Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Cybrid-Generierung aus suspensionswachsenden Krebszellen, um die Rolle der Mitochondrien im tumorigenen Prozess zu untersuchen.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren ist die Zahl der Studien, die sich mit der Aufklärung des Zusammenhangs zwischen Mitochondrien und Krebs befassen, deutlich gestiegen. Es sind jedoch noch weitere Anstrengungen erforderlich, um den Zusammenhang zwischen Veränderungen der Mitochondrien und der Tumorentstehung vollständig zu verstehen und tumorassoziierte mitochondriale Phänotypen zu identifizieren. Um beispielsweise den Beitrag von Mitochondrien bei Tumorentstehungs- und Metastasierungsprozessen zu bewerten, ist es wichtig, den Einfluss von Mitochondrien aus Tumorzellen in verschiedenen nukleären Umgebungen zu verstehen. Ein möglicher Ansatz besteht darin, Mitochondrien in einen anderen Kernhintergrund zu überführen, um die sogenannten Cybridzellen zu erhalten. Bei den traditionellen Cybridisierungstechniken wird eine Zelllinie, der mtDNA fehlt (ρ⁰, Kernspenderzelle), mit Mitochondrien neu besiedelt, die entweder von enukleierten Zellen oder Blutplättchen stammen. Der Enukleationsprozess erfordert jedoch eine gute Zelladhäsion auf der Kulturplatte, eine Eigenschaft, die in vielen Fällen bei invasiven Zellen teilweise oder vollständig verloren geht. Darüber hinaus besteht eine weitere Schwierigkeit bei den traditionellen Methoden darin, die endogene mtDNA vollständig aus der mitochondrialen Empfängerzelllinie zu entfernen, um reine nukleäre und mitochondriale DNA-Hintergründe zu erhalten, wodurch das Vorhandensein von zwei verschiedenen mtDNA-Spezies in der erzeugten Cybrid vermieden wird. In dieser Arbeit stellen wir ein mitochondriales Austauschprotokoll vor, das auf suspensionswachsende Krebszellen angewendet wird, basierend auf der Wiederbesiedlung von Rhodamin 6G-vorbehandelten Zellen mit isolierten Mitochondrien. Diese Methodik ermöglicht es uns, die Einschränkungen der traditionellen Ansätze zu überwinden und kann daher als Werkzeug verwendet werden, um das Verständnis der mitochondrialen Rolle bei der Krebsprogression und Metastasierung zu erweitern.

Einleitung

Die Reprogrammierung des Energiestoffwechsels ist ein Kennzeichen von Krebs¹, das erstmals in den 1930er Jahren von Otto Warburg beobachtet wurde². Unter aeroben Bedingungen wandeln normale Zellen Glukose in Pyruvat um, das dann Acetyl-CoA erzeugt, das die mitochondriale Maschinerie antreibt und die Zellatmung fördert. Dennoch zeigte Warburg, dass die meisten Krebszellen auch unter normoxischen Bedingungen Pyruvat, das sie bei der Glykolyse erhalten, in Laktat umwandeln und sich so auf die Energiegewinnung verlagern. Diese metabolische Anpassung wird als "Warburg-Effekt" bezeichnet und ermöglicht es einigen Krebszellen, ihren Energiebedarf für schnelles Wachstum und Teilung zu decken, obwohl sie ATP weniger effizient erzeugen als der aerobe Prozess ^3,4,5. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Arbeiten die Bedeutung der Reprogrammierung des Stoffwechsels für das Fortschreiten von Krebs unterstützt. Daher wird die Tumorenergetik als interessantes Ziel gegen Krebs angesehen¹. Als zentrale Drehscheibe im energetischen Stoffwechsel und bei der Versorgung mit essentiellen Vorstufen spielen Mitochondrien eine Schlüsselrolle bei diesen Zellanpassungen, die wir bisher nur teilweise verstehen.

