A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.

Abstract

בשנים האחרונות חלה עלייה משמעותית במספר המחקרים המוקדשים לבירור הקשר בין מיטוכונדריה לסרטן. עם זאת, עדיין נדרשים מאמצים נוספים כדי להבין באופן מלא את הקשר הכרוך בשינויים במיטוכונדריה ובגידולים, כמו גם לזהות פנוטיפים מיטוכונדריאליים הקשורים לגידול. לדוגמה, כדי להעריך את תרומתם של מיטוכונדריה בתהליכי גידולים וגרורות, חיוני להבין את השפעת המיטוכונדריה מתאי הגידול בסביבות גרעיניות שונות. לשם כך, גישה אפשרית אחת כוללת העברת מיטוכונדריה לרקע גרעיני אחר כדי להשיג את מה שמכונה תאי ציבריד (cybrid). בטכניקות הציברידגיזציה המסורתיות, קו תאים חסר mtDNA (ρ0, תא תורם גרעיני) מאוכלס מחדש במיטוכונדריה שמקורה בתאים או טסיות דם. עם זאת, תהליך ההדבקה של התאים דורש הידבקות טובה של התאים לצלחת התרבית, תכונה שאובדת באופן חלקי או מלא במקרים רבים בתאים פולשניים. בנוסף, קושי נוסף שנמצא בשיטות המסורתיות הוא השגת הסרה מלאה של mtDNA אנדוגני מקו התאים המקבל המיטוכונדריאלי כדי לקבל רקע DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי טהור, תוך הימנעות מנוכחות של שני מיני mtDNA שונים בציבריד שנוצר. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חילופי מיטוכונדריה המיושם על תאים סרטניים הגדלים בתרחיף, בהתבסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו מראש ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להתגבר על מגבלות הגישות המסורתיות, ובכך יכולה לשמש ככלי להרחבת הבנת התפקיד המיטוכונדריאלי בהתקדמות סרטן וגרורות.

Introduction

תכנות מחדש של מטבוליזם אנרגיה הוא סימן ההיכר של סרטן1 שנצפה לראשונה על ידי אוטו ורבורג בשנות השלושים2. בתנאים אירוביים, תאים נורמליים ממירים גלוקוז לפירובט, שמייצר אצטיל-CoA, מתדלק את המנגנון המיטוכונדריאלי ומקדם נשימה תאית. עם זאת, ורבורג הראה כי גם בתנאים נורמוקסיים, רוב התאים הסרטניים ממירים פירובט המתקבל מתהליך הגליקוליזה ללקטט, ומשנים את דרכם להשגת אנרגיה. התאמה מטבולית זו ידועה בשם "אפקט ורבורג" ומאפשרת לחלק מתאי הסרטן לספק את דרישותיהם האנרגטיות לגדילה וחלוקה מהירה, למרות ייצור ATP ביעילות פחותה מהתהליך האירובי 3,4,5. בעש....

Protocol

הערה: כל מדיית התרבות והרכבי החיץ מפורטים בטבלה 1. לפני יצירת ציבריד יש להקליד פרופילי דנ"א מיטוכונדריאלי וגרעיני מתאי התורם והמקבל כדי לאשר את קיומם של הבדלים גנטיים בשני הגנומים בין שורות התא. במחקר זה נעשה שימוש בקו תאי L929 זמין מסחרית וקו התאים הנגזר ממנו, L929dt, שנוצר באופן ספונטני במעבדה שלנו (ראו13 למידע נוסף). קווי תאים אלה מציגים שני הבדלים ברצף הגן mt-Nd2 שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאשר את טוהר mtDNA לאחר השלמת תהליך cybridization13. במקרה זה, טוהר הרקע הגרעיני אושר על ידי רגישות לאנטיביוטיקה, שכן, בניגוד לתאי L929dt, L929 היו עמידים לגנטיקה.

1. ד....

תוצאות

לאחר ביצוע הפרוטוקול שהוצג לעיל, יש לקבל קו תאי ציבריד הומופלסמיים עם רקע גרעיני שמור אך עם גנוטיפ מיטוכונדריה חדש, כפי שמיוצג בסכמות באיור 1 ובאיור 2. טוהר הדנ"א המיטוכונדריאלי והגרעיני שנמצא בציברידים יכול להיות מאושר על-ידי RFLP, כפי שמוצג באיור .......

Discussion

מאז שאוטו ורבורג דיווח כי תאים סרטניים משנים את חילוף החומרים שלהם ומעצימים "גליקוליזה אירובית"3,4 תוך הפחתת הנשימה המיטוכונדריאלית, העניין בתפקיד המיטוכונדריה בטרנספורמציה ובהתקדמות סרטן גדל באופן אקספוננציאלי. בשנים האחרונות, מוטציות ב- mtDNA ותפקוד לקוי ש.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענק מספר PID2019-105128RB-I00 ל- RSA, JMB ו- AA, ו- PGC2018-095795-B-I00 ל- PFS ו- RML, שניהם מומנו על ידי MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ומספרי מענקים B31_20R (RSA, JMA ו- AA) ו- E35_17R (PFS ו- RML) ומומנו על ידי Gobierno de Aragón. העבודה של RSA נתמכה על ידי מענק של Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. המחברים מבקשים להכיר בשימוש ב-Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3500XL Genetic Analyzer ThermoFisher Scientific4406016
6-well plateCorning08-772-1B
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification KitThermoFisher Scientific4427368
Anode Buffer Container 3500 SeriesApplied Biosystems4393927
Boric acidPanReac131015
Bradford assayBiorad5000002
Cathode Buffer Container 3500 SeriesApplied Biosystems4408256
Cell culture flasksTPP90076
DMEM high glucoseGibco11965092
EDTAPanReac131026
Ethidium BromideSigma-AldrichE8751
GeneticinGibco10131027
Homogenizer Teflon pestleDeltalab196102
L929 cell lineATCCCCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel SystemBioRad1658004
MOPSSigma-AldrichM1254
PCR primersSigma-AldrichCustom products
Polyacrylamide Solution 30%PanReacA3626
Polyethylene glycolSigma-AldrichP7181
POP-7Applied Biosystems4393714
PyruvateSigma-AldrichP5280
QIAmp DNA Mini KitQiagen51306
Rhodamine-6GSigma-AldrichR4127
Serum Fetal BovineSigma-AldrichF7524
SspINew England BiolabsR3132
Streptomycin/penicillinPAN biotechP06-07100
SucroseSigma-AldrichS3089
TEMEDSigma-AldrichT9281
TrisPanReacP14030b
UridineSigma-AldrichU3750

References

  1. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  2. Wind, F., Warburg, O. H. . The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , (1930).
  3. Warburg, O.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved