JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمكن أن تستفيد المقايسات المختبرية من القيمة النذير من التصوير المقطعي متعدد الوسائط القائم على التصوير المقطعي للتماسك البصري الطولي (OCT) للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD). يتم تصوير عيون المتبرعين البشريين مع AMD وبدونه باستخدام OCT ، واللون ، وتنظير العين بالليزر لمسح انعكاس الأشعة تحت الحمراء القريبة ، والتألق الذاتي عند طولين موجيين للإثارة قبل تقسيم الأنسجة.

Abstract

يمكن أن يضيف تسلسل التقدم للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) المستفاد من التصوير المقطعي متعدد الوسائط (MMI) القائم على التماسك البصري (OCT) قيمة تنبؤية إلى النتائج المختبرية. في هذا العمل ، تم تطبيق OCT و MMI خارج الجسم الحي على عيون المتبرعين البشريين قبل تقسيم أنسجة الشبكية. تم استرداد العيون من متبرعين بيض غير مصابين بالسكري تتراوح أعمارهم بين ≥80 عاما ، مع وقت الموت حتى الحفظ (DtoP) ≤6 ساعة. تم انتشال الكرات الأرضية في الموقع ، وتم تسجيلها باستخدام تريفين 18 مم لتسهيل إزالة القرنية ، وغمرها في 4٪ بارافورمالدهيد مخزن. تم الحصول على صور قاع العين الملونة بعد إزالة الجزء الأمامي باستخدام نطاق تشريح وكاميرا SLR باستخدام إضاءة عبر و epi وفلاش عند ثلاثة تكبيرات. تم وضع الكرات الأرضية في مخزن مؤقت داخل غرفة مصممة خصيصا مع عدسة ديوبتر 60. تم تصويرها بالمجال الطيفي OCT (مكعب بقعة 30 درجة ، تباعد 30 ميكرومتر ، متوسط = 25) ، انعكاس قريب من الأشعة تحت الحمراء ، 488 نانومتر ذاتي التألق ، و 787 نانومتر تألق ذاتي. أظهرت عيون AMD تغيرا في ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) ، مع رواسب drusen أو drusenoid تحت الشبكية (SDDs) ، مع أو بدون الأوعية الدموية الجديدة ، ودون دليل على وجود أسباب أخرى. بين يونيو 2016 وسبتمبر 2017 ، تم استرداد 94 عينا يمنى و 90 عينا يسرى (DtoP: 3.9 ± 1.0 ساعة). من بين 184 عينا ، كان 40.2٪ مصابين ب AMD ، بما في ذلك المتوسط المبكر (22.8٪) ، والضموري (7.6٪) ، والأوعية الدموية الحديثة (9.8٪) AMD ، و 39.7٪ لديهم بقع غير ملحوظة. تم تحديد Drusen و SDDs والبؤر شديدة الانعكاس والضمور والندوب الوعائية الليفية باستخدام OCT. تضمنت القطع الأثرية عتامة الأنسجة ، والانفصال (العصوي ، والشبكية ، و RPE ، والمشيمية) ، والتغيير الكيسي النقري ، و RPE المتموج ، والأضرار الميكانيكية. لتوجيه المقطع بالتبريد ، تم استخدام مجلدات OCT للعثور على معالم النقرة ورأس العصب البصري وأمراض محددة. تم تسجيل مجلدات ex vivo مع مجلدات في الجسم الحي عن طريق تحديد الوظيفة المرجعية لتتبع العين. تعتمد الرؤية خارج الجسم الحي لعلم الأمراض الذي يظهر في الجسم الحي على جودة الحفظ. في غضون 16 شهرا ، تم استرداد 75 عينا من المتبرعين ب DtoP السريع في جميع مراحل AMD وتنظيمها باستخدام طرق MMI السريرية.

Introduction

خمسة عشر عاما من إدارة التنكس البقعي المرتبط بالعمر الوعائي الجديد (AMD) مع العلاج المضاد ل VEGF تحت إشراف التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) قد قدمت رؤى جديدة حول تسلسل التقدم والبنية الدقيقة لهذا السبب السائد لفقدان البصر. الاعتراف الرئيسي هو أن AMD هو مرض ثلاثي الأبعاد يشمل شبكية العين الحسية العصبية ، وظهارة صبغة الشبكية (RPE) ، والمشيمية. نتيجة لتصوير OCT لمرضى التجربة وعيون زملائهم من مرضى العيادة المعالجين ، تم التعرف الآن على ميزات علم الأمراض التي تتجاوز تلك التي شوهدت من خلال التصوير الفوتوغرافي الملون لقاع العين ، وهو معيار سريري لعقود. وتشمل هذه الأوعية الدموية داخل الشبكية (النوع 3 الأوعية الدموية الحديثةالبقعية 1 ، الانتشار الوعائي سابقا) ، رواسب الدروسينويد تحت الشبكية (SDDs ، وتسمى أيضا الشبكية الكاذبة)2 ، مسارات متعددة لمصير RPE3،4 ، وخلايا مولر الدبقية بشكل مكثف في ضمور 5,6.

الأنظمة النموذجية التي تفتقر إلى البقعة (الخلايا والحيوانات) تعيد إنشاء بعض شرائح هذا المرضالمعقد 7،8،9. يمكن أن يأتي المزيد من النجاح في تخفيف عبء AMD من اكتشاف واستكشاف علم الأمراض الأساسي في عيون الإنسان ، وفهم التركيب الخلوي الفريد للبقعة ، تليها الترجمة إلى أنظمة نموذجية. يصور هذا التقرير تعاونا لمدة ثلاثة عقود بين مختبر أبحاث أكاديمية وبنك عيون. أهداف طرق توصيف الأنسجة الموصوفة هنا ذات شقين: 1) إبلاغ تكنولوجيا التشخيص المتطورة من خلال إظهار أساس مظهر قاع العين ومصادر إشارة التصوير بالفحص المجهري ، و 2) تصنيف عينات AMD لتقنيات الاكتشاف الجزيئي المستهدفة (الكيمياء الهيستولوجية المناعية) وغير المستهدفة (قياس الطيف الكتلي للتصوير ، IMS ، والنسخ المكاني) التي تحافظ على النقرة المخروطية فقط وشبه القضيب الغني و perifovea. يمكن لمثل هذه الدراسات تسريع الترجمة إلى OCT السريري ، حيث يمكن إجراء تسلسل تقدم ومتابعة طولية من خلال تتبع العين. هذه التقنية ، المصممة لمراقبة آثار العلاج ، تسجل الفحوصات من زيارة عيادة إلى أخرى باستخدام أوعية الشبكية. يمكن أن يوفر ربط OCT الذي يتم تتبعه بالعين بالنتائج المختبرية التي تم الحصول عليها باستخدام التقنيات المدمرة مستوى جديدا من القيمة النذير للنتائج الجزيئية.

في عام 1993 ، التقط مختبر الأبحاث صورا ملونة لقاع ما بعد الوفاة في الفيلم10. استلهم هذا الجهد من الفحص المجهري الضوئي الرائع والأنسجة لشبكية العين المحيطية البشرية بواسطة Foos وزملائه11،12،13 والارتباطات السريرية الشاملة AMD بواسطة Sarks et al.14،15. ابتداء من عام 2009 ، تم اعتماد التصوير متعدد الوسائط خارج الجسم الحي (MMI) الراسخ على المجال الطيفي OCT. كان هذا الانتقال مستوحى من الجهود المماثلة للآخرين 16,17 وخاصة من خلال إدراك أن الكثير من البنية التحتية التي وصفها Sarks كانت متاحة في ثلاثة أبعاد ، بمرور الوقت ، في العيادة 18,19. كان الهدف هو الحصول على عيون ذات بقع متصلة في إطار زمني معقول لإجراء دراسات جيدة للأنماط الظاهرية على المستوى الخلوي في شبكية العين ، RPE ، والمشيمية. كان القصد من ذلك هو تجاوز إحصائيات "لكل عين" إلى "لكل نوع آفة" ، وهو معيار يتأثر بمفاهيم "اللويحات الضعيفة" من أمراض القلب والأوعية الدموية20,21.

يعكس البروتوكول الوارد في هذا التقرير تجربة ما يقرب من 400 زوج من عيون المتبرعين المنضمة في عدة تيارات. في 2011-2014 ، تم إنشاء موقع Project MACULA الخاص بعلم أمراض الأنسجة AMD ، والذي يتضمن سمك الطبقة والتعليقات التوضيحية من 142 عينة مؤرشفة. تم الحفاظ على هذه العيون من 1996-2012 في مثبت جلوتارالدهيد-بارافورمالدهيد لأنسجة راتنجات الايبوكسي عالية الدقة والمجهر الإلكتروني. تم تصوير جميع الفوندي بالألوان عند استلامها وإعادة تصويرها بواسطة OCT قبل علم الأنسجة مباشرة. تم استخدام حامل العين المصمم أصلا لدراسات العصب البصري22 لاستيعاب لكمة أنسجة كاملة السماكة بقطر 8 مم تتمحور حول النقرة. تم تحميل OCT B-scans من خلال مركز foveal وموقع 2 مم متفوق ، يتوافق مع الأنسجة على نفس المستويات ، على موقع الويب ، بالإضافة إلى صورة قاع العين الملونة. تم تحديد اختيار طائرات OCT من خلال بروز علم الأمراض AMD تحت fovea23 وبروز SDDs في المناطق الغنية بالقضبان المتفوقة على النقرة24,25.

ابتداء من عام 2013 ، كانت العيون التي تم تصويرها باستخدام MMI المرتبط ب OCT خلال الحياة متاحة للارتباطات السريرية المرضية المباشرة. معظم (7 من 10 متبرعين) شملت المرضى في ممارسة إحالة شبكية العين (المؤلف: K.B.F.) ، والتي قدمت سجلا توجيهيا متقدما للمرضى المهتمين بالتبرع بأعينهم بعد الوفاة لأغراض البحث. تم استعادة العيون والحفاظ عليها من قبل بنك العيون المحلي ، ونقلها إلى المختبر ، وإعدادها بنفس طريقة عيون مشروع البقعة. تمت قراءة مجلدات OCT السريرية قبل الوفاة بسلاسة في المختبر ، وبالتالي مواءمة ميزات علم الأمراض التي شوهدت خلال الحياة مع الميزات التي شوهدت تحت المجهر26.

ابتداء من عام 2014 ، بدأ جمع العين المرتقب عن طريق فحص AMD في عيون المتبرعين دون تاريخ سريري ولكن تم الحفاظ عليه خلال فترة زمنية محددة (6 ساعات). لهذا الغرض ، تم تعديل حامل العين لاستيعاب الكرة الأرضية بأكملها. هذا قلل من فرصة الانفصال حول الحواف المقطوعة لكمة 8 مم المستخدمة سابقا. تم الحفاظ على العيون في 4٪ بارافورمالدهيد مخزن للكيمياء المناعية ونقلها إلى 1٪ في اليوم التالي للتخزين طويل الأجل. في 2016-2017 (قبل الجائحة) ، تم استرداد 184 عينا من 90 متبرعا. تم إنشاء الإحصاءات والصور الواردة في هذا التقرير من هذه السلسلة. خلال حقبة الوباء (عمليات الإغلاق لعام 2020 وما بعدها) ، استمرت المجموعات المحتملة لتعاون النسخ و IMS بوتيرة منخفضة ، باستخدام أساليب 2014 بشكل أساسي.

تتوفر طرق أخرى لتقييم عين المتبرع. يعتمد نظام مينيسوتا للدرجات (MGS) 27,28 على نظام AREDS السريري لتصوير قاع العينالملون 29. تشمل قيود هذه الطريقة الجمع بين AMD الضموري والأوعية الدموية الحديثة في مرحلة واحدة من "AMD المتأخر". علاوة على ذلك ، يستلزم MGS إزالة شبكية العين الحسية العصبية قبل التوثيق الضوئي ل RPE choroid. هذه الخطوة تزيح SDDs بدرجات متفاوتة30,31 وتزيل المراسلات المكانية لشبكية العين الخارجية ونظام دعمها. وبالتالي ، قد يتم إعاقة الجهود المبذولة لربط الطلب الأيضي والإشارات من شبكية العين إلى علم الأمراض في RPE-choroid. نفذ نظام يوتا MMI باستخدام التصوير الفوتوغرافي الملون خارج الجسم الحي و OCT لتصنيف العيون المخصصة للتشريح إلى مناطق لاستخراج الحمض النووي الريبيوالبروتين 32. على الرغم من أنها مفضلة على قلع فنجان العين بالكامل ، إلا أن المنطقة التي يبلغ قطرها 3 مم هي الأكثر عرضة لخطر تقدم AMD33,34 تمثل 25٪ فقط من لكمة محورها النقرة بقطر 6 مم. وبالتالي ، فإن التقنيات التي يمكن أن تحدد النتائج في إشارة إلى النقرة ، مثل التقسيم التسلسلي للكيمياء المناعية ، مفيدة.