In Übereinstimmung mit dem oben Gesagten wurden mitochondriale DNA-Mutationen (mtDNA) als eine der möglichen Ursachen für diese metabolische Reprogrammierung vorgeschlagen, die zu einer beeinträchtigten^{Leistung der} Elektronentransportkette (ETC) führen könnte 6 und erklären würde, warum einige Krebszellen ihren glykolytischen Stoffwechsel verbessern, um zu überleben. Tatsächlich wurde berichtet, dass mtDNA Mutationen in Krebszellen akkumuliert, die in mindestens 50 % der Tumore vorhanden sind⁷. Eine kürzlich von Yuan et al. durchgeführte Studie berichtete beispielsweise über das Vorhandensein von hypermutierten und verkürzten mtDNA-Molekülen bei Nieren-, Darm- und Schilddrüsenkrebs⁸. Darüber hinaus haben viele Arbeiten gezeigt, dass bestimmte mtDNA-Mutationen mit einem aggressiveren Tumorphänotyp und einer Erhöhung des Metastasierungspotenzials von Krebszellen assoziiert^sind 9,10,11,12,13,14,15,16.

Trotz der offensichtlichen Bedeutung des mitochondrialen Genoms für das Fortschreiten von Krebs war die Untersuchung dieser Mutationen und ihres Beitrags zur Krankheit aufgrund der Einschränkungen der derzeit verfügbaren experimentellen Modelle und Technologien eine Herausforderung¹⁷. Daher werden neue Techniken benötigt, um den tatsächlichen Einfluss der Mitochondrien-DNA auf die Entwicklung und das Fortschreiten von Krebserkrankungen zu verstehen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur transmitochondrialen Cybrid-Erzeugung aus suspensionswachsenden Krebszellen vor, das auf der Wiederbesiedlung von Rhodamin 6G-vorbehandelten Zellen mit isolierten Mitochondrien basiert und die Hauptherausforderungen traditioneller Cybridisierungsmethoden überwindet^18,19. Diese Methodik ermöglicht die Verwendung eines beliebigen Zellkernspenders, unabhängig von der Verfügbarkeit der entsprechenden ρ^0-Zelllinie und den Transfer von Mitochondrien aus Zellen, die nach den traditionellen Techniken schwer zu enukleieren wären (d. h. nicht adhärente Zelllinien).

Protokoll

HINWEIS: Alle Nährmedien und Pufferzusammensetzungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Vor der Cybrid-Generierung müssen sowohl mitochondriale als auch nukleäre DNA-Profile von Spender- und Empfängerzellen typisiert werden, um das Vorhandensein genetischer Unterschiede in beiden Genomen zwischen Zelllinien zu bestätigen. In dieser Studie wurden eine kommerziell erhältliche L929-Zelllinie und die daraus abgeleitete Zelllinie L929dt verwendet, die spontan in unserem Labor erzeugt wurde (siehe¹³ für weitere Informationen). Diese Zelllinien weisen zwei Unterschiede in der Sequenz ihres mt-Nd2-Gens auf, die verwendet werden können, um die Reinheit der mtDNA zu bestätigen, sobald der Cybridisierungsprozess abgeschlossen ist¹³. In diesem Fall wurde die Reinheit des nukleären Hintergrunds durch eine Antibiotikasensitivität bestätigt, da L929 im Gegensatz zu L929dt-Zellen resistent gegen Geneticin waren.

1. Mitochondrialer Abbau durch Rhodamin-6G-Behandlung (Empfängerzellen)

HINWEIS: Der erste Schritt für eine erfolgreiche Cybrid-Generierung besteht darin, die mitochondrialen Funktionen in den Empfängerzellen vollständig und irreversibel abzuschaffen. Zu diesem Zweck ist es notwendig, zuvor für jede Zelllinie die geeignete Konzentration und Behandlungsdauer mit Rhodamin 6G zu bestimmen. Diese adäquate Konzentration sollte knapp unter dem medikamenteninduzierten Zelltod liegen (der höchste, der die Zellen während der Behandlung nicht abtötet). Führen Sie die folgenden Schritte aus, sobald die optimalen Bedingungen definiert sind.

