Génération transmitochondriale de Cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses

Résumé

Ce protocole décrit une technique de génération de cybrides à partir de cellules cancéreuses en suspension comme outil pour étudier le rôle des mitochondries dans le processus tumorigénique.

Résumé

Ces dernières années, le nombre d’études consacrées à la détermination du lien entre les mitochondries et le cancer a considérablement augmenté. Cependant, des efforts supplémentaires sont encore nécessaires pour bien comprendre le lien impliquant des altérations dans les mitochondries et la tumorigenèse, ainsi que pour identifier les phénotypes mitochondriaux associés aux tumeurs. Par exemple, pour évaluer la contribution des mitochondries dans les processus de tumorigenèse et de métastase, il est essentiel de comprendre l’influence des mitochondries des cellules tumorales dans différents environnements nucléaires. À cette fin, une approche possible consiste à transférer les mitochondries dans un fond nucléaire différent pour obtenir les cellules dites cybrides. Dans les techniques traditionnelles de cybridisation, une lignée cellulaire dépourvue d’ADNmt (ρ⁰, cellule donneuse nucléaire) est repeuplée avec des mitochondries dérivées de cellules énucléées ou de plaquettes. Cependant, le processus d’énucléation nécessite une bonne adhérence cellulaire à la plaque de culture, une caractéristique qui est partiellement ou complètement perdue dans de nombreux cas dans les cellules invasives. En outre, une autre difficulté trouvée dans les méthodes traditionnelles est d’obtenir l’élimination complète de l’ADNmt endogène de la lignée cellulaire mitochondriale réceptrice pour obtenir des arrière-plans d’ADN nucléaire et mitochondrial pur, évitant ainsi la présence de deux espèces d’ADNmt différentes dans la cybride générée. Dans ce travail, nous présentons un protocole d’échange mitochondrial appliqué aux cellules cancéreuses en suspension basée sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées. Cette méthodologie nous permet de surmonter les limites des approches traditionnelles et peut donc être utilisée comme un outil pour élargir la compréhension du rôle mitochondrial dans la progression du cancer et les métastases.

Introduction

La reprogrammation du métabolisme énergétique est une caractéristique du cancer¹ qui a été observé pour la première fois par Otto Warburg dans les années 1930². Dans des conditions aérobies, les cellules normales convertissent le glucose en pyruvate, qui génère ensuite de l’acétyl-coA, alimentant la machinerie mitochondriale et favorisant la respiration cellulaire. Néanmoins, Warburg a démontré que, même dans des conditions normoxiques, la plupart des cellules cancéreuses convertissent le pyruvate obtenu par le processus de glycolyse en lactate, changeant leur façon d’obtenir de l’énergie. Cet ajustement métabolique est connu sous le nom d'« effet Warburg » et permet à certaines cellules cancéreuses de répondre à leurs besoins énergétiques pour une croissance et une division rapides, malgré la génération d’ATP moins efficace que le processus aérobie ^3,4,5. Au cours des dernières décennies, de nombreux travaux ont soutenu l’implication de la reprogrammation du métabolisme dans la progression du cancer. Par conséquent, l’énergétique tumorale est considérée comme une cible intéressante contre le cancer¹. En tant que plaque tournante du métabolisme énergétique et de l’approvisionnement en précurseurs essentiels, les mitochondries jouent un rôle clé dans ces adaptations cellulaires que, à ce jour, nous ne comprenons que partiellement.

Conformément à ce qui précède, des mutations de l’ADN mitochondrial (ADNmt) ont été proposées comme l’une des causes possibles de cette reprogrammation métabolique, ce qui pourrait entraîner une altération de la performance de la chaîne^de transport d’électrons (ETC) 6 et expliquerait pourquoi certaines cellules cancéreuses améliorent leur métabolisme glycolytique pour survivre. En effet, il a été rapporté que l’ADNmt accumule des mutations au sein des cellules cancéreuses, étant présent dans au moins 50% des^tumeurs7. Par exemple, une étude récente menée par Yuan et al. a rapporté la présence de molécules d’ADNmt hypermutées et tronquées dans les cancers du rein, colorectal et thyroïdien⁸. De plus, de nombreux travaux ont démontré que certaines mutations de l’ADNmt sont associées à un phénotype tumoral plus agressif et à une augmentation du potentiel métastatique des cellules cancéreuses 9,10,11,12,13,14,15,16.