Protocol

وافق مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة ألاباما في برمنغهام على الدراسات المختبرية ، التي التزمت بالممارسات المختبرية الجيدة ومستوى السلامة الأحيائية 2/2+. تتوافق جميع بنوك العيون الأمريكية مع قانون الهدايا التشريحية الموحد لعام 2006 وإدارة الغذاء والدواء الأمريكية. تتوافق معظم بنوك العيون الأمريكية ، بما في ذلك Advance Sight Network ، مع المعايير الطبية لجمعية بنك العيون الأمريكية.

يسرد جدول المواد اللوازم والمعدات. توفر المادة التكميلية 1 نظرة عامة على التشريح ، والتصوير الفوتوغرافي الملون لقاع العين ، و MMI القائم على OCT. توفر المادة التكميلية 2 تفاصيل MMI المستندة إلى OCT.

1. معايير جمع الأنسجة

  1. لزيادة إنتاجية عيون AMD إلى أقصى حد في شاشة المتبرعين غير المسجلين ، قم بتعيين المعايير التالية للمتبرعين المقبولين: العمر ≥80 عاما ، أبيض ، غير مصاب بالسكري ، و ≤6 ساعة من الموت إلى الحفظ (DtoP).
    ملاحظة: يتم تعريف DtoP على أنه الوقت بين الوفاة ووقت وضع العين في مادة حافظة مقدمة ، إما في المستشفى أو في المختبر.

2. وسط الحفظ والمستحضرات الأخرى (المختبر)

  1. اصنع 4٪ بارافورمالدهيد مخزن بالفوسفات من 20٪ مخزون (تم شراؤه). تحضير 1 لتر بإضافة 200 مل من 20٪ بارافورمالدهايد (عامل تخفيف 5) إلى 800 مل من 0.1 متر عازلة فوسفات سورنسون. اختبر واضبط للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 7.2 ، إذا لزم الأمر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  2. قم بتوزيع 30 مل من بارافورمالدهايد المخزن بالفوسفات بنسبة 4٪ في عبوات سعة 40 مل.
  3. مخزون يحمل علامة 40 مل من المواد الحافظة في بنك العيون بحيث يمكن استعادة الأنسجة في أي وقت وفي أي يوم.
  4. لتخزين العيون المحفوظة ، اصنع 1٪ بارافورمالدهيد من محلول 4٪. تحضير 1 لتر بإضافة 250 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (عامل تخفيف 4) إلى 750 مل من 0.1 م مخزن فوسفات سورنسون. اختبار وضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    1. تحضير 1 لتر من محلول 0.1 M من محلول 0.2 M من مخزن سورنسون للفوسفات، الرقم الهيدروجيني 7.2، من خلال الجمع بين 500 مل من الماء المقطر و500 مل من محلول سورنسون.
    2. اضبط الأس الهيدروجيني قطرة قطرة باستخدام 1 N حمض الهيدروكلوريك أو 1 N هيدروكسيد الصوديوم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  5. إنشاء حامل لتثبيت العينين أثناء تشريح. املأ طبق بتري بشمع الأسنان المسخن حتى يصبح سائلا. عندما يكون الجو باردا قليلا ، اترك انطباعا نصف كروي فيه باستخدام محمل كروي كبير ، ثم قم بتجميد الطبق لتسهيل إزالة محمل الكرة.

3. طرق بنك العين

  1. لضمان الشفاء السريع للأنسجة البحثية ، استرجع جميع الأنسجة بسرعة ، بما في ذلك تلك المخصصة للزرع.
  2. تلقي إحالات الوفاة ، كما هو مطلوب بموجب القانون ، في غضون 1 ساعة من الوفاة ، وتتبع كل متبرع برقم تسلسل إحالة يتبع الأنسجة.
  3. للعثور على الحالات ذات الوثائق السريرية المحتملة ، اطرح أسئلة خاصة ب AMD وأمراض العين في مقابلة تقييم مخاطر المتبرعين البحثية.
  4. لتقليل وقت السفر ، استرجع كرات كاملة (تختلف عن القرنيات فقط للزرع) داخل منطقة مضغوطة (أي المدينة ومقاطعة الضواحي المجاورة).
  5. أحضر برطمان من المواد الحافظة (4٪ بارافورمالدهيد المخزن مؤقتا) إلى غرفة مستشفى المتوفى لاستعادة الأنسجة (بدلا من انتظار نقل الجثة إلى المشرحة).
  6. قبل وأثناء الشفاء ، تواصل مع المحققين لتأكيد التسليم والتوقيت.
  7. استعادة الكرات الأرضية في الموقع في المستشفى ، وفتحها بطرق معالجة متسقة ، وغمر العين المفتوحة في المواد الحافظة (الشكل 1).
    1. ثبت عين المتبرع المستأصلة في مكانها باستخدام غمد من الشاش مثبت بواسطة مرقئ.
    2. لتسهيل إزالة القرنية بحافة صلبة بعرض 2 مم ، استخدم تريفين قطره 18 مم لتسجيل الكرة الأرضية.
    3. لتحرير القرنية بحافة مصاحبة من الصلبة ، قم بقصها على طول الدائرة المسجلة باستخدام مقص محمل بنابض بأطراف منحنية مع تثبيت الكرة الأرضية باستخدام الشاش المقطوع بالرقي.
    4. ارفع القرنية عن الصلبة ، وكشف القزحية والجسم الهدبي.
    5. لتسهيل تغلغل المادة الحافظة في الغرفة الزجاجية ، قم بعمل شق بطول 2 مم في القزحية عموديا على هامش الحدقة . ضع العينين في برطمانات عينة تحتوي على 30 مل من المواد الحافظة عند 4 درجات مئوية ، وانقلها إلى المختبر على الثلج الرطب.
  8. نقل معلومات المتبرعين مجهولي الهوية إلكترونيا من بنك العيون إلى قاعدة بيانات مختبر الأبحاث.
    ملاحظة: تحتفظ قاعدة البيانات برقم الإحالة ورقم أنسجة بنك العين ورقم معرف المختبر للتتبع، بالإضافة إلى المعلومات الأخرى ذات الصلة.

4. تحضير الأنسجة لتصوير قاع العين الملون خارج الجسم الحي

  1. استخدم مجهرين ستيريو ، أحدهما للتشريح والآخر لتصوير قاع العين الملون.
    ملاحظة: لتصور الإضاءة التصبغية ، استخدم قاعدة للفحص المجهري في المجال المظلم.
  2. قم بإزالة بقايا الجزء الأمامي (القزحية والعدسة). لتثبيت العين أثناء التشريح ، ضعه في طبق بتري المملوء بالشمع (المادة التكميلية 1 ، الشرائح 7-8). لمنع الجسم الهدبي والشبكية المرفقة من الانهيار في التجويف الزجاجي ، قلل من اضطراب حلقة الجسم الزجاجي السميك المرتبط بالجسم الهدبي (القاعدة الزجاجية).
  3. بمناسبة القطب العلوي للتوجيه. ضع الجانب الأمامي للكرة الأرضية لأسفل في الطبق. ابحث عن أوتار الإدخال للعضلات المستقيمة العلوية والعضلات المائلة العلوية. باستخدام قضيب خشبي ، ضع حبر تعليم باعتدال في خط 10 مم في اتجاه أمامي إلى خلفي (أي عمودي على الإدخال الوتري للعضلة المستقيمة العلوية).
  4. قبل التصوير ، املأ قاع العين بمحلول فوسفات سورنسن البارد.
  5. أدخل حبة ياقوت 1 مم في قاع العين كشريط مقياس داخلي لتظهر في كل صورة27.
  6. احصل على صور ملونة باستخدام كاميرا عاكسة أحادية العدسة مثبتة على مجهر استريو مزود بفلاش حلقي. استخدم الإضاءة العابرة والوبائية والفلاش في كل من التكبيرات القياسية الثلاثة لالتقاط الصور التي تهدف إلى إبراز مناطق معينة (المادة التكميلية 1 ، الشريحة 11): 1) قاع العين إلى خط الاستواء ، 2) القطب الخلفي (أروقة الأوعية الدموية ، رأس العصب البصري ، النقرة) ، و 3) النقرة داخل البقعة الصفراء (البقعة الصفراء).

5. التحضير لتصوير قاع العين الملون خارج الجسم الحي

  1. قم بتشغيل الكاميرا والشاشة. قم بتوصيل الغالق عن بعد، ثم حرر المشغل في واجهة الوسائط المتعددة عالية الدقة (HDMI) وشاشة الكاميرا/التلفزيون (TV) وكابل العرض.
  2. اضبط إعدادات الكاميرا على وظيفة ISO اليدوية وموضع قفل المرآة (مغلق في مكانه لتقليل الاهتزاز).
    ملاحظة: راجع دليل مستخدم الشركة المصنعة لمعرفة الإعدادات الموجودة على الكاميرا المستخدمة. تعلم من شاشة الكاميرا إعدادات التعرض الزائد/المنخفض بالنسبة إلى قراءات الرسم البياني والتعرض للضوء.
  3. رتب مصدرين للضوء ، لكل منهما دليلان مرنان للضوء موضوعان بشكل عمودي على بعضهما البعض ، للإضاءة في الاتجاهات الأساسية الأربعة على مرحلة المجهر (المادة التكميلية 1 ، الصفحة 10).
  4. قم بتشغيل مصادر ضوء الإضاءة epi-illumination إلى الطاقة الكاملة.
    ملاحظة: من المفيد ولكن ليس من الضروري أن يكون لديك كفن لباد أسود حول المسرح للحد من تشتت الضوء / الفلاش للمصور.
  5. في مجهر التشريح ، استخدم ملقط لإدخال القطب الخلفي في بوتقة كوارتز سعة 30 مل مملوءة بعازلة. اسمح للأنسجة بالغرق في القاع. أدخل دعامة، مثل إسفنجة منديلية، بين العين وجدار البوتقة لمنع الحركة. أدخل حبة الياقوت 1 مم في القطب الخلفي.
    ملاحظة: قد تسقط الخرزة في كأس العصب البصري.
  6. ضع الكرة الأرضية بعناية في البوتقة على مرحلة المجهر الاستريو ، وراقب قاع العين الداخلي من خلال عدسات المجهر. باستخدام أقل تكبير ، قم بتوجيه العين عن طريق تحديد علامة الأنسجة عند موضع الساعة 12 ، ورأس العصب البصري (ONH) ، والنقرة 5 درجات أسفل ONH. قم بتدوير العين بحيث تقع النقرة تحت خط عبر ONH بمقدار 5 درجات.
    ملاحظة: إذا كانت العين اليمنى ، فإن ONH على يمين النقرة ، كما يظهر من خلال مناظير المجهر. إذا كانت العين اليسرى ، فإن ONH على يسار النقرة.
  7. قم بتشغيل عرض الشاشة عن بعد من الكاميرا. تأكد من ضبط شريط تمرير مقسم شعاع المجهر على المراقبة من خلال منفذ الصور وليس من خلال منفذ المناظير. اعتمادا على مسار الضوء والمرآة ، كن مستعدا لتدوير المنديل 180 درجة على المسرح للتوجيه الصحيح.

6. الحصول على الصور باستخدام التصوير الفوتوغرافي الملون خارج الجسم الحي

  1. مع تشغيل الإضاءة epi-illumination ، اضبط التكبير بحيث يشغل شق trephine بالكامل مقاس 18 مم مجال الرؤية بالكامل. زيادة التكبير بحيث يمكن التركيز على الجزء السفلي من حفرة النقرة. قم بتكبير التكبير إلى الإعداد السابق.
  2. اضبط إعدادات ISO في نطاق 1600-3000 بحيث تقع أوقات التعرض في النطاق المركزي لجهاز القياس على الكاميرا.
  3. اضغط على مشغل الغالق عن بعد. استمع إلى المرآة لتثبيتها في الوضع العلوي. اضغط على الزناد مرة أخرى للتعرض.
  4. راقب الصورة على الشاشة ، مع عرض البيانات الوصفية المعينة مسبقا باللون الأحمر والأخضر والأزرق (RGB) ورسم بياني ملون للتعريض الضوئي الصحيح. إذا كان التعرض مقبولا ، فتابع ؛ إذا لم يكن كذلك ، فاحذف المعلمات وأعد تقييمها وأعد الصورة.
  5. أطفئ المصابيح ذات الرأس المنحنية لإضاءة epi-illumination لتسليط الضوء على drusen ، وقم بتشغيل الفلاش ، مع التعرض 1/4 ثانية ، وسرعة مصراع الكاميرا 1/250 ثانية ، و ISO من 100-320. اضبط سرعة الفلاش على السرعة الافتراضية ، أو قم بتعديلها أثناء الإعداد الأولي للكاميرا. احصل على صورة ، وتحقق من الرسم البياني للتعرض المناسب.
  6. قم بإيقاف تشغيل الفلاش ، وقم بتشغيل مصدر الضوء عبر الإضاءة. أعد ضبط ISO إلى أعلى من 5000 ، وتأكد من أن وقت التعرض لا يقل عن 1/30 ثانية بسبب الاهتزاز المحتمل في نظام التصوير الفوتوغرافي. احصل على صورة ، وتحقق من الرسم البياني للتعرض المناسب.
  7. قم بزيادة التكبير لعرض كل من ONH و fovea في مجال الرؤية. قم بتشغيل مصابيح الإضاءة epi-illumination. اضبط نطاق ISO على 1600-3000. تأكد من أن أوقات التعرض تقع في النطاق المركزي للكاميرا.
  8. قم بإيقاف تشغيل مصابيح الإضاءة epi-illumination ، وقم بتشغيل الفلاش ، مع التعرض 1/4 ثانية ، وسرعة غالق الكاميرا المضبوطة مسبقا على 1/250 ثانية ، وضبط ISO على 400-800. احصل على صورة ، وتحقق من الرسم البياني للتعرض المناسب.
  9. قم بإيقاف تشغيل الفلاش ، وقم بتشغيل الإضاءة العابرة باستخدام قاعدة المجال المظلم. أعد تعيين ISO إلى أعلى من 5000. تأكد من أن وقت التعرض ليس أبطأ من 1/30 ثانية بسبب الاهتزاز المحتمل في نظام التصوير الفوتوغرافي. احصل على صورة ، وتحقق من وجود مدرج تكراري مناسب.
  10. أطفئ الإضاءة ، وقم بتشغيل مصابيح الإضاءة epi-illumination مرة أخرى.
  11. قم بزيادة التكبير إلى ذلك المستخدم في الخطوة 6.7. أعد التركيز إذا لزم الأمر.
  12. قم بزيادة ISO في نطاق 3000-6000 ، واضبط وقت التعرض ليقع ضمن نطاق التعريض المناسب للكاميرا. الحصول على صورة.
    ملاحظة: قد لا تظهر حبة الياقوت في مجال الرؤية. إذا كان الأمر كذلك ، فالتقط صورا منفصلة للحبة عند هذا التكبير كمرجع.
  13. أطفئ مصابيح الإضاءة epi-illumination. قم بتشغيل الفلاش بتعريض 1/4 ثانية ومع سرعة غالق الكاميرا إلى 1/250 ثانية. اضبط سرعة الفلاش على الإعداد الافتراضي ، أو قم بتغييرها أثناء الإعداد الأولي للكاميرا ، واضبط ISO على 500-1000. الحصول على الصورة. تحقق من الرسم البياني للتعرض المناسب.
  14. قم بإيقاف تشغيل الفلاش ، وقم بتشغيل مصابيح الإضاءة العابرة. أعد ضبط ISO إلى أعلى من 8000 للسماح بوقت تعريض أسرع باستخدام مستشعر صور أكثر حساسية. تأكد من أن وقت التعرض لا يقل عن 1/30 ثانية بسبب الاهتزاز المحتمل في نظام التصوير الفوتوغرافي. الحصول على صورة.
  15. تصدير الصور من الكاميرا إلى جهاز كمبيوتر. راجع الصور قبل إزالة العينة من مرحلة المجهر في حالة الحاجة إلى التقاط بعضها مرة أخرى.

7. نظرة عامة على الحصول على الصور ل OCT خارج الجسم الحي ومسح تنظير العين بالليزر (SLO)

  1. بالنسبة للمجال الطيفي OCT ، ضع الكرات الأرضية في مخزن مؤقت للفوسفات في حامل عين مخصص مع غرفة بها عدسة ديوبتر 6035. قم بتركيب حامل العين على حامل على جهاز تصوير OCT السريري ، وقم بتوصيله بالمكان الذي سيريح فيه المريض جبهته. يقوم جهاز OCT تلقائيا بإدراج شريط مقياس في كل صورة.
  2. في الوقت نفسه ، باستخدام نفس الجهاز ومع بقاء العين في الحامل ، قم بتصوير الكرات الأرضية باستخدام منظار العين بالليزر الماسح (SLO) باستخدام انعكاس الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR ، المستخدم كصورة محدد موقع بواسطة برنامج السكن) ، 488 نانومتر الإثارة الذاتي قاع العين (FAF) ، والانعكاس الخالي من الأحمر (RF).
    ملاحظة: إن FAF المثير 787 نانومتر في هذا الجهاز مناسب فقط في بعض الأحيان لأن مقسم الحزمة يقلل من نفاذية الضوء إلى SLO. لهذا السبب ، يتم استخدام جهاز ثان لصور FAF 787 نانومتر (انظر النقطة التالية).
  3. بشكل منفصل ، ولكن مع بقاء العين في حامل العين ، قم بتصوير الكرات الأرضية ب 787 نانومتر FAF لاكتشاف اضطراب RPE36 باستخدام جهاز منفصل يعرض هذه الطريقة جيدا.

8. بروتوكول الحصول على الصور خارج الجسم الحي OCT / SLO (انظر الشرائح في المواد التكميلية 2)

