A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.
בשנים האחרונות חלה עלייה משמעותית במספר המחקרים המוקדשים לבירור הקשר בין מיטוכונדריה לסרטן. עם זאת, עדיין נדרשים מאמצים נוספים כדי להבין באופן מלא את הקשר הכרוך בשינויים במיטוכונדריה ובגידולים, כמו גם לזהות פנוטיפים מיטוכונדריאליים הקשורים לגידול. לדוגמה, כדי להעריך את תרומתם של מיטוכונדריה בתהליכי גידולים וגרורות, חיוני להבין את השפעת המיטוכונדריה מתאי הגידול בסביבות גרעיניות שונות. לשם כך, גישה אפשרית אחת כוללת העברת מיטוכונדריה לרקע גרעיני אחר כדי להשיג את מה שמכונה תאי ציבריד (cybrid). בטכניקות הציברידגיזציה המסורתיות, קו תאים חסר mtDNA (ρ0, תא תורם גרעיני) מאוכלס מחדש במיטוכונדריה שמקורה בתאים או טסיות דם. עם זאת, תהליך ההדבקה של התאים דורש הידבקות טובה של התאים לצלחת התרבית, תכונה שאובדת באופן חלקי או מלא במקרים רבים בתאים פולשניים. בנוסף, קושי נוסף שנמצא בשיטות המסורתיות הוא השגת הסרה מלאה של mtDNA אנדוגני מקו התאים המקבל המיטוכונדריאלי כדי לקבל רקע DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי טהור, תוך הימנעות מנוכחות של שני מיני mtDNA שונים בציבריד שנוצר. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חילופי מיטוכונדריה המיושם על תאים סרטניים הגדלים בתרחיף, בהתבסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו מראש ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להתגבר על מגבלות הגישות המסורתיות, ובכך יכולה לשמש ככלי להרחבת הבנת התפקיד המיטוכונדריאלי בהתקדמות סרטן וגרורות.
תכנות מחדש של מטבוליזם אנרגיה הוא סימן ההיכר של סרטן1 שנצפה לראשונה על ידי אוטו ורבורג בשנות השלושים2. בתנאים אירוביים, תאים נורמליים ממירים גלוקוז לפירובט, שמייצר אצטיל-CoA, מתדלק את המנגנון המיטוכונדריאלי ומקדם נשימה תאית. עם זאת, ורבורג הראה כי גם בתנאים נורמוקסיים, רוב התאים הסרטניים ממירים פירובט המתקבל מתהליך הגליקוליזה ללקטט, ומשנים את דרכם להשגת אנרגיה. התאמה מטבולית זו ידועה בשם "אפקט ורבורג" ומאפשרת לחלק מתאי הסרטן לספק את דרישותיהם האנרגטיות לגדילה וחלוקה מהירה, למרות ייצור ATP ביעילות פחותה מהתהליך האירובי 3,4,5. בעש....
הערה: כל מדיית התרבות והרכבי החיץ מפורטים בטבלה 1. לפני יצירת ציבריד יש להקליד פרופילי דנ"א מיטוכונדריאלי וגרעיני מתאי התורם והמקבל כדי לאשר את קיומם של הבדלים גנטיים בשני הגנומים בין שורות התא. במחקר זה נעשה שימוש בקו תאי L929 זמין מסחרית וקו התאים הנגזר ממנו, L929dt, שנוצר באופן ספונטני במעבדה שלנו (ראו13 למידע נוסף). קווי תאים אלה מציגים שני הבדלים ברצף הגן mt-Nd2 שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאשר את טוהר mtDNA לאחר השלמת תהליך cybridization13. במקרה זה, טוהר הרקע הגרעיני אושר על ידי רגישות לאנטיביוטיקה, שכן, בניגוד לתאי L929dt, L929 היו עמידים לגנטיקה.
1. ד....
לאחר ביצוע הפרוטוקול שהוצג לעיל, יש לקבל קו תאי ציבריד הומופלסמיים עם רקע גרעיני שמור אך עם גנוטיפ מיטוכונדריה חדש, כפי שמיוצג בסכמות באיור 1 ובאיור 2. טוהר הדנ"א המיטוכונדריאלי והגרעיני שנמצא בציברידים יכול להיות מאושר על-ידי RFLP, כפי שמוצג באיור .......
מאז שאוטו ורבורג דיווח כי תאים סרטניים משנים את חילוף החומרים שלהם ומעצימים "גליקוליזה אירובית"3,4 תוך הפחתת הנשימה המיטוכונדריאלית, העניין בתפקיד המיטוכונדריה בטרנספורמציה ובהתקדמות סרטן גדל באופן אקספוננציאלי. בשנים האחרונות, מוטציות ב- mtDNA ותפקוד לקוי ש.......
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
מחקר זה מומן על ידי מענק מספר PID2019-105128RB-I00 ל- RSA, JMB ו- AA, ו- PGC2018-095795-B-I00 ל- PFS ו- RML, שניהם מומנו על ידי MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ומספרי מענקים B31_20R (RSA, JMA ו- AA) ו- E35_17R (PFS ו- RML) ומומנו על ידי Gobierno de Aragón. העבודה של RSA נתמכה על ידי מענק של Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. המחברים מבקשים להכיר בשימוש ב-Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
Boric acid | PanReac | 131015 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
EDTA | PanReac | 131026 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
Geneticin | Gibco | 10131027 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
SspI | New England Biolabs | R3132 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris | PanReac | P14030b | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved