离体 基于OCT的人供体眼睛多模态成像用于研究年龄相关性黄斑变性

摘要

实验室检测可以利用基于纵向光学相干断层扫描 （OCT） 的年龄相关性黄斑变性 （AMD） 多模态成像的预后价值。在组织切片之前，使用OCT，彩色，近红外反射扫描激光检眼镜和两个激发波长的自发荧光对有和没有AMD的人类供体眼睛进行成像。

摘要

从基于光学相干断层扫描（OCT）的多模态（MMI）临床成像中学习的年龄相关性黄斑变性（AMD）的进展序列可以为实验室结果增加预后价值。在这项工作中，在视网膜组织切片之前将离体OCT和MMI应用于人类供体眼睛。眼睛是从年龄≥80岁的非糖尿病白人捐赠者那里恢复的，死亡保存时间（DtoP）为≤6小时。在现场回收地球仪，用18毫米环钻刻痕以促进角膜去除，并浸入缓冲的4%多聚甲醛中。使用解剖镜和单反相机在三种放大倍率下使用反式、落射和闪光灯照明去除前节后获取彩色眼底图像。将地球仪放置在带有60屈光度镜片的定制设计腔室内的缓冲器中。它们以光谱域OCT（30°黄斑立方体，30μm间距，平均= 25），近红外反射率，488 nm自发荧光和787 nm自发荧光成像。AMD眼睛显示视网膜色素上皮（RPE）发生变化，伴有玻璃膜疣或视网膜下玻璃疣沉积物（SDD），伴或不伴新生血管形成，并且没有其他原因的证据。在2016年6月至2017年9月期间，恢复了94只右眼和90只左眼（DtoP:3.9±1.0小时）。在184只眼睛中，40.2%患有AMD，包括早期中级（22.8%），萎缩性（7.6%）和新生血管性（9.8%）AMD，39.7%患有无明显黄斑。使用OCT鉴定玻璃膜疣，SDD，超反射病灶，萎缩和纤维血管瘢痕。 伪影包括组织混浊，脱离（杆菌，视网膜，RPE，脉络膜），中央凹囊性变化，起伏的RPE和机械损伤。为了指导冷冻切片，使用OCT体积来查找中央凹和视神经头标志和特定病理。通过选择眼动追踪的参考功能，将离体体积与体内体积进行登记。体内可见病理的离体可见度取决于保存质量。在16个月内，使用临床MMI方法恢复和分期了75只处于AMD各个阶段的快速DtoP供体眼睛。

引言

在光学相干断层扫描（OCT）的指导下，通过抗VEGF治疗管理新生血管年龄相关性黄斑变性（AMD）已有15年的经验，为这种普遍的视力丧失原因的进展顺序和微结构提供了新的见解。一个关键的认知是，AMD是一种三维疾病，涉及神经感觉视网膜，视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜。由于试验患者和接受治疗的临床患者的眼睛的OCT成像，现在认识到了几十年来临床标准彩色眼底摄影所看到的病理特征。这些包括视网膜内新生血管形成（3 型黄斑新生血管形成¹，以前称为血管瘤增生）、视网膜下玻璃疣沉积物 （SDD，也称为网状假玻璃膜疣）²、RPE 命运的多条途径³，⁴ 和萎缩中的强烈胶质细胞 Müller 细胞^5，6。

缺乏黄斑（细胞和动物）的模型系统重建了这种复杂疾病的一些切片⁷，^8，9。减轻AMD负担的进一步成功可能来自发现和探索人眼中的原发性病理学，了解黄斑的独特细胞组成，然后转化为模型系统。本报告描述了学术研究实验室和眼库之间三十年的合作。本文描述的组织表征方法有两个目标:1）通过显微镜证明眼底外观和成像信号源的基础来告知不断发展的诊断技术，以及2）对AMD标本进行分类，用于靶向（免疫组织化学）和非靶向分子发现技术（成像质谱，IMS和空间转录组学），以保留仅锥形中央凹和富含杆的副中央凹和周中心凹。这些研究可以加速向临床OCT的转化，通过眼动追踪可以进行进展序列和纵向随访。这项技术旨在监测治疗效果，使用视网膜血管记录从一次诊所访问到下一次诊所访问的扫描。将眼动OCT与通过破坏性技术获得的实验室结果联系起来可以为分子发现提供新的预后价值水平。

1993年，研究实验室在^胶片10上拍摄了死后眼底的彩色照片。这项工作的灵感来自Foos及其同事¹¹，12，¹³对人类周边视网膜的出色光学显微镜和组织学，以及Sarks等人的广泛AMD临床病理学相关性^14，15。从2009年开始，采用锚定在光谱域OCT上的离体多模态成像（MMI）。这种转变的灵感来自其他人的类似努力¹⁶，¹⁷，特别是认识到萨克斯描述的许多超微结构在诊所^18，19中都是三维的。目标是在合理的时间范围内获得附着黄斑的眼睛，以便对视网膜、RPE 和脉络膜中的细胞水平表型进行有力的研究。目的是超越"每只眼睛"的统计数据到"每种病变类型"，这一标准受到心血管疾病^20，21的"脆弱斑块"概念的影响。

本报告中的方案反映了近400对捐赠者眼睛在几个流中加入的经验。2011-2014 年，创建了 AMD 组织病理学的 MACULA 项目网站，其中包括来自 142 个存档标本的层厚度和注释。这些眼睛从1996年至2012年保存在戊二醛 - 多聚甲醛固定剂中，用于高分辨率环氧树脂组织学和电子显微镜。所有眼底在收到时都以彩色照片拍摄，并在组织学之前由OCT重新成像。最初设计用于视神经研究的眼支架²²用于容纳以中央凹为中心的8毫米直径全层组织冲头。OCT B扫描通过中央凹中心和2毫米的部位，对应于同一水平的组织学，上传到网站，并附有彩色眼底照片。OCT 平面的选择取决于中央凹²³ 下 AMD 病理学的突出程度以及 SDD 在优于中央凹^24，25 的杆富区中的突出性。

从2013年开始，在生命期间用OCT锚定MMI成像的眼睛可用于直接的临床病理相关性。大多数（10名捐赠者中的7名）涉及视网膜转诊诊所的患者（作者:K.B.F.），该诊所为有兴趣在死后捐献眼睛用于研究目的的患者提供了一个高级指导登记处。眼睛由当地眼库回收和保存，转移到实验室，并以与MACULA项目相同的方式制备眼睛。在实验室中无缝读取生前临床OCT卷，从而将生活中看到的病理特征与显微镜下看到的特征对齐²⁶。

从2014年开始，前瞻性眼科采集开始于在没有临床病史的供体眼睛中筛查AMD，但在规定的时间限制（6小时）内保存。为此，对眼睛支架进行了修改，以适应整个地球仪。这减少了以前使用的 8 mm 冲头切割边缘周围脱落的机会。将眼睛保存在4%缓冲的多聚甲醛中用于免疫组织化学，并在第二天转移到1%用于长期储存。在 2016-2017 年（大流行前），来自 90 名捐赠者的 184 只眼睛被收回。此报告中的统计信息和图像是从该系列生成的。在大流行时期（2020 年封锁和后果），转录组学和 IMS 合作的预期收集继续以较低的速度进行，基本上使用 2014 年的方法。

其他供体眼部评估方法也可用。明尼苏达分级系统（MGS）^27，28基于AREDS临床系统，用于彩色眼底摄影²⁹。这种方法的局限性包括将萎缩性和新生血管性AMD合并为"晚期AMD"的一个阶段。此外，MGS需要在RPE脉络膜的照片记录之前去除神经感觉视网膜。该步骤在不同程度上将SDD移位³⁰，^31，并消除了视网膜外层及其支持系统的空间对应关系。因此，将代谢需求和视网膜信号传导与 RPE 脉络膜病理学联系起来的努力可能会受到阻碍。犹他系统使用离体彩色摄影和OCT实施MMI，将要解剖的眼睛分类为RNA和蛋白质提取区域³²。虽然比整个眼罩摘除术更可取，但 AMD 进展风险最高的 3 mm 直径区域^33，34 仅占 6 mm 直径中央凹中心冲头的 25%。因此，能够定位中央凹发现的技术，例如用于免疫组织化学的连续切片，是有利的。

研究方案

阿拉巴马大学伯明翰分校的机构审查委员会批准了实验室研究，这些研究符合良好实验室规范和生物安全2/2+级。所有美国眼库均符合 2006 年统一解剖礼品法案和美国食品和药物管理局。大多数美国眼库，包括Advance Sight Network，都符合美国眼库协会的医疗标准。

材料表列出了用品和设备。补充材料 1 概述了解剖、彩色眼底摄影和基于 OCT 的 MMI。补充材料 2 提供了基于 OCT 的 MMI 的详细信息。

1. 组织采集标准

1. 为了在无证供体的筛查中最大限度地提高 AMD 眼睛的产量，请为可接受的供体设置以下标准:年龄 ≥80 岁、白人、非糖尿病患者和 ≤6 小时死亡保留 （DtoP）。
   注意:DtoP定义为死亡与将眼睛放入医院或实验室提供的防腐剂之间的时间。

2. 保存介质和其他制剂（实验室）

1. 从 20% 的库存（购买）中制作 4% 磷酸盐缓冲的多聚甲醛。通过将 200 mL 20% 多聚甲醛（稀释因子为 5）加入 800 mL 的 0.1 M Sorenson 磷酸盐缓冲液中制备 1 L。如有必要，测试和调整以确保pH值为7.2。储存在4°C。
2. 将 30 mL 4% 磷酸盐缓冲多聚甲醛分装到 40 mL 罐中。
3. 在眼库储存标有 40 mL 防腐剂的容器，以便随时随地恢复组织。
4. 为了储存保存的眼睛，从4%的溶液中制备1%的多聚甲醛。通过将 250 mL 4% 多聚甲醛（稀释因子为 4）加入 750 mL 的 0.1 M Sorenson 磷酸盐缓冲液中制备 1 L。如有必要，测试和调整pH值。储存在4°C。
   1. 将 500 mL 蒸馏水和 500 mL Sorenson 缓冲液混合，从 0.2 M 的 Sorenson 磷酸盐缓冲液 pH 7.2 溶液中制备 1 L 的 0.1 M 溶液。
   2. 使用1 N盐酸或1 N氢氧化钠逐滴调节pH值。储存在4°C。
5. 创建一个支架以在解剖过程中稳定眼睛。用加热至液体的牙蜡填充培养皿。当它稍微冷却时，用大滚珠轴承在其中留下半球印象，然后将盘子冷冻以方便拆卸滚珠轴承。

3. 眼库方法

1. 为确保研究组织的快速恢复，请快速恢复所有组织，包括用于移植的组织。
2. 根据法律要求，在死亡后1小时内接受死亡转诊，并使用组织后面的转诊序列号跟踪每个供体。
3. 要查找具有潜在临床文献的病例，请在研究捐赠者风险评估访谈中询问AMD和眼部疾病特异性问题。
4. 为了尽量减少旅行时间，请在紧凑的区域（即城市和邻近的郊区县）内恢复整个地球（与仅用于移植的角膜不同）。
5. 将两罐防腐剂（缓冲4%多聚甲醛）带到死者的病房进行组织恢复（而不是等待尸体被转移到太平间）。
6. 在恢复之前和期间，与调查人员沟通以确认分娩和时间。
7. 在医院现场回收眼球，通过一致的处理方法打开它们，并将打开的眼睛浸入防腐剂中（图1）。
   1. 使用由止血器稳定的纱布鞘将切除的供体眼睛固定到位。
   2. 为了便于切除巩膜边缘为 2 毫米宽的角膜，请使用直径为 18 毫米的环钻对眼球进行刻痕。
   3. 要释放带有巩膜边缘的角膜，请使用带有弯曲尖端的弹簧剪刀沿着刻痕圆圈切割，同时用止血器夹住的纱布稳定眼球。
   4. 将角膜从巩膜上抬起，露出虹膜和睫状体。
   5. 为了便于防腐剂渗透到玻璃体室中，请在虹膜上垂直于瞳孔边缘的2毫米长的缝隙。将眼睛放入4°C下装有30mL防腐剂的标本罐中，并在湿冰上转移到实验室。
8. 以电子方式将去识别化的捐赠者信息从眼库传输到研究实验室数据库。
   注意:数据库保留转诊号码、眼库组织号码和实验室 ID 号以进行跟踪，以及其他相关信息。

4. 离体彩色眼底摄影的组织准备

1. 使用两台体视显微镜，一台用于解剖，另一台用于彩色眼底摄影。
   注意:对于透照以可视化色素变化，请使用暗场显微镜的基础。
2. 去除前节残余物（虹膜和晶状体）。为了在解剖过程中稳定眼睛，将其放入装有蜡的培养皿中（补充材料1，载玻片7-8）。为防止睫状体和附着的视网膜塌陷到玻璃体腔中，请尽量减少附着在睫状体（玻璃体基底）上的厚玻璃体环的扰动。
3. 标记上杆的方向。将地球仪正面朝下放入培养皿中。找到上直肌和上斜肌的插入肌腱。使用木制涂抹器，在前后方向（即垂直于上直肌的肌腱插入处）以 10 毫米的线谨慎涂抹标记墨水。
4. 在摄影之前，用冷的索伦森磷酸盐缓冲液填充眼底。
5. 将一颗1毫米的红宝石珠作为内部比例尺插入眼底，以出现在每张图像²⁷中。
6. 使用安装在装有环形闪光灯的体视显微镜上的单反相机获取彩色图像。在三种标准放大倍率下使用反式、落射和闪光灯照明来捕捉旨在突出显示特定区域的图像（补充材料 1，幻灯片 11）:1） 赤道底，2） 后极（血管弓、视神经头、中央凹）和 3） 黄斑内的中央凹（黄色斑点）。

5. 离体彩色眼底摄影的准备

1. 打开相机和显示屏。插入遥控快门，然后松开高清多媒体接口 （HDMI） 照相机/电视 （TV） 监视器和显示电缆中的执行器。
2. 将照相机设定为手动ISO功能和反光镜锁定位置（锁定到位以减少振动）。
   注:有关所用相机的设置，请参阅制造商的用户手册。从相机显示中了解相对于直方图和曝光读数的过度/曝光不足设置。
3. 布置两个光源，每个光源有两个垂直放置的柔性光导，用于显微镜载物台上的四个主要方向的照明（补充材料 1，第 10 页）。
4. 将落射照明光源打开至全功率。
   注意:在舞台周围放置黑色毛毡罩会有所帮助，但没有必要限制摄影师的光线/闪光散射。
5. 在解剖显微镜下，使用镊子将后极插入充满缓冲液的 30 mL 石英坩埚中。让组织沉到底部。在眼睛和坩埚壁之间插入支架，例如组织海绵，以防止移动。将 1 毫米红宝石珠插入后极。
   注意:珠子可能会掉入视神经杯。
6. 小心地将坩埚中的地球仪放在体视显微镜载物台上，并通过显微镜目镜观察眼底内部。使用最低放大倍率，通过识别 12 点钟位置的组织标记、视神经头 （ONH） 和 ONH 下方 5° 的中央凹来定位眼睛。旋转眼睛，使中央凹低于穿过ONH的线5°。
   注意:如果是右眼，则ONH位于中央凹的右侧，通过显微镜的目镜可以看到。如果是左眼，ONH在中央凹的左侧。
7. 打开从照相机观看的远程监视器。确保显微镜分束器滑块设置为通过照片端口观察，而不是通过目镜端口观察。根据光线和镜面路径，准备好在载物台上将纸巾旋转 180° 以获得正确的方向。

6. 使用离体彩色眼底摄影获取图像

1. 打开落射照明后，设置放大倍率，使整个 18 mm 环钻切口占据整个视野。增加放大倍率，以便可以聚焦在中央凹坑的底部。将放大倍率降低到以前的设置。
2. 在1，600-3，000范围内调整ISO设置，使曝光时间落在相机测光表的中心范围内。
3. 按下遥控快门触发器。听镜子锁定在向上位置。再次按下扳机进行曝光。
4. 观察显示器上的图像，预设元数据显示红色、绿色、蓝色 （RGB） 和颜色直方图以获得正确的曝光。如果暴露可以接受，请继续;如果没有，则删除，重新评估参数，然后重新映像。
5. 关闭鹅颈灯以获得落射照明以突出玻璃膜疣，然后打开闪光灯，曝光时间为1/4秒，相机快门速度为1/250秒，ISO为100-320。将闪光速度设置为默认值，或在相机初始设置期间对其进行修改。获取图像，并检查直方图是否曝光正确。
6. 关闭闪光灯，然后打开透照光源。将ISO重置为5，000以上，并确保曝光时间不会因摄影系统中的潜在振动而低于1/30秒。获取图像，并检查直方图是否曝光正确。
7. 增加放大倍率以在视野中同时查看ONH和中央凹。打开落射照明灯。将 ISO 范围设置为 1，600-3，000。确保曝光时间在相机的中心范围内。
8. 关闭落射照明灯，然后打开闪光灯，曝光1/4秒，预设相机快门速度设置为1/250秒，ISO设置为400-800。获取图像，并检查直方图是否曝光正确。
9. 关闭闪光灯，然后使用暗场底座打开透射照明。将 ISO 重置为 5，000 以上。确保曝光时间不因摄影系统中的潜在振动而减慢于 1/30 秒。获取图像，并检查正确的直方图。
10. 关闭透照灯，然后再次打开落射灯。
11. 将放大倍率增加到步骤 6.7 中使用的放大倍率。如果需要，请重新聚焦。
12. 将ISO提高到3，000-6，000范围内，并调整曝光时间以落在相机的适当曝光范围内。获取图像。
    注意:红宝石珠可能不再出现在视野中。如果是这样，请在此放大倍率下捕获珠子的单独图像以供参考。
13. 关闭落射照明灯。以1/4秒曝光和相机快门速度为1/250秒时打开闪光灯。将闪光速度设置为默认值，或在相机初始设置期间更改闪光速度，并将ISO设置为500-1，000。获取图像。检查直方图是否正确曝光。
14. 关闭闪光灯，然后打开透射灯。将ISO重置为8，000以上，以使用更灵敏的图像传感器实现更快的曝光时间。确保曝光时间不会因摄影系统中的潜在振动而低于 1/30 秒。获取图像。
15. 将图像从相机导出到计算机。在将标本从显微镜载物台上取下之前，请查看图像，以防需要再次捕获某些标本。