Malgré la pertinence apparente du génome mitochondrial dans la progression du cancer, l’étude de ces mutations et de leur contribution à la maladie a été difficile en raison des limites des modèles expérimentaux et des technologies actuellement disponibles¹⁷. Ainsi, de nouvelles techniques pour comprendre l’impact réel de l’ADN mitochondrial dans le développement et la progression de la maladie cancéreuse sont nécessaires. Dans ce travail, nous introduisons un protocole pour la génération de cybrides transmitochondriales à partir de cellules cancéreuses en suspension à croissance, basé sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées, qui surmonte les principaux défis des méthodes traditionnelles de cybridisation^18,19. Cette méthodologie permet l’utilisation de n’importe quel donneur de noyaux, indépendamment de la disponibilité de leur lignée cellulaire ρ⁰ correspondante et le transfert de mitochondries à partir de cellules qui, selon les techniques traditionnelles, seraient difficiles à énucléer (c’est-à-dire des lignées cellulaires non adhérentes).

Protocole

REMARQUE : Tous les milieux de culture et compositions tampons sont spécifiés dans le tableau 1. Avant la génération de cybrides, les profils d’ADN mitochondrial et nucléaire des cellules donneuses et receveuses doivent être typés pour confirmer la présence de différences génétiques dans les deux génomes entre les lignées cellulaires. Dans cette étude, une lignée cellulaire L929 disponible dans le commerce et sa lignée cellulaire dérivée, L929dt, qui a été générée spontanément dans notre laboratoire (voir¹³ pour plus d’informations) ont été utilisées. Ces lignées cellulaires présentent deux différences dans la séquence de leur gène mt-Nd2 qui peuvent être utilisées pour confirmer la pureté de l’ADNmt une fois le processus de cybridisation terminé¹³. Dans ce cas, la pureté du fond nucléaire a été confirmée par la sensibilité aux antibiotiques, car, contrairement aux cellules L929dt, les L929 étaient résistantes à la génétique.

1. Déplétion mitochondriale par traitement à la rhodamine 6G (cellules receveuses)

REMARQUE: La première étape pour une génération réussie de cybride est d’abolir complètement et irréversiblement les fonctions mitochondriales dans les cellules receveuses. À cette fin, il est nécessaire de déterminer au préalable, pour chaque lignée cellulaire, la concentration appropriée et la durée du traitement avec la rhodamine 6G. Cette concentration adéquate devrait être juste en dessous de la mort cellulaire induite par le médicament (la plus élevée qui ne tue pas les cellules pendant le traitement). Effectuez les opérations suivantes une fois les conditions optimales définies.

1. Ensemencer 10 à 6 cellules dans une plaque à 6 puits en utilisant un milieu de culture complet (voir le tableau 1 pour plus de détails) et les traiter quotidiennement avec la concentration optimale de rhodamine 6G pendant 3^à 10 jours, selon la lignée cellulaire. Les concentrations traditionnelles varient de 2 à 5 μg/mL pendant 3 à 10 jours^20,21. Dans cette étude, pour les cellules dérivées de L929, 2,5 μg/mL de rhodamine 6G pendant 7 jours était le traitement sélectionné^13,22.
2. Pour garder les cellules en vie, complétez le milieu de culture cellulaire avec 50 μg/mL d’uridine et 100 μg/mL de pyruvate et renouvelez-le toutes les 24 heures.
3. Après traitement et avant fusion, changer le milieu des cellules traitées à la rhodamine 6G pour compléter le milieu de culture cellulaire sans rhodamine 6G, et les laisser dans ce milieu pendant 3-4 h dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂.
   REMARQUE: L’effet toxique de la rhodamine 6G est irréversible et les cellules avec des mitochondries non fonctionnelles ne devraient pas récupérer²⁰. Ainsi, après le traitement, les cellules qui ne reçoivent pas de mitochondries fonctionnelles devraient mourir même dans un milieu de culture supplémenté en uridine. Par conséquent, aucune sélection nucléaire ne devrait être nécessaire. Cependant, une fusion témoin de cellules traitées à la rhodamine 6G sans mitochondries est recommandée.

2. Expansion et isolement mitochondrial (cellules donneuses)

1. Développer les cellules donneuses de mitochondries pendant le laps de temps du traitement à la rhodamine 6G pour obtenir environ 25 x 10⁶ cellules.
2. Le jour 7, récoltez des cellules à croissance exponentielle dans un tube de 50 ml et recueillez-les par centrifugation à 520 x g pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Laver les cellules 3x avec une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) et les sédimenter par centrifugation à 520 x g pendant 5 min à TA. Désormais, effectuez toutes les étapes de l’extraction mitochondriale à 4 °C, en utilisant des réactifs froids et en maintenant les tubes avec des cellules ou des mitochondries sur de la glace.
3. Après la troisième centrifugation, éliminer le surnageant par aspiration à l’aide d’une pipette en verre couplée à une pompe à vide et remettre en suspension les cellules emballées dans un volume de tampon hypotonique égal à 7x le volume de granulés de la cellule. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube homogénéisateur et laissez les cellules gonfler en les incubant sur de la glace pendant 2 min.
4. Casser les membranes cellulaires en effectuant 8 à 10 coups dans l’homogénéisateur couplé à un pilon motorisé tournant à 600 tr/min.
   REMARQUE: L’étape de la perturbation de la membrane cellulaire peut varier selon les types de cellules; Ainsi, il doit être optimisé pour chaque type de cellule.
5. Ajouter le même volume de tampon hypertonique à la suspension cellulaire (7x le volume de pastilles de cellule) pour générer un environnement isotonique.
6. Transférer l’homogénat dans un tube de 15 mL et le centrifuger dans un rotor fixe à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Ensuite, prélevez seulement les 3/4 du surnageant en laissant une grande marge de la pastille, pour éviter la contamination par des noyaux ou des cellules intactes, et transférez-le dans un autre tube. Répétez le même processus deux fois. Notez que le surnageant doit être conservé et la pastille jetée.
7. Conserver la fraction mitochondriale (surnageant). Transvasez-le dans des tubes de 1,5 mL et centrifugez à vitesse maximale (18 000 x g) pendant 2 min à 4 °C.
8. Jeter le surnageant et laver la pastille enrichie en mitochondries avec le tampon A, en combinant le contenu des deux tubes en un seul et en centrifugeant dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 2.7. Répétez le même processus jusqu’à ce que tout le matériau soit dans un seul tube.
9. Faites un lavage supplémentaire avec 300 μL de tampon A et quantifiez la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du test Bradford²³. Pour chaque test de cybridisation, la quantité optimale de mitochondries pour la procédure de transfert doit être déterminée (dans notre cas, une concentration comprise entre 10 et 40 μg de protéines mitochondriales pour 10^{à 6} cellules).
10. Simultanément, préparer les cellules prétraitées à la rhodamine 6G pour la fusion en les recueillant dans un tube de 15 mL et en centrifugeant à 520 x g pendant 5 min à TA. A noter que la pastille acquiert une couleur rose néon grâce au traitement à la rhodamine 6G.
11. Pour s’assurer que l’abolition de la fonction mitochondriale dans les cellules réceptrices ainsi que la purification des organites des donneurs ont été correctement effectuées, ensemencer un petit nombre de cellules traitées à la rhodamine 6G et isoler les mitochondries en utilisant le milieu de culture complet dans une plaque à 6 puits et les cultiver pendant un mois pour vérifier qu’il ne reste aucune cellule survivante dans l’un des puits (Figure 2).
12. En parallèle, évaluer l’absence de contaminants noyaux dans la fraction mitochondriale par immunodétection de protéines nucléaires (c.-à-d. lamin bêta, histone H3, etc.) ou par amplification quantitative de la réaction en chaîne de la polymérase (qPCR) d’un gène nucléaire (c.-à-d. SDH, ARNr 18S, etc.).
    REMARQUE: Pour éviter les contaminations, il est recommandé d’effectuer toutes les étapes dans des conditions aseptiques en travaillant sous une hotte à flux laminaire.

3. Fusion et génération de cybrides

1. Pour procéder à la fusion, ajoutez soigneusement 10⁶ des cellules traitées à la rhodamine 6G à la pastille de mitochondrie isolée (10-40 μg de protéine mitochondriale) et centrifugez à 520 x g pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se mélanger aux mitochondries.
2. Ajouter 100 μL de polyéthylène glycol (PEG, 50%) et remettre délicatement la pastille en suspension pendant 30 s. Ensuite, laissez reposer intact pendant encore 30 s.
3. Enfin, transférer le mélange dans une plaque à 6 puits avec un milieu de culture cellulaire complet frais et placer dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂. Après quelques jours (généralement 1 semaine), les cybrides transmitochondriales devraient commencer à croître (Figure 2), donnant naissance à des clones qui peuvent être sélectionnés individuellement ou mélangés dans un pool avant leur analyse.

4. Vérification du fond mitochondrial et nucléaire

REMARQUE: Une fois que la nouvelle lignée cellulaire a été établie et que les cellules commencent à croître exponentiellement, la pureté de leurs ADN mitochondriaux et nucléaires doit être vérifiée. Ainsi, les lignées cellulaires d’origine devraient abriter différentes mutations ou polymorphismes dans leurs génomes pour les rendre reconnaissables.

