יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.

Abstract

בשנים האחרונות חלה עלייה משמעותית במספר המחקרים המוקדשים לבירור הקשר בין מיטוכונדריה לסרטן. עם זאת, עדיין נדרשים מאמצים נוספים כדי להבין באופן מלא את הקשר הכרוך בשינויים במיטוכונדריה ובגידולים, כמו גם לזהות פנוטיפים מיטוכונדריאליים הקשורים לגידול. לדוגמה, כדי להעריך את תרומתם של מיטוכונדריה בתהליכי גידולים וגרורות, חיוני להבין את השפעת המיטוכונדריה מתאי הגידול בסביבות גרעיניות שונות. לשם כך, גישה אפשרית אחת כוללת העברת מיטוכונדריה לרקע גרעיני אחר כדי להשיג את מה שמכונה תאי ציבריד (cybrid). בטכניקות הציברידגיזציה המסורתיות, קו תאים חסר mtDNA (ρ⁰, תא תורם גרעיני) מאוכלס מחדש במיטוכונדריה שמקורה בתאים או טסיות דם. עם זאת, תהליך ההדבקה של התאים דורש הידבקות טובה של התאים לצלחת התרבית, תכונה שאובדת באופן חלקי או מלא במקרים רבים בתאים פולשניים. בנוסף, קושי נוסף שנמצא בשיטות המסורתיות הוא השגת הסרה מלאה של mtDNA אנדוגני מקו התאים המקבל המיטוכונדריאלי כדי לקבל רקע DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי טהור, תוך הימנעות מנוכחות של שני מיני mtDNA שונים בציבריד שנוצר. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חילופי מיטוכונדריה המיושם על תאים סרטניים הגדלים בתרחיף, בהתבסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו מראש ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להתגבר על מגבלות הגישות המסורתיות, ובכך יכולה לשמש ככלי להרחבת הבנת התפקיד המיטוכונדריאלי בהתקדמות סרטן וגרורות.

Introduction

תכנות מחדש של מטבוליזם אנרגיה הוא סימן ההיכר של סרטן¹ שנצפה לראשונה על ידי אוטו ורבורג בשנות השלושים². בתנאים אירוביים, תאים נורמליים ממירים גלוקוז לפירובט, שמייצר אצטיל-CoA, מתדלק את המנגנון המיטוכונדריאלי ומקדם נשימה תאית. עם זאת, ורבורג הראה כי גם בתנאים נורמוקסיים, רוב התאים הסרטניים ממירים פירובט המתקבל מתהליך הגליקוליזה ללקטט, ומשנים את דרכם להשגת אנרגיה. התאמה מטבולית זו ידועה בשם "אפקט ורבורג" ומאפשרת לחלק מתאי הסרטן לספק את דרישותיהם האנרגטיות לגדילה וחלוקה מהירה, למרות ייצור ATP ביעילות פחותה מהתהליך האירובי ^3,4,5. בעש....

Protocol

הערה: כל מדיית התרבות והרכבי החיץ מפורטים בטבלה 1. לפני יצירת ציבריד יש להקליד פרופילי דנ"א מיטוכונדריאלי וגרעיני מתאי התורם והמקבל כדי לאשר את קיומם של הבדלים גנטיים בשני הגנומים בין שורות התא. במחקר זה נעשה שימוש בקו תאי L929 זמין מסחרית וקו התאים הנגזר ממנו, L929dt, שנוצר באופן ספונטני במעבדה שלנו (ראו¹³ למידע נוסף). קווי תאים אלה מציגים שני הבדלים ברצף הגן mt-Nd2 שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאשר את טוהר mtDNA לאחר השלמת תהליך cybridization¹³. במקרה זה, טוהר הרקע הגרעיני אושר על ידי רגישות לאנטיביוטיקה, שכן, בניגוד לתאי L929dt, L929 היו עמידים לגנטיקה.

1. ד....

תוצאות

לאחר ביצוע הפרוטוקול שהוצג לעיל, יש לקבל קו תאי ציבריד הומופלסמיים עם רקע גרעיני שמור אך עם גנוטיפ מיטוכונדריה חדש, כפי שמיוצג בסכמות באיור 1 ובאיור 2. טוהר הדנ"א המיטוכונדריאלי והגרעיני שנמצא בציברידים יכול להיות מאושר על-ידי RFLP, כפי שמוצג באיור .......

Discussion

מאז שאוטו ורבורג דיווח כי תאים סרטניים משנים את חילוף החומרים שלהם ומעצימים "גליקוליזה אירובית"^3,4 תוך הפחתת הנשימה המיטוכונדריאלית^, העניין בתפקיד המיטוכונדריה בטרנספורמציה ובהתקדמות סרטן גדל באופן אקספוננציאלי. בשנים האחרונות, מוטציות ב- mtDNA ותפקוד לקוי ש.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750