  1. تشير إلى العضلات المستقيمة العليا مع صبغة وسم الأنسجة. قم بتشغيل الليزر (السهم الأزرق ، المادة التكميلية 2 ، الصفحة 1).
  2. بالإشارة إلى الصفحة 2 من المادة التكميلية 2 ، ضع رأس OCT عن طريق تحريك الوحدة بأكملها في محورين فيما يتعلق بالقاعدة (السهم الأخضر) ثم رفع الارتفاع (y) عن طريق تدوير عصا التحكم في اتجاه عقارب الساعة / عكس اتجاه عقارب الساعة (cw / ccw ، الأسهم الزرقاء). ركز الصورة عن طريق تدوير المقبض (سهم برتقالي) ، مع وجود الذراع الأسود في الموضع R (*). أغلق الوحدة عن طريق تأمين برغي الإبهام (السهم الأرجواني).
  3. أدخل العين في الحامل ، واستقر من الجانب الخلفي بفواصل (المادة التكميلية 1 ، الصفحة 13). مارس أقل ضغط ممكن لتجنب انبعاج الصلبة. توجيه مع علامة الأنسجة للعضلة المستقيمة العليا متجهة لأعلى.
    ملاحظة: المسافة التقريبية من مقدمة حامل العين إلى جهاز OCT هي 25 مم.
  4. افتح برنامج التصور والتحليل الخاص بجهاز OCT. ستظهر قائمة المرضى في العمود الأيسر. المتبرعون بالعين المفهرسون برقم رمز داخلي هم "المرضى". راجع دليل المستخدم من الشركة المصنعة.
  5. حدد أيقونة مريض جديد . أكمل معلومات بيانات المريض حسب الحاجة. حدد موافق. استخدم نظام ترقيم مرتب منطقيا للعيون الفردية ، مثل YYYYNNNL ، R_agesex. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون هذا 2017016R_97F.
  6. بعد متابعة إدخال البيانات في النافذة التالية، اضغط على موافق. حدد عامل التشغيل وادرس من القائمة المنسدلة.
    ملاحظة: ستظهر المعلومات المدخلة في البيانات الوصفية القابلة للتصدير.
  7. بعد عرض شاشة فارغة ، المس الزر الأصفر لبدء التقاط الصورة.
  8. اضغط على IR + OCT (انعكاس الأشعة تحت الحمراء القريبة + OCT). اسمح لليزر بالحصول على صورة SLO حية لقاع العين و OCT B-scan.
    1. قم بإنهاء الوضع التشريحي الصحيح بناء على ONH والنقرة ، واستخدم قضيبا خشبيا لضبط موضع العين في الحامل. في لوحة التحكم ، قم بتدوير الزر الدائري الأسود لضبط الشدة.
    2. اضغط على نفس الزر لمتوسط 9-100 إطار (الأسهم الحمراء ؛ 9 كافية ، 100 تبدو كريمية). إذا تم توجيه الوحدة بشكل صحيح ، فيجب أن يكون قاع العين في بؤرة التركيز ، ويجب أن يظهر مسح OCT B في الثلث العلوي من الشاشة (المادة التكميلية 2 ، الصفحة 9 ، سهم أحمر مزدوج).
    3. في صورة قاع العين ، استخدم المؤشر لتحريك الخط الأزرق لتوسيط النقرة (المادة التكميلية 2 ، الصفحة 9 ، السهم الأبيض). اضغط على اكتساب.
      ملاحظة: الأزرار الافتراضية الأخرى هي Retina و EDI (إيقاف التشغيل) ومسح الخط.
  9. اضغط على RF + OCT للاكتساب التالي. أعد فحص الموضع للتأكد من أن الصورة لم تتحرك أو تتدهور. اضغط على الزر الأسود لحساب المتوسط. اضغط على اكتساب.
  10. قم بتبديل المكعب الداخلي للتصوير الذاتي إلى الأطوال الموجية للإثارة 488 نانومتر و 787 نانومتر (المادة التكميلية 2 ، الصفحة 10).
    ملاحظة: يظهر موضع المكعب بعد التبديل.
  11. حدد وضع التألق التلقائي . أعد التحقق من المحاذاة. اضغط على اكتساب.
  12. بالنسبة للحالات المشتبه فيها من اضطراب وضمور RPE ، حدد ICGA (تصوير الأوعية الخضراء الإندوسيانين) للتألق الذاتي 787 نانومتر. أعد فحص موضع العين، ثم اضغط على اكتساب.
    ملاحظة: غالبا لا تظهر صورة قاع العين بهذه الطريقة لأن المكعب الداخلي يخفف الحزمة.
  13. قم بتبديل المكعب الداخلي مرة أخرى إلى R للتصوير المجاني بالأشعة تحت الحمراء والأحمر للحصول على الحجم.
    ملاحظة: يظهر موضع المكعب بعد التبديل في الصفحة 13 من المادة التكميلية 2.
  14. للحصول على وحدات تخزين OCT، حدد IR وإعداد وحدة التخزين. قم بمطابقة جميع الإعدادات الموجودة في الصفحة 14 من المادة التكميلية 2 عن طريق تبديل الأزرار المناسبة على وحدة التحكم (مكعب بقعة 30 درجة ، تباعد 30 ميكرومتر ، بمتوسط حسب المتطلبات التجريبية).
  15. لاحظ أن منظر قاع الانعكاس القريب من الأشعة تحت الحمراء مغطى بخطوط B-scan الزرقاء. أعد فحص موضع OCT في الثلث العلوي من النافذة اليمنى. اضغط على Acquisition (اكتساب ) في وحدة التحكم، وانتظر 5 دقائق حتى يكتمل فحص وحدة التخزين. عند اكتمال الحصول على التصوير، حدد EXIT. سيتم حفظ الصور (سهم أحمر).
    ملاحظة: تحدد الخطوط الزرقاء المسافات الموضحة في العرض السابق بالميكرومتر. تبدأ عمليات المسح في الترقيم من الأسفل (السفلي) والمضي قدما لأعلى. لاحظ تقدم الخط الأحمر.
  16. اسمح للكمبيوتر بمعالجة الصور التي تم الحصول عليها ، والتي ستظهر على الشاشة (المادة التكميلية 2 ، الصفحة 16).
  17. عند تصوير عيون زميل أحد المتبرعين ، لا تقم بتغيير موضع قوس التثبيت بين العينين. إذا تم تصوير العين اليسرى أولا ، فستظهر النتائج في عمود OD (العين اليمنى). انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد كافة الصور، ثم حدد Exchange OS/OD. ستنتقل الصور إلى عمود نظام التشغيل.
  18. اضغط على تحديد > نافذة > قاعدة البيانات. يتم تعيين الشاشة افتراضيا على اللوحة 6 مع إضافة عين المتبرع المصورة في العمود الأيمن (المادة التكميلية 2 ، الصفحة 18). انقر بزر الماوس الأيمن فوق المريض في القائمة المنسدلة ، واختر دفعة ، وقم بتصدير ملف E2E.
  19. استعرض للوصول إلى المجلد المحدد مسبقا الذي تم إنشاؤه على سطح المكتب لنقل الملفات. حدد موافق. يحتوي المجلد على ملفات E2E ليتم نسخها على محرك أقراص ثابت خارجي وأرشفتها.
  20. أحضر العين في حاملها إلى منظار العين بالليزر الماسح ، والذي يستخدم بشكل أساسي للتألق الذاتي 787 نانومتر.
    ملاحظة: راجع دليل مستخدم الشركة المصنعة للحصول على الصور وأرشفتها.
  21. قم بتشغيل الكمبيوتر والليزر.
  22. حدد أيقونة مريض جديد . أكمل بيانات المريض حسب الحاجة.
  23. للحفاظ على ورقة بيانات العين كما هي، اضغط على موافق. مع بقاء المنحنى C كما هو ، اضغط على متابعة.
  24. حدد وضع الدراسة ، وأدخل كلمة المرور إذا لزم الأمر. حافظ على منحنى C عند 7.7 مم. اضغط على موافق.
  25. حدد متابعة للتحقق من منحنى C. حدد المؤشر الأصفر لبدء تشغيل الكاميرا.
  26. حدد الموضع R . محاذاة وتوجيه الكرة الأرضية. حدد وضع الأشعة تحت الحمراء للتركيز والتوجيه على النحو الوارد أعلاه.
  27. قم بتوجيه رأس الكاميرا عن طريق تحريك الوحدة بأكملها في محورين فيما يتعلق بالقاعدة (المادة التكميلية 2 ، الصفحة 28 ، السهم الأخضر) ثم رفع ارتفاع (y) للوحدة (الأسهم الزرقاء). ركز الصورة عن طريق تدوير المقبض (سهم برتقالي). الرافعة السوداء في الموضع R (*). بعد أن يكون هذا الرأس في موضعه ، أغلق الوحدة عن طريق تدوير برغي الإبهام (السهم الأرجواني).
  28. لاحظ أن الشاشة تظهر كما هو موضح في الصفحة 29 من المادة التكميلية 2.
  29. حرك مقبض المحدد من R إلى A. حدد ICGA (لتحقيق التألق الذاتي 787 نانومتر) باللون الأزرق ، وكثافة 100٪ ، ومجال رؤية 30 درجة ، وتصوير أحادي الطور.
    ملاحظة: مثل صبغة الإندوسيانين الخضراء ، يتم إثارة الميلانين بواسطة ضوء الطول الموجي 787 نانومتر.
  30. لاحظ أن الشاشة تظهر كما هو موضح في الصفحة 31 من المادة التكميلية 2. اضغط على القرص الأسود لمعرفة المتوسط، ثم حدد اكتساب.
  31. اختر نافذة > قاعدة البيانات. حدد استيراد ملفات E2E من جهاز SLO ؛ يتم تخزين هذه الملفات على محرك أقراص ثابت خارجي وتحميلها على سطح المكتب.
  32. حدد فتح. تحقق من أن العلامات هي الافتراضي، وحدد موافق.
  33. لاحظ أن المريض لديه الآن علامتي تبويب: واحدة تعرض الصور التي تم الحصول عليها من SLO (السهم الأزرق) ، وعلامة التبويب الأخرى تعرض الصور التي تم الحصول عليها من جهاز OCT (السهم الأحمر) (المادة التكميلية 2 ، الصفحة 34).
  34. انقر بزر الماوس الأيمن فوق صورة 786 نانومتر (ICGA) ، وقم بتصدير الصورة إلى ملف يسمى SLO 786 على سطح المكتب.
  35. لحفظ صورة SLO التألق الذاتي 786 نانومتر ، حدد المريض ، وانقر بزر الماوس الأيمن لتصدير الصور كملفات RAW (لملفات .vol) إلى مجلد على سطح المكتب.
  36. لتصدير الصور من جهاز OCT لنقلها إلى كمبيوتر الأرشيف ، انسخ / الصق من RAWEXPORT إلى مجلد يسمى RAW.

