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  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

实验室检测可以利用基于纵向光学相干断层扫描 （OCT） 的年龄相关性黄斑变性 （AMD） 多模态成像的预后价值。在组织切片之前，使用OCT，彩色，近红外反射扫描激光检眼镜和两个激发波长的自发荧光对有和没有AMD的人类供体眼睛进行成像。

摘要

从基于光学相干断层扫描（OCT）的多模态（MMI）临床成像中学习的年龄相关性黄斑变性（AMD）的进展序列可以为实验室结果增加预后价值。在这项工作中，在视网膜组织切片之前将离体OCT和MMI应用于人类供体眼睛。眼睛是从年龄≥80岁的非糖尿病白人捐赠者那里恢复的，死亡保存时间（DtoP）为≤6小时。在现场回收地球仪，用18毫米环钻刻痕以促进角膜去除，并浸入缓冲的4%多聚甲醛中。使用解剖镜和单反相机在三种放大倍率下使用反式、落射和闪光灯照明去除前节后获取彩色眼底图像。将地球仪放置在带有60屈光度镜片的定制设计腔室内的缓冲器中。它们以光谱域OCT（30°黄斑立方体，30μm间距，平均= 25），近红外反射率，488 nm自发荧光和787 nm自发荧光成像。AMD眼睛显示视网膜色素上皮（RPE）发生变化，伴有玻璃膜疣或视网膜下玻璃疣沉积物（SDD），伴或不伴新生血管形成，并且没有其他原因的证据。在2016年6月至2017年9月期间，恢复了94只右眼和90只左眼（DtoP：3.9±1.0小时）。在184只眼睛中，40.2%患有AMD，包括早期中级（22.8%），萎缩性（7.6%）和新生血管性（9.8%）AMD，39.7%患有无明显黄斑。使用OCT鉴定玻璃膜疣，SDD，超反射病灶，萎缩和纤维血管瘢痕。 伪影包括组织混浊，脱离（杆菌，视网膜，RPE，脉络膜），中央凹囊性变化，起伏的RPE和机械损伤。为了指导冷冻切片，使用OCT体积来查找中央凹和视神经头标志和特定病理。通过选择眼动追踪的参考功能，将离体体积与体内体积进行登记。体内可见病理的离体可见度取决于保存质量。在16个月内，使用临床MMI方法恢复和分期了75只处于AMD各个阶段的快速DtoP供体眼睛。

引言

在光学相干断层扫描（OCT）的指导下，通过抗VEGF治疗管理新生血管年龄相关性黄斑变性（AMD）已有15年的经验，为这种普遍的视力丧失原因的进展顺序和微结构提供了新的见解。一个关键的认知是，AMD是一种三维疾病，涉及神经感觉视网膜，视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜。由于试验患者和接受治疗的临床患者的眼睛的OCT成像，现在认识到了几十年来临床标准彩色眼底摄影所看到的病理特征。这些包括视网膜内新生血管形成（3 型黄斑新生血管形成1，以前称为血管瘤增生）、视网膜下玻璃疣沉积物 （SDD，也称为网状假玻璃膜疣）2、RPE 命运的多条途径3，4 和萎缩中的强烈胶质细胞 Müller 细胞5，6。

缺乏黄斑（细胞和动物）的模型系统重建了这种复杂疾病的一些切片7，8，9。减轻AMD负担的进一步成功可能来自发现和探索人眼中的原发性病理学，了解黄斑的独特细胞组成，然后转化为模型系统。....

研究方案

阿拉巴马大学伯明翰分校的机构审查委员会批准了实验室研究，这些研究符合良好实验室规范和生物安全2/2+级。所有美国眼库均符合 2006 年统一解剖礼品法案和美国食品和药物管理局。大多数美国眼库，包括Advance Sight Network，都符合美国眼库协会的医疗标准。

材料表列出了用品和设备。补充材料 1 概述了解剖、彩色眼底摄影和基于 OCT 的 MMI。补充材料 2 提供了基于 OCT 的 MMI 的详细信息。

1. 组织采集标准

  1. 为了在无证供体的筛查中最大限度地提高 AMD 眼睛的产量，请为可接受的供体设置以下标准：年龄 ≥80 岁、白人、非糖尿病患者和 ≤6 小时死亡保留 （DtoP）。
    注意：DtoP定义为死亡与将眼睛放入医院或实验室提供的防腐剂之间的时间。

2. 保存介质和其他制剂（实验室）

  1. 从 20% 的库存（购买）中制作 4% 磷酸盐缓冲的多聚甲醛。通过将 200 mL 20% 多聚甲醛（稀释因子为 5）加入 800 mL 的 0.1 M Sorenson 磷酸盐缓冲液中制备 1 L。如有必要，测试和调整以确保pH值为7.2....

代表性结果

表1显示，在2016-2017年期间，从94名80岁的白人非糖尿病捐赠者>184只眼睛被回收。平均死亡至保存时间为3.9小时（范围：2.0-6.4小时）。在接受审查的184只眼睛中，75只（40.2%）患有某种AMD。确定了以下类别：不显着（39.7%），可疑（11.4%），早期中级AMD（22.8%），萎缩（7.6%），新生血管（9.8%），其他（8.7%）和未知/未记录/不可分级（<1%）。图2、图3、

讨论

在 COVID 之前的 16 个月内使用基于人群的筛查方法，有可能获得 75 只患有 AMD 的供体眼睛。所有这些都用短DtoP回收，并使用OCT锚定的MMI进行分期。年龄标准（>80 岁）超出了用于可移植角膜的组织恢复的典型年龄范围。尽管年事已高，但我们的标准导致AMD各个阶段的眼睛。许多 RPE 表型在所有 AMD 分期都是通用的，有些是新生血管性 AMD3，46 所独有的。离?.......

披露声明

C.A.C.获得海德堡工程公司的研究支持，并为Apellis，Astellas，Boehringer Ingelheim，Character Bioscience和Osanni提供咨询。T.A.获得诺华的研究支持，并为罗氏、诺华、拜耳、尼德克和Apellis提供咨询。K.B.F.是基因泰克、蔡司、海德堡工程、艾尔建、拜耳和诺华的顾问。

致谢

我们感谢海德堡工程公司为原始眼罩提供仪器和设计，感谢Richard F. Spaide MD介绍基于OCT的多模态成像，感谢Christopher Girkin MD为访问临床成像设备提供便利，感谢David Fisher提供图1。人类供体眼睛用于研究的恢复得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款R01EY06019（C.A.C.），P30 EY003039（Pittler），R01EY015520（Smith），R01EY027948（C.A.C.，T.A.）的支持。R01EY030192（Li），R01EY031209（Stambolian）和U54EY032442（Spraggins），IZKF Würzburg（N-304，TA），阿拉巴马州视力基金会，国际视网膜研究基金会（C.A.C.），阿诺德和梅布尔贝克曼黄斑研究计划（C.A.C.）和预防失明AMD催化剂研究（Schey）。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Beakers, 250 mLFisher# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex Fisher# 10-462-719storage for preservative
Bunsen burner or heat sourceEisco# 17-12-818To melt wax
Camera, digitalNikon D7200D7200
Computer and storageAppleiMac Pro; 14 TB external hard driveImage storage
Container, insulatedFisher# 02-591-45For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mLFisherSameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86For preservative
Crucible, quartz 30 mLFisher# 08-072DHold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mLFisher# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies  https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracketcontact J. Messingerjeffreymessinger@uabmc.educustom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection MasksFisher# 19-910-667
Forceps, Harmon FixRoboz # RS-8247
Forceps, Micro AdsonRoboz # RS-5232
Forceps, TissueRoboz# RS-5172
Glass petri dish, KimaxFisher# 23064
Gloves Diamond GripFisher# MF-300
Gowns GenProFisher# 19-166-116
Image editing softwareAdobePhotoshop 2021, Creative Suite
KimWipesFisher# 06-666
Lamps, 3 goosenecksSchott Imaging# A20800
Microscope, stereoNikonSMZ 1000for dissection
Microscope, stereoOlympus SZX9color fundus photography
Paraformaldehyde, 20% EMS# 15713-Sfor preservative; dilute for storage
pH meterFisher # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2 EMS# 11600-10
Ring flashB & H Photo VideoSigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameterMeller Optics# MRB10MD
Safety Glasses 3MFisher# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscopeHeidelberg EngineeringHRA2
Scissors, curved springRoboz# RS-5681
Sharps containerFisher# 1482763
Shutter cord, remoteNikonMC-DC2
Spectral Domain OCT deviceHeidelberg EngineeringSpectralis HRA&OCThttps://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameterMcMaster-Carr# 9529K31
Tissue marking dye, blackCancer Diagnostics Inc# 0727-1
Tissue slicer bladesThomas Scientific# 6767C18
Trephine, 18-mm diameterStratis Healthcare# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital cameraB&H Photo VideoBH # COHD18G6PROBfor live viewing and remote camera display features
Wax, pink dentalEMS # 72670
Wooden applicatorsPuritan# 807-12

参考文献

  1. Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
  2. Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A.

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