Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletimkokondriyal Cybrid Üretimi

Özet

Bu protokol, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden cybrid üretimi için bir tekniği, mitokondrinin tümörojenik süreçteki rolünü incelemek için bir araç olarak tanımlamaktadır.

Özet

Son yıllarda, mitokondri ve kanser arasındaki bağlantıyı tespit etmeye adanmış çalışmaların sayısı önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, mitokondri ve tümörigenezdeki değişiklikleri içeren bağlantıyı tam olarak anlamak ve tümörle ilişkili mitokondriyal fenotipleri tanımlamak için daha fazla çabaya ihtiyaç vardır. Örneğin, mitokondrinin tümörigenez ve metastaz süreçlerine katkısını değerlendirmek için, mitokondrinin farklı nükleer ortamlardaki tümör hücrelerinden etkisini anlamak önemlidir. Bu amaçla, olası bir yaklaşım, sözde cybrid hücrelerini elde etmek için mitokondrinin farklı bir nükleer arka plana aktarılmasından oluşur. Geleneksel sibridizasyon tekniklerinde, mtDNA'dan (ρ⁰, nükleer donör hücre) yoksun bir hücre hattı, enüklee hücrelerden veya trombositlerden türetilen mitokondri ile yeniden doldurulur. Bununla birlikte, enükleasyon işlemi, invaziv hücrelerde birçok durumda kısmen veya tamamen kaybolan bir özellik olan kültür plakasına iyi hücre yapışmasını gerektirir. Ek olarak, geleneksel yöntemlerde bulunan bir diğer zorluk, saf nükleer ve mitokondriyal DNA arka planları elde etmek için endojen mtDNA'nın mitokondriyal alıcı hücre hattından tamamen çıkarılmasını sağlamak ve üretilen sibritte iki farklı mtDNA türünün varlığından kaçınmaktır. Bu çalışmada, izole mitokondri ile rodamin 6G ile önceden işlenmiş hücrelerin yeniden popülasyonuna dayanan süspansiyon büyüyen kanser hücrelerine uygulanan bir mitokondriyal değişim protokolü sunuyoruz. Bu metodoloji, geleneksel yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelmemizi sağlar ve böylece kanser ilerlemesi ve metastazındaki mitokondriyal rolün anlaşılmasını genişletmek için bir araç olarak kullanılabilir.

Giriş

Enerji metabolizmasının yeniden programlanması, 1930'larda Otto Warburg tarafından ilk kez gözlemlenen kanser^1'in ayırt edici bir özelliğidir². Aerobik koşullar altında, normal hücreler glikozu piruvat'a dönüştürür, bu da asetil-coA üretir, mitokondriyal makineyi besler ve hücresel solunumu teşvik eder. Bununla birlikte, Warburg, normoksik koşullar altında bile, çoğu kanser hücresinin glikoliz işleminden elde edilen piruvatı laktata dönüştürdüğünü ve enerji elde etme yollarını değiştirdiğini göstermiştir. Bu metabolik ayarlama "Warburg etkisi" olarak bilinir ve bazı kanser hücrelerinin, ATP'yi aerobik süreçten daha az ve....

Protokol

NOT: Tüm kültür ortamları ve tampon bileşimleri Tablo 1'de belirtilmiştir. Sibrid üretiminden önce, hücre hatları arasındaki her iki genomda genetik farklılıkların varlığını doğrulamak için donör ve alıcı hücrelerden hem mitokondriyal hem de nükleer DNA profilleri yazılmalıdır. Bu çalışmada, ticari olarak temin edilebilen bir L929 hücre hattı ve laboratuvarımızda kendiliğinden oluşan türetilmiş hücre hattı L929dt kullanılmıştır (daha fazla bilgi için^{bkz. 13} ). Bu hücre hatları, mt-Nd2 genlerinin dizisinde, sibridizasyon işlemi tamamlandıktan sonra mtDNA'nın saflığını doğrulamak için kullanılabilecek iki farklılık göste....

Tartışmalar

Otto Warburg, kanser hücrelerinin metabolizmalarını değiştirdiğini ve mitokondriyal solunumu azaltırken "aerobik glikoliz"^i3,4 güçlendirdiğini bildirdiğinden^, mitokondrinin kanser dönüşümü ve ilerlemesindeki rolüne olan ilgi katlanarak artmıştır. Son yıllarda, mtDNA'daki mutasyonlar ve mitokondriyal disfonksiyon, birçok kanser tipi^25'in ayırt edici özellikleri olarak kabul edilmiştir. Bugüne kadar, çok sayıda ç.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750