9. مراجعة التصوير

  1. قم بتجميع الصور (اللون ، ملف .vol ، صور SLO) في مجلدات لكل متبرع مع مجلدات فرعية لكل عين ، وفهرسة المجلدات على التوالي حسب معرف المختبر.
  2. تسجيل انطباعات الأنسجة (الجودة ، علم الأمراض) في قاعدة بيانات لتقرير موحد.
  3. راجع وحدات تخزين OCT التي تم تصديرها باستخدام مكون ImageJ الإضافي الداخلي.
    1. ابحث عن مركز النقرة ، والذي يمكن التعرف عليه من خلال مركز تراجع النقرة ، أو الارتفاع الداخلي لأشرطة الشبكية الخارجية ، أو أنحف نقطة. في معظم الحالات ، سوف تتزامن هذه ، ولكن ليس دائما ، لأن هذا يعتمد على الحفاظ على النقرة ، والتباين الفردي ، ووجود علم الأمراض.
    2. ابحث عن مسح قياسي في perifovea الفائق (2 مم / 67 B-scans بعيدا في الاتجاه العلوي ؛ أي زيادة أرقام المسح).
    3. احفظ مكدسا .tif من وحدة التخزين بالكامل للرجوع إليها بسرعة في المستقبل.
    4. قم بالتمرير خلال وحدة تخزين OCT بالكامل ، بدءا من الفحص 1 (السفلي) ، أثناء تسجيل أرقام المسح الضوئي التي يتم التعرف على الميزات بها.
    5. تحقق من المنطقة المحيطة بالحليمات بالإضافة إلى البقعة.
      ملاحظة: يشمل ضمور المشيمية والشبكية حول الحليمي في العيون الأكبر سنا ترسبا رقائقيا قاعديا مميزا ووعيا جديدا. هذا هو مجال شائع للتغير الصباغي في عيون قصر النظر والزرق ، وكذلك في الشيخوخة و AMD37.
  4. افحص الصور الملونة ، واربط أي نتائج بتلك التي شاهدها OCT إن أمكن.
    ملاحظة: بشكل عام ، من الأسهل رؤية معظم النتائج بواسطة OCT أولا. توفر الصور الملونة منظرا كبيرا للمنطقة خارج المنطقة على SLO ، وتصبغ المشيمية بما في ذلك الشامات ، ووجود الهيم والإفرازات الصلبة ، والصبغة السوداء في AMD الوعائي الجديد. قد تمثل الصبغة الداكنة في النقرة الميلانوزومات السائبة من الجزء الأمامي ويجب غسلها برفق باستخدام المخزن المؤقت باستخدام ماصة.
  5. افحص صور SLO ، واربط أي نتائج بتلك التي شاهدها OCT إن أمكن.
  6. احفظ فحوصات B القياسية في النقرة و perifovea ، وفحوصات B الإضافية مع علم الأمراض الملحوظ أو ميزات أخرى ، وصور SLO في تقرير علم الأمراض.
  7. صنف العيون على النحو التالي: غير ملحوظ ، مشكوك فيه ، AMD مبكر متوسط ، AMD ضامر ، AMD وعائي حديث ، أخرى ، غير معروفة ، غير قابلة للتصنيف ، غير مسجلة. يتم استخدام "مشكوك فيه" إذا لم يكن من الواضح ما إذا كانت التغييرات شديدة بما يكفي لتصنيف آخر. يتم حجز "غير قابل للتدريج" للعيون التي تفتقر إلى فحوصات OCT المفيدة ، مثل تلك التي تعاني من انفصال شديد في شبكية العين. "غير مسجل" محجوز للعيون التي تتم معالجتها فور استلامها دون تصوير.
  8. استخدم هذه المعايير ل AMD: تغيير RPE شديد مع رواسب drusen أو تحت الشبكية ، مع أو بدون علامات الأوعية الدموية الجديدة ، مثل السوائل أو التليف ، وبدون دليل على أسباب أخرى (تم التحديث من Curcio et al.10 لاستيعاب SDDs).
    ملاحظة: يتم تأكيد التشخيص النهائي عن طريق التحليل النسيجي.

النتائج

يوضح الجدول 1 أنه خلال الفترة 2016-2017 ، تم استرداد 184 عينا من 94 متبرعا أبيض غير مصاب بالسكري >80 عاما. كان متوسط وقت الموت إلى الحفظ 3.9 ساعة (النطاق: 2.0-6.4 ساعة). من بين 184 عينا تمت مراجعتها ، كان لدى 75 (40.2٪) بعض AMD. تم تحديد الفئات التالية: غير ملحوظ (39.7٪) ، مشكوك فيه (11.4٪) ، AMD المبكر المتوسط (22.8٪...

Discussion

باستخدام نهج الفحص القائم على السكان خلال فترة 16 شهرا في حقبة ما قبل COVID ، كان من الممكن شراء 75 عينا من المتبرعين المصابين ب AMD. تم استردادها جميعا باستخدام DtoP قصير وتم تنظيمها باستخدام MMI المرتبط ب OCT. معيار العمر (>80 سنة) خارج النطاق العمري النموذجي لاستعادة الأنسجة المخصصة للقرنية القابلة ل...

Disclosures

تتلقى C.A.C. دعما بحثيا من شركة هايدلبرغ للهندسة وتقدم استشارات ل Apellis و Astellas و Boehringer Ingelheim و Character Bioscience و Osanni. يتلقى TA دعما بحثيا من Novartis ويقدم استشارات لشركة Roche و Novartis و Bayer و Nidek و Apellis. K.B.F. هو مستشار لشركة Genentech و Zeiss و Heidelberg Engineering و Allergan و Bayer و Novartis.

Acknowledgements

نشكر شركة هايدلبرغ الهندسية على الأجهزة وتصميم حامل العين الأصلي ، وريتشارد إف سبايد دكتوراه في الطب لمقدمة التصوير متعدد الوسائط القائم على OCT ، وكريستوفر جيركين MD لتسهيل الوصول إلى أجهزة التصوير السريري ، وديفيد فيشر للشكل 1. تم دعم استعادة عيون المتبرعين البشريين للبحث من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01EY06019 (C.A.C.) ، P30 EY003039 (Pittler) ، R01EY015520 (Smith) ، R01EY027948 (C.A.C. ، T.A.) R01EY030192 (Li) و R01EY031209 (Stambolian) و U54EY032442 (Spraggins) و IZKF Würzburg (N-304 ، TA) ، ومؤسسة EyeSight في ألاباما ، والمؤسسة الدولية لأبحاث الشبكية (C.A.C.) ، ومبادرة أرنولد ومابل بيكمان لأبحاث البقعة الصفراء (C.A.C.) ، والبحوث لمنع العمى AMD Catalyst (Schey).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Beakers, 250 mLFisher# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex Fisher# 10-462-719storage for preservative
Bunsen burner or heat sourceEisco# 17-12-818To melt wax
Camera, digitalNikon D7200D7200
Computer and storageAppleiMac Pro; 14 TB external hard driveImage storage
Container, insulatedFisher# 02-591-45For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mLFisherSameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86For preservative
Crucible, quartz 30 mLFisher# 08-072DHold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mLFisher# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies  https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracketcontact J. Messingerjeffreymessinger@uabmc.educustom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection MasksFisher# 19-910-667
Forceps, Harmon FixRoboz # RS-8247
Forceps, Micro AdsonRoboz # RS-5232
Forceps, TissueRoboz# RS-5172
Glass petri dish, KimaxFisher# 23064
Gloves Diamond GripFisher# MF-300
Gowns GenProFisher# 19-166-116
Image editing softwareAdobePhotoshop 2021, Creative Suite
KimWipesFisher# 06-666
Lamps, 3 goosenecksSchott Imaging# A20800
Microscope, stereoNikonSMZ 1000for dissection
Microscope, stereoOlympus SZX9color fundus photography
Paraformaldehyde, 20% EMS# 15713-Sfor preservative; dilute for storage
pH meterFisher # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2 EMS# 11600-10
Ring flashB & H Photo VideoSigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameterMeller Optics# MRB10MD
Safety Glasses 3MFisher# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscopeHeidelberg EngineeringHRA2
Scissors, curved springRoboz# RS-5681
Sharps containerFisher# 1482763
Shutter cord, remoteNikonMC-DC2
Spectral Domain OCT deviceHeidelberg EngineeringSpectralis HRA&OCThttps://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameterMcMaster-Carr# 9529K31
Tissue marking dye, blackCancer Diagnostics Inc# 0727-1
Tissue slicer bladesThomas Scientific# 6767C18
Trephine, 18-mm diameterStratis Healthcare# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital cameraB&H Photo VideoBH # COHD18G6PROBfor live viewing and remote camera display features
Wax, pink dentalEMS # 72670
Wooden applicatorsPuritan# 807-12

References

  1. Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
  2. Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
  3. Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
  4. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
  5. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
  6. Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
  7. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
  8. Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
  9. Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
  10. Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
  11. Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
  12. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O. Reticular degeneration of the pigment epithelium. Ophthalmology. 92 (11), 1485-1495 (1985).
  13. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
  14. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
  15. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
  16. Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
  17. Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
  18. Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
  19. Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
  20. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  21. Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
  22. Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
  23. Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
  24. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
  25. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
  26. Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
  27. Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
  28. Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
  29. Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
  30. Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
  31. Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
  32. Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
  33. Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
  34. Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
  35. Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
  36. Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
  37. Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
  38. Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
  39. Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
  40. Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
  41. Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
  42. Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
  43. Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
  44. Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
  45. Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
  46. Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
  47. Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
  48. Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
  49. Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
  50. Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
  51. Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
  52. Diabetes. Alabama Public Health Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022)
  53. Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
  54. Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
  55. Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved