Ex Vivo OCT-basierte multimodale Bildgebung menschlicher Spenderaugen zur Erforschung der altersbedingten Makuladegeneration

Zusammenfassung

Labortests können den prognostischen Wert der auf der longitudinalen optischen Kohärenztomographie (OCT) basierenden multimodalen Bildgebung der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) nutzen. Menschliche Spenderaugen mit und ohne AMD werden vor der Gewebeschnittierung mittels OCT, Farbe, Nahinfrarot-Reflexions-Scanning-Laser-Ophthalmoskopie und Autofluoreszenz bei zwei Anregungswellenlängen abgebildet.

Zusammenfassung

Eine Progressionssequenz für die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die aus der optischen Kohärenztomographie (OCT)-basierten multimodalen (MMI) klinischen Bildgebung gewonnen wurde, könnte den Laborbefunden einen prognostischen Wert verleihen. In dieser Arbeit wurden ex vivo OCT und MMI an menschlichen Spenderaugen vor der Schnittung von Netzhautgewebe appliziert. Die Augen wurden von nicht-diabetischen weißen Spendern im Alter von ≥80 Jahren mit einer Sterbezeit bis zur Konservierung (DtoP) von ≤6 h gewonnen. Die Globen wurden vor Ort geborgen, mit einem 18-mm-Trepan geritzt, um die Entfernung der Hornhaut zu erleichtern, und in gepuffertes 4%iges Paraformaldehyd getaucht. Farbfundusbilder wurden nach Entfernung des vorderen Augenabschnitts mit einem Präparierfernrohr und einer Spiegelreflexkamera unter Verwendung von Trans-, Epi- und Blitzbeleuchtung bei drei Vergrößerungen aufgenommen. Die Kugeln wurden in einem Puffer in einer speziell angefertigten Kammer mit einer 60-Dioptrien-Linse platziert. Sie wurden mit spektraler Domänen-OCT (30° Makulawürfel, 30 μm Abstand, Mittelung = 25), Nahinfrarot-Reflexion, 488 nm Autofluoreszenz und 787 nm Autofluoreszenz abgebildet. Die AMD-Augen zeigten eine Veränderung des retinalen Pigmentepithels (RPE), mit Drusen- oder subretinalen Drusenoidablagerungen (SDDs), mit oder ohne Neovaskularisation und ohne Hinweise auf andere Ursachen. Zwischen Juni 2016 und September 2017 wurden 94 rechte und 90 linke Augen geborgen (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). Von den 184 Augen hatten 40,2 % AMD, einschließlich früher intermediärer (22,8 %), atrophischer (7,6 %) und neovaskulärer (9,8 %) AMD, und 39,7 % hatten unauffällige Makulas. Drusen, SDDs, hyperreflektive Herde, Atrophie und fibrovaskuläre Narben wurden mittels OCT identifiziert. Zu den Artefakten gehörten Gewebetrübung, Ablösungen (bakteriell, retinal, RPE, choroidal), foveale zystische Veränderungen, ein wellenförmiges RPE und mechanische Schäden. Um die Kryo-Schnitte zu steuern, wurden OCT-Volumina verwendet, um die Fovea und den Sehnervenkopf sowie spezifische Pathologien zu finden. Die ex-vivo-Volumina wurden mit den in-vivo-Volumina registriert, indem die Referenzfunktion für das Eye-Tracking ausgewählt wurde. Die Ex-vivo-Sichtbarkeit der in vivo beobachteten Pathologie hängt von der Erhaltungsqualität ab. Innerhalb von 16 Monaten wurden 75 schnelle DtoP-Spenderaugen in allen Stadien der AMD geborgen und mit klinischen MMI-Methoden in Szene gesetzt.

Einleitung

Fünfzehn Jahre Behandlung der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) mit einer Anti-VEGF-Therapie unter der Leitung der optischen Kohärenztomographie (OCT) haben neue Einblicke in die Progressionssequenz und Mikroarchitektur dieser weit verbreiteten Ursache des Sehverlusts ermöglicht. Eine wichtige Erkenntnis ist, dass AMD eine dreidimensionale Erkrankung ist, die die neurosensorische Netzhaut, das retinale