第7章 离体OCT和扫描激光检眼镜（SLO）的图像采集概述

1. 对于光谱域OCT，将地球仪置于磷酸盐缓冲液中，该眼图支架带有带有60屈光度透镜³⁵的腔室。将眼罩安装到临床OCT成像设备上的支架上，并将其连接到患者前额休息的位置。OCT 设备会自动在每个图像中插入比例尺。
2. 同时，使用相同的设备，眼睛仍在支架中，使用扫描激光检眼镜（SLO）使用近红外反射率（NIR，留置软件用作定位器图像），488 nm激发眼底自发荧光（FAF）和无红（RF）反射率对地球仪进行成像。
   注意:本器件中的 787 nm 激发 FAF 仅偶尔适用，因为分束器会降低对 SLO 的透光率。因此，使用了用于787 nm FAF图像的第二个设备（见下一点）。
3. 另外，但在眼睛仍在眼睛支架中的情况下，使用787 nm FAF对地球仪进行成像，以使用单独设备检测RPE干扰³⁶，该设备可以很好地显示这种模式。

8. 离体OCT/SLO的图像采集协议（见补充材料2中的幻灯片）

1. 用组织标记染料指示上直肌。打开激光（蓝色箭头， 补充材料 2，第 1 页）。
2. 参考 补充材料 2 的第 2 页，通过将整个装置相对于底座在两个轴上移动（绿色箭头）来定位 OCT 头，然后通过顺时针/逆时针旋转操纵杆（cw/ccw，蓝色箭头）来提高高度 （y）。通过旋转旋钮（橙色箭头）聚焦图像，黑色杠杆位于位置 R （*）。通过固定指旋螺钉（紫色箭头）锁定设备。
3. 将眼睛插入支架，并用垫片从后侧稳定（补充材料1，第13页）。施加尽可能小的压力以避免巩膜凹陷。将上直肌的组织标记朝上定向。
   注意:从眼罩前部到 OCT 设备的大约距离为 25 毫米。
4. 打开 OCT 设备的专有可视化和分析软件。患者列表将显示在左列中。按内部代码编号索引的眼科捐献者是"患者"。请参阅制造商提供的用户手册。
5. 选择 "新建患者 "图标。根据需要填写患者数据信息。选择" 确定"。对单个眼睛使用逻辑顺序编号系统，例如 YYYYNNNL，R_agesex。例如，这可能是2017016R_97F。
6. 在以下窗口中继续数据输入后，按 确定。从下拉菜单中选择算子和算例。
   注意:输入的信息将显示在可导出的元数据中。
7. 查看空白屏幕后，触摸黄色按钮开始图像采集。
8. 按红外 + OCT（近红外反射率 + OCT）。允许激光获取眼底的实时SLO图像和OCT B扫描。
   1. 根据ONH和中央凹确定正确的解剖位置，并使用木制涂抹器调整支架中的眼睛位置。在控制面板上，旋转黑色圆形按钮以调整强度。
   2. 按相同的按钮平均9-100帧（红色箭头;9就足够了，100看起来像奶油一样）。如果单位方向正确，眼底应清晰对焦，OCT B扫描应出现在显示屏的顶部三分之一（补充材料2，第9页，双红色箭头）。
   3. 在眼底图像上，使用光标移动蓝线以居中中央凹（补充材料 2，第 9 页，白色箭头）。按 获取。
      注:其他默认按钮包括"视网膜"、"EDI"（关闭）和"线扫描"。
9. 按 RF + OCT 进行下一次采集。重新检查位置以确保图像没有移动或降级。按下黑色按钮进行平均。按 获取。
10. 将用于自发荧光成像的内部立方体切换到 488 nm 和 787 nm 激发波长（补充材料 2，第 10 页）。
    注:显示切换后的立方体位置。
11. 选择 自发荧光 模式。重新检查对齐方式。按 获取。
12. 对于疑似 RPE 中断和萎缩病例，选择 ICGA（吲哚菁绿色血管造影）进行 787 nm 自发荧光。重新检查眼睛位置，然后按获取。
    注意:眼底图像通常不会出现在这种模式下，因为内部立方体会衰减光束。
