がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

要約

このプロトコルは、腫瘍形成プロセスにおけるミトコンドリアの役割を研究するためのツールとして、浮遊増殖癌細胞からサイブリッドを生成するための技術について説明しています。

要約

近年、ミトコンドリアと癌の関係を確認することに専念する研究の数が大幅に増加しています。しかし、ミトコンドリアと腫瘍形成の変化を含む関連を完全に理解し、腫瘍関連のミトコンドリア表現型を特定するには、さらに多くの努力が必要です。例えば、腫瘍形成および転移過程におけるミトコンドリアの寄与を評価するためには、異なる核環境における腫瘍細胞からのミトコンドリアの影響を理解することが不可欠です。この目的のために、1つの可能なアプローチは、いわゆるサイブリッド細胞を得るためにミトコンドリアを異なる核の背景に移すことからなる。従来のサイブリダイゼーション技術では、mtDNA(^ρ0、核ドナー細胞)を欠く細胞株に、除核細胞または血小板のいずれかに由来するミトコンドリアが再移植されます。しかしながら、除核プロセスは培養プレートへの良好な細胞接着を必要とし、浸潤性細胞では多くの場合部分的または完全に失われる特徴である。さらに、従来の方法に見られる別の困難は、ミトコンドリアレシピエント細胞株から内因性mtDNAを完全に除去して、純粋な核およびミトコンドリアDNAバックグラウンドを取得し、生成されたサイブリッドに2つの異なるmtDNA種が存在することを回避することです。この研究では、単離されたミトコンドリアを用いたローダミン6G前処理細胞の再増殖に基づいて、浮遊増殖癌細胞に適用されるミトコンドリア交換プロトコルを提示します。この方法論は、従来のアプローチの限界を克服することを可能にし、したがって、癌の進行および転移におけるミトコンドリアの役割の理解を拡大するためのツールとして使用することができる。

概要

エネルギー代謝の再プログラミングは、1930年代にオットー・ウォーバーグによって初めて観察された癌¹の特徴です²。好気性条件下では、正常細胞はグルコースをピルビン酸に変換し、それがアセチルCoAを生成し、ミトコンドリア機構に燃料を供給し、細胞呼吸を促進します。それにもかかわらず、Warburgは、正常酸素条件下でも、ほとんどの癌細胞が解糖プロセスから得られたピルビン酸を乳酸に変換し、エネルギーを得る方法を変えることを実証しました。この代謝調節は「ウォーバーグ効果」として知られており、好気性プロセスよりもATPの生成効率が低いにもかかわらず、一部の癌細胞が急速な成長と分裂に対するエネルギー的な要求を満たすことを可能にします^3,4,5。ここ数十年で、多くの研究が癌の進行における代謝再プログラミングの意味を支持してきました。したがって、腫瘍エネルギー論は癌に対する興味深い標的と考えられています¹。エネルギー代謝と必須前駆体の供給の中心的なハブとして、ミトコンドリアはこれらの細胞適応において重要な役割を果たしていますが、今日まで部分的にしか理解されていません。

プロトコル

注:すべての培地およびバッファー組成は 表1に規定されています。サイブリッドの生成前に、ドナー細胞とレシピエント細胞からのミトコンドリアDNAプロファイルと核DNAプロファイルの両方を入力して、細胞株間の両方のゲノムに遺伝的差異が存在することを確認する必要があります。本研究では、当研究室で自発的に作製した市販のL929細胞株とその由来細胞株L929dt(詳細は¹³ 参照)を用いた。これらの細胞株は、 mt-Nd2 遺伝子の配列に2つの違いがあり、サイブリダイゼーションプロセスが終了した後のmtDNAの純度を確認するために使用できます¹³。この場合、L929dt細胞とは対照的に、L929はジェネチシンに耐性であったため、核バックグラウンドの純度は抗生物質感受性によって確認されました。

1.ローダミン6G処理によるミトコンドリア枯渇(レシピエント細胞)

注:サイブリッドの生成を成功させるための最初のステップは、レシピエント細胞のミトコンドリア機能を完全かつ不可逆的に廃止することです。この目的のために、各細胞株について、ローダミン6Gによる適切な濃度および処理期間を予め決定することが必要である。この適切な濃度は、薬物誘発性細胞死(治療中に細胞を死滅させ....

ディスカッション

Otto Warburgが、がん細胞が代謝をシフトさせ、ミトコンドリア呼吸を減少させながら「好気性解糖」^3,4を増強することを報告して以来、がんの形質転換と進行におけるミトコンドリアの役割への関心は指数関数的に高まっています。近年、mtDNAの変異とミトコンドリア機能障害が、多くの癌型の特徴として仮定されています²⁵。現在?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750