1. Isolement total de l’ADN
   1. Isoler l’ADN génomique de toutes les lignées cellulaires utilisées pour la génération de cybrides en utilisant une trousse commerciale d’extraction d’ADN génomique (voir le tableau des matériaux) ou en effectuant un protocole standard utilisant l’extraction à l’alcool phénol-chloroforme-isoamylique et la précipitation de l’alcool²⁴.
2. évaluation de l’ADNmt (Figure 3)
   REMARQUE: Plusieurs techniques, telles que le séquençage, l’analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) ou la qPCR spécifique aux allèles, peuvent être effectuées pour analyser la pureté de l’ADNmt. Pour confirmer la présence de variations de séquence d’ADNmt par RFLP, suivez les étapes suivantes du protocole.
   1. Amplifier un fragment d’ADNmt contenant le changement de nucléotide par PCR.
      1. Ici, les cellules L929dt présentent une mutation de l’ADNmt en position 4206, dans un gène mt-Nd2 (m.4206C>T) absent dans les cellules L929. Pour confirmer la présence de cette substitution dans les cybrides transmitochondriales, amplifier un fragment de 397 pb par PCR en utilisant un protocole standard et les amorces suivantes : 1) 5'-AAGCTATCGGG
         CCCATACCCCG-3' (positions 3862-3884) et 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (positions 4236-4258).
   2. Analyser la présence de la substitution nucléotidique souhaitée par RFLP, en utilisant une endonucléase spécifique qui reconnaît le changement de séquence et génère un modèle de coupe différent pour les deux lignées cellulaires.
      REMARQUE: Lorsque le variant d’ADNmt L929dt est présent (4206T), l’amplicon obtenu à l’étape 4.2.1 contient deux sites de restriction pour SspI (voir Tableau des matériaux) qui produit trois fragments d’ADN de 306 pb, 52 pb et 39 pb. Le site de restriction qui génère les bandes 52 et 39 est perturbé lorsque la version de type sauvage (WT) C4206 est présente et qu’une nouvelle bande de 91 pb apparaît. Par conséquent, un contrôle interne pour la digestion complète de SspI est inclus dans l’analyse. La réaction de digestion est effectuée à 37 °C, en suivant les instructions du fabricant.
   3. Séparez les fragments de restriction par électrophorèse et comparez le diagramme de bande.
      1. Une fois la digestion effectuée, analyser les fragments de restriction obtenus par électrophorèse dans des gels polyacrylamide-Tris-borate-EDTA (TBE) à 10% (voir Tableau 1 pour 1x composition en TBE). Exécutez l’électrophorèse à 80 V pendant 1 h à TA. Visualisez les fragments d’ADN après coloration au gel dans une solution de bromure d’éthidium dans 1x TBE pendant 15 min à TA (voir le tableau 1 pour la composition de la solution de coloration en gel).
3. Génotypage de l’ADN nucléaire
   REMARQUE : Le génotypage de l’ADN nucléaire doit être effectué à l’aide de l’échantillon d’extraction d’ADN précédent utilisé pour l’analyse RFLP.
   1. Amplifiez 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 et AMEL) en utilisant un pool d’oligonucléotides spécifiques au commerce (voir le tableau des matériaux).
   2. Effectuer une électrophorèse à l’aide d’un analyseur génétique afin de séparer les fragments précédemment obtenus.
      NOTE: Une fois amplifiés, les différents loci sont analysés par électrophorèse à l’aide d’un système capilaire (voir tableau des matériaux). Les fragments sont séparés dans une capilaire de 50 cm de long remplie d’un polymère commercial. Des tampons cathodiques et anodiques sont également disponibles dans le commerce, comme le montre le tableau des matériaux. L’électrophorèse est réalisée à 19,5 kV pendant 20 min à 60 °C.
   3. Utiliser des outils bioinformatiques pour déterminer les allèles correspondant à chaque locus amplifié (voir Tableau des matériaux).
   4. Comparer les données obtenues à l’étape 4.3.3 avec la base de données du profil d’ADN nucléaire (tableau 1), pour vérifier si le profil d’ADN nucléaire correspond au profil de la lignée cellulaire du récepteur mitochondrial (Figure 4).

Résultats

Après avoir suivi le protocole présenté ci-dessus, une lignée cellulaire cybride homoplasmique avec un fond nucléaire conservé mais avec un nouveau génotype mitochondrial devrait être obtenue, comme représenté dans les schémas de la figure 1 et de la figure 2. La pureté de l’ADN mitochondrial et nucléaire présent dans les cybrides peut être confirmée par RFLP, comme le montre la figure 3, et par l’analyse du gén...

Discussion

Depuis qu’Otto Warburg a rapporté que les cellules cancéreuses modifient leur métabolisme et potentialisent la « glycolyse aérobie »^3,4 tout en réduisant la respiration mitochondriale^, l’intérêt pour le rôle des mitochondries dans la transformation et la progression du cancer a augmenté de façon exponentielle. Ces dernières années, des mutations dans l’ADNmt et le dysfonctionnement mitochondrial ont été postulés comme caractéristiques de n...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750