13. 将内部立方体切换回 R 进行红外和无红色成像以进行体积采集。
    注:开关后的立方体位置显示在 补充材料 2 的第 13 页上。
14. 若要获取 OCT 卷，请选择 IR 和卷设置。通过切换控制模块上的相应按钮（30° 黄斑立方体，30 μm 间距，根据实验要求取平均值），匹配 补充材料 2 第 14 页上的所有设置。
15. 请注意，近红外反射眼底视图被蓝色B扫描线覆盖。重新检查右侧窗口上三分之一的 OCT 位置。按控制模块上的获取，然后等待 5 分钟以完成卷扫描。成像采集完成后，选择退出。图像将被保存（红色箭头）。
    注意: 蓝线以微米为单位分隔上一个视图中显示的距离。扫描从底部（下部）开始编号，然后向上进行。请注意红线进度。
16. 允许计算机处理采集的图像，这些图像将出现在屏幕上（补充材料2，第16页）。
17. 当对一个供体的眼睛进行成像时，不要改变眼睛之间安装支架的位置。如果先对左眼成像，结果将显示在OD（右眼）列中。右键单击以选择所有映像，然后选择交换 操作系统/OD。映像将移至"操作系统"列。
18. 按 "选择>窗口>数据库"。屏幕默认为面板 6，并在右栏中添加了供体眼睛成像（补充材料 2，第 18 页）。右键单击下拉菜单中的患者，选择 批处理，然后导出 E2E 文件。
19. 浏览到在桌面上为文件传输创建的预定文件夹。选择" 确定"。该文件夹包含要复制到外部硬盘驱动器并存档的 E2E 文件。
20. 将眼睛放在支架上扫描激光检眼镜，该镜主要用于787 nm自发荧光。
    注:有关图像的采集和存档，请参阅制造商的用户指南。
21. 打开计算机和激光。
22. 选择 "新建患者 "图标。根据需要填写患者数据。
23. 要使眼睛数据表保持不变，请按 OK。当 C 曲线保持不变时，请按 继续。
24. 选择 学习 模式，如果需要，请输入密码。将 C 曲线保持在 7.7 mm，按 OK。
25. 选择 "继续" 以验证 C 曲线。选择黄色指示灯以启动摄像机。
26. 选择 R 位置。对齐和定向地球。选择 红外 模式进行聚焦和定向，如上。
27. 通过相对于底座在两个轴上移动整个单元来定位相机头（补充材料 2，第 28 页，绿色箭头），然后提高单元的高度 （y）（蓝色箭头）。通过旋转旋钮（橙色箭头）聚焦图像。黑色拉杆位于位置 R （*）。此头部就位后，通过转动指旋螺钉（紫色箭头）锁定设备。
28. 请注意，屏幕如 补充材料 2 第 29 页所示。
29. 将选择器旋钮从 R 移动到 A。选择蓝色、100% 强度、30° 视场和单相成像的 ICGA （以实现 787 nm 自发荧光）。
    注意:与染料吲哚菁绿一样，黑色素被 787 nm 波长的光激发。
30. 请注意，屏幕如 补充材料 2 第 31 页所示。按黑色圆盘进行平均，然后选择 "获取"。
31. 选择 "窗口>数据库"。选择从 SLO 设备 导入 E2E 文件;这些文件存储在外部硬盘驱动器上并上传到桌面。
32. 选择"打开"。检查标记是否为默认值，然后选择"确定"。
33. 请注意，患者现在有两个选项卡:一个显示从SLO获得的图像（蓝色箭头），另一个选项卡显示从OCT设备获取的图像（红色箭头）（补充材料2，第34页）。
34. 右键单击 786 nm （ICGA） 图像，然后将图片导出到桌面上标记为 SLO 786 的文件中。
35. 要保存 786 nm 自发荧光 SLO 图像，请选择患者，然后右键单击以将图像作为 RAW 文件（对于 .vol 文件）导出到桌面上的文件夹中。
36. 若要从 OCT 设备导出图像以传输到存档计算机，请将图像从 RAWEXPORT 复制/粘贴到标记为 RAW 的文件夹。

