплификации различные локусы анализируются электрофорезом с использованием капилярной системы (см. Таблицу материалов). Фрагменты отделяются в капиляре длиной 50 см, заполненном коммерческим полимером. Катодные и анодные буферы также коммерчески доступны, как показано в таблице материалов. Электрофорез проводят при напряжении 19,5 кВ в течение 20 мин при 60 °С.
   3. Используйте биоинформационные инструменты для определения аллелей, соответствующих каждому амплифицированному локусу (см. Таблицу материалов).
   4. Сравните данные, полученные на шаге 4.3.3, с базой данных профиля ядерной ДНК (таблица 1), чтобы проверить, совпадает ли профиль ядерной ДНК с профилем клеточной линии рецептора митохондрий (рис. 4).

Результаты

После следования представленному выше протоколу должна быть получена гомоплазматическая клеточная линия цибридов с консервативным ядерным фоном, но с новым генотипом митохондрий, как показано на схемах на рисунках 1 и 2. Чистота митохондриальной и ядер...

Обсуждение

С тех пор, как Отто Варбург сообщил, что раковые клетки изменяют свой метаболизм и потенцируют «аэробный гликолиз»^3,4 при одновременном снижении митохондриального дыхания^, интерес к роли митохондрий в трансформации и прогрессировании рака вырос в геомет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750