1. Säen Sie 10 6 Zellen in einer 6-Well-Platte mit vollständigem Nährmedium (siehe Tabelle 1 für Details) und behandeln Sie sie täglich mit der optimalen Konzentration von Rhodamin 6G für 3-10 Tage, je nach Zelllinie. Herkömmliche Konzentrationen reichen von 2 bis 5 μg/ml für 3-10 Tage^20,21. In dieser Studie wurde für L929-abgeleitete Zellen 2,5 μg/ml Rhodamin 6G für 7 Tage als Behandlung ausgewählt^13,22.
2. Um die Zellen am Leben zu erhalten, ergänzen Sie das Zellkulturmedium mit 50 μg/ml Uridin und 100 μg/ml Pyruvat und erneuern Sie es alle 24 h.
3. Wechseln Sie nach der Behandlung und vor der Fusion das Medium der mit Rhodamin 6G behandelten Zellen in ein vollständiges Zellkulturmedium ohne Rhodamin 6G und lassen Sie sie 3-4 h in diesem Medium in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   HINWEIS: Die toxische Wirkung von Rhodamin 6G ist irreversibel, und Zellen mit nicht funktionsfähigen Mitochondrien sollten sich nicht erholen²⁰. So sollten Zellen, die keine funktionsfähigen Mitochondrien erhalten, nach der Behandlung auch in mit Uridin angereichertem Nährmedium absterben. Daher sollte keine nukleare Selektion erforderlich sein. Es wird jedoch eine Kontrollfusion von Rhodamin 6G-behandelten Zellen ohne Mitochondrien empfohlen.

2. Expansion und mitochondriale Isolierung (Spenderzellen)

1. Erweitern Sie die Mitochondrien-Spenderzellen während des Zeitraffers der Rhodamin-6G-Behandlung, um etwa 25 x 10⁶ Zellen zu erhalten.
2. Ernten Sie an Tag 7 exponentiell wachsende Zellen in einem 50-ml-Röhrchen und sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 520 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Zellen 3x mit kaltphosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und sedimentieren Sie sie durch Zentrifugation bei 520 x g für 5 min bei RT. Führen Sie von nun an alle Schritte der mitochondrialen Extraktion bei 4 °C durch, verwenden Sie kalte Reagenzien und halten Sie die Röhrchen mit Zellen oder Mitochondrien auf Eis.
3. Nach der dritten Zentrifugation wird der Überstand durch Aspiration mit einer Glaspipette, die mit einer Vakuumpumpe gekoppelt ist, verworfen und die gepackten Zellen in einem Volumen hypotonen Puffers resuspendiert, das dem 7-fachen des Zellpelletvolumens entspricht. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein Homogenisatorröhrchen und lassen Sie die Zellen aufquellen, indem Sie sie 2 Minuten lang auf Eis inkubieren.
4. Brechen Sie die Zellmembranen auf, indem Sie 8 bis 10 Hübe im Homogenisator ausführen, der mit einem motorbetriebenen Stößel gekoppelt ist, der sich mit 600 U / min dreht.
   HINWEIS: Der Schritt der Zellmembranzerstörung kann je nach Zelltyp variieren. Daher muss es für jeden Zelltyp optimiert werden.
5. Fügen Sie der Zellsuspension das gleiche Volumen an hypertonem Puffer hinzu (das 7-fache des Zellpelletvolumens), um eine isotonische Umgebung zu erzeugen.
6. Das Homogenat wird in ein 15-ml-Röhrchen überführt und in einem festen Rotor bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie dann nur 3/4 des Überstandes, so dass ein großer Rand vom Pellet übrig bleibt, um eine Kontamination mit Zellkernen oder intakten Zellen zu vermeiden, und übertragen Sie es in ein anderes Röhrchen. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang zweimal. Beachten Sie, dass der Überstand beibehalten und das Pellet entsorgt werden muss.
7. Bewahren Sie die mitochondriale Fraktion (Überstand) auf. Überführen Sie es in 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei maximaler Geschwindigkeit (18.000 x g) für 2 Minuten bei 4 °C.
8. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das mit Mitochondrien angereicherte Pellet mit Puffer A, kombinieren Sie den Inhalt der beiden Röhrchen zu einem und zentrifugieren Sie unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 2.7 beschrieben. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang, bis sich das gesamte Material in nur noch einem Röhrchen befindet.
9. Führen Sie eine zusätzliche Waschung mit 300 μl Puffer A durch und quantifizieren Sie die mitochondriale Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay²³. Für jeden Cybridisierungsassay muss die optimale Menge an Mitochondrien für den Transfervorgang bestimmt werden (in unserem Fall eine Konzentration zwischen 10-40 μg mitochondrialem Protein pro 10⁶ Zellen).
10. Bereiten Sie gleichzeitig die mit Rhodamin 6G vorbehandelten Zellen für die Fusion vor, indem Sie sie in einem 15-ml-Röhrchen sammeln und 5 Minuten lang bei RT bei 520 x g zentrifugieren. Beachten Sie, dass das Pellet aufgrund der Rhodamin-6G-Behandlung eine neonrosa Farbe erhält.
11. Um sicherzustellen, dass sowohl die Aufhebung der Mitochondrienfunktion in Rezeptorzellen als auch die Organellenreinigung von Spendern ordnungsgemäß durchgeführt wurden, säen Sie eine kleine Anzahl von mit Rhodamin 6G behandelten Zellen und isolierten Mitochondrien unter Verwendung des gesamten Kulturmediums in einer 6-Well-Platte und kultivieren Sie sie einen Monat lang, um sicherzustellen, dass keine überlebenden Zellen in einer der Vertiefungen verbleiben (Abbildung 2).
12. Parallel dazu kann die Abwesenheit von Kernkontaminanten in der mitochondrialen Fraktion durch Immundetektion von Kernproteinen (z. B. Lamin Beta, Histon H3 usw.) oder durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Amplifikation eines nukleären Gens (z. B. SDH, 18S rRNA usw.) bewertet werden.
    Anmerkungen: Um Verunreinigungen zu vermeiden, wird empfohlen, alle Schritte unter aseptischen Bedingungen unter einer Laminar-Flow-Haube durchzuführen.