9. 影像学检查

1. 将图像（颜色，.vol文件，SLO图像）组装在每个供体的文件夹中，每只眼睛都有子文件夹，并按实验室ID连续索引文件夹。
2. 将组织印模（质量、病理）记录在数据库中，以获得标准化报告。
3. 使用内部 ImageJ 插件查看导出的 OCT 卷。
   1. 找到中央凹中心，可以通过中央凹凹的中心、视网膜外带的向内上升或最细的点来识别。在大多数情况下，这些会重合，但并非总是如此，因为这取决于中央凹保存、个体变异性和病理的存在。
   2. 在上中央凹找到标准扫描（在上枢凹方向上2 mm/67 B扫描;即增加扫描次数）。
   3. 保存整个卷的.tif堆栈，以便将来快速参考。
   4. 从扫描 1（下级）开始滚动整个 OCT 卷，同时记录识别要素的扫描编号。
   5. 除黄斑外，检查周围区域。
      注意:老年眼睛的状脉络膜视网膜萎缩包括独特的基底层沉积和新生血管形成。这是近视眼和青光眼以及衰老和AMD³⁷中色素变化的常见区域。
4. 检查彩色照片，如果可能，将任何发现与OCT看到的照片联系起来。
   注意:通常，首先在 OCT 之前查看大多数结果会更容易。彩色照片确实提供了SLO区域外区域的大视图，脉络膜色素沉着（包括痣），血红素和硬渗出物的存在以及新生血管AMD中的黑色色素。中央凹中的深色色素可能代表前段的松散黑色素体，应使用移液管用缓冲液轻轻冲洗掉。
5. 检查 SLO 映像，并在可能的情况下将任何发现链接到 OCT 看到的映像。
6. 在中央凹和中央凹处保存标准 B 扫描、具有显着病理或其他特征的额外 B 扫描以及病理报告中的 SLO 图像。
7. 将眼睛分类如下:不明显，可疑，早期中级AMD，萎缩性AMD，新生血管性AMD，其他，未知，不可分级，未记录。如果不清楚更改是否严重到足以进行另一种分类，则使用"可疑"。"不可分级"保留给缺乏有用OCT扫描的眼睛，例如视网膜严重脱落的眼睛。"未记录"保留给收到后立即处理的眼睛，无需拍照。
8. 对 AMD 使用以下标准:伴有玻璃膜疣或视网膜下样疣沉积的严重 RPE 改变，伴或不伴新生血管形成体征，例如液体或纤维化，并且没有其他原因的证据（从 Curcio 等人更新 ¹⁰ 以适应 SDD）。
   注意:最终诊断通过组织学分析确认。

结果

表1显示，在2016-2017年期间，从94名80岁的白人非糖尿病捐赠者>184只眼睛被回收。平均死亡至保存时间为3.9小时（范围:2.0-6.4小时）。在接受审查的184只眼睛中，75只（40.2%）患有某种AMD。确定了以下类别:不显着（39.7%），可疑（11.4%），早期中级AMD（22.8%），萎缩（7.6%），新生血管（9.8%），其他（8.7%）和未知/未记录/不可分级（<1%）。图2、图3、图...

讨论

在 COVID 之前的 16 个月内使用基于人群的筛查方法，有可能获得 75 只患有 AMD 的供体眼睛。所有这些都用短DtoP回收，并使用OCT锚定的MMI进行分期。年龄标准（>80 岁）超出了用于可移植角膜的组织恢复的典型年龄范围。尽管年事已高，但我们的标准导致AMD各个阶段的眼睛。许多 RPE 表型在所有 AMD 分期都是通用的，有些是新生血管性 AMD^3，46 所独有的。离?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12