3. Fusions- und Cybriderzeugung

1. Um mit der Fusion fortzufahren, geben Sie vorsichtig 10⁶ der mit Rhodamin 6G behandelten Zellen in das isolierte Mitochondrienpellet (10-40 μg mitochondriales Protein) und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 520 x g , damit sich die Zellen mit den Mitochondrien vermischen können.
2. Fügen Sie 100 μl Polyethylenglykol (PEG, 50%) hinzu und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig für 30 s. Anschließend weitere 30 s unberührt ruhen lassen.
3. Zum Schluss wird die Mischung in eine 6-Well-Platte mit frischem Zellkulturmedium überführt und bei 37 °C mit 5 % CO₂ in den Inkubator gegeben. Nach einigen Tagen (in der Regel 1 Woche) sollten transmitochondriale Cybriden zu wachsen beginnen (Abbildung 2), wodurch Klone entstehen, die vor ihrer Analyse einzeln ausgewählt oder in einem Pool gemischt werden können.

4. Verifizierung des mitochondrialen und nukleären Hintergrunds

HINWEIS: Sobald die neue Zelllinie etabliert ist und die Zellen exponentiell zu wachsen beginnen, muss die Reinheit ihrer mitochondrialen und nukleären DNA überprüft werden. Daher sollten die ursprünglichen Zelllinien verschiedene Mutationen oder Polymorphismen in ihren Genomen aufweisen, um sie erkennbar zu machen.

1. Totale DNA-Isolierung
   1. Isolieren Sie die genomische DNA aller Zelllinien, die für die Cybrid-Erzeugung verwendet werden, unter Verwendung eines kommerziellen genomischen DNA-Extraktionskits (siehe Materialtabelle) oder durch Durchführung eines Standardprotokolls unter Verwendung von Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion und Alkoholfällung²⁴.
2. mtDNA-Auswertung (Abbildung 3)
   HINWEIS: Verschiedene Techniken, wie z. B. Sequenzierung, RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism) oder allelspezifische qPCR, können durchgeführt werden, um die Reinheit der mtDNA zu analysieren. Um das Vorhandensein von mtDNA-Sequenzvariationen durch RFLP zu bestätigen, befolgen Sie die nächsten Protokollschritte.
   1. Amplifizieren Sie ein mtDNA-Fragment, das die Nukleotidveränderung enthält, mittels PCR.
      1. Hier weisen L929dt-Zellen eine mtDNA-Mutation an Position 4206 auf, innerhalb eines mt-Nd2-Gens (m.4206C>T), das in L929-Zellen fehlt. Um das Vorhandensein dieser Substitution in den transmitochondrialen Cybriden zu bestätigen, wird ein 397 bp großes Fragment mittels PCR unter Verwendung eines Standardprotokolls und der folgenden Primer amplifiziert: 1) 5'-AAGCTATCGGG
         CCCATACCCCG-3' (Positionen 3862-3884) und 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (Positionen 4236-4258).
   2. Analysieren Sie das Vorhandensein der gewünschten Nukleotidsubstitution durch RFLP unter Verwendung einer spezifischen Endonuklease, die die Sequenzänderung erkennt und ein anderes Schnittmuster für beide Zelllinien erzeugt.
      ANMERKUNG: Wenn die mtDNA-Variante L929dt (4206T) vorhanden ist, enthält das in Schritt 4.2.1 erhaltene Amplikon zwei Restriktionsstellen für SspI (siehe Materialtabelle), die drei DNA-Fragmente von 306 bp, 52 bp und 39 bp erzeugen. Die Restriktionsstelle, die die Bänder 52 und 39 erzeugt, wird unterbrochen, wenn die Wildtyp-Version (WT) C4206 vorhanden ist und ein neues Band von 91 bp erscheint. Daher wird eine interne Kontrolle für den vollständigen Aufschluss von SspI in die Analyse einbezogen. Die Aufschlussreaktion wird bei 37 °C gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
   3. Trennen Sie die Restriktionsfragmente durch Elektrophorese und vergleichen Sie das Bandenmuster.
      1. Nach dem Aufschluss werden die erhaltenen Restriktionsfragmente durch Elektrophorese in 10%igen Polyacrylamid-Tris-Borat-EDTA (FSME)-Gelen analysiert (siehe Tabelle 1 für 1x TBE-Zusammensetzung). Führen Sie die Elektrophorese bei 80 V für 1 h bei RT durch. Visualisieren Sie die DNA-Fragmente nach der Gelfärbung in einer Lösung von Ethidiumbromid in 1x TBE für 15 min bei RT (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung der Gelfärbelösung).
3. Genotypisierung der Kern-DNA
   HINWEIS: Die Genotypisierung der Kern-DNA muss unter Verwendung der vorherigen DNA-Extraktionsprobe durchgeführt werden, die für die RFLP-Analyse verwendet wurde.
   1. Amplifizieren Sie 16 Loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 und AMEL) unter Verwendung eines Pools kommerzieller spezifischer Oligonukleotide (siehe Materialtabelle).
   2. Führen Sie eine Elektrophorese mit einem genetischen Analysegerät durch, um die zuvor erhaltenen Fragmente zu trennen.
      HINWEIS: Nach der Amplifikation werden die verschiedenen Loci durch Elektrophorese mit einem Capilar-System analysiert (siehe Materialtabelle). Die Fragmente werden in einem 50 cm langen Kapilar getrennt, das mit einem handelsüblichen Polymer gefüllt ist. Kathoden- und Anodenpuffer sind ebenfalls im Handel erhältlich, wie in der Materialtabelle dargestellt. Die Elektrophorese wird bei 19,5 kV für 20 min bei 60 °C durchgeführt.
   3. Verwenden Sie bioinformatische Werkzeuge, um die Allele zu bestimmen, die jedem amplifizierten Locus entsprechen (siehe Materialtabelle).
   4. Vergleichen Sie die in Schritt 4.3.3 erhaltenen Daten mit der Datenbank des DNA-Profils im Kern (Tabelle 1), um zu überprüfen, ob das DNA-Profil des Kerns mit dem Profil der Zelllinie des Mitochondrienrezeptors übereinstimmt (Abbildung 4).

Ergebnisse

Nach Befolgung des oben vorgestellten Protokolls sollte eine homoplasmatische Cybrid-Zelllinie mit konserviertem Kernhintergrund, aber mit einem neuen Mitochondrien-Genotyp erhalten werden, wie in den Schemata in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Die Reinheit der mitochondrialen und nukleären DNA, die in den Cybriden vorhanden ist, kann durch RFLP (siehe Abbildung 3) und durch eine nukleäre DNA-Genotypisierungsanalyse (sieh...

Diskussion

Seit Otto Warburg berichtete, dass Krebszellen ihren Stoffwechsel verändern und die "aerobe Glykolyse"^3,4 potenzieren, während sie gleichzeitig die mitochondriale Atmung reduzieren^, ist das Interesse an der Rolle der Mitochondrien bei der Transformation und Progression von Krebs exponentiell gewachsen. In den letzten Jahren wurden Mutationen in der mtDNA und mitochondriale Dysfunktionen als Kennzeichen vieler Krebsarten postuliert²⁵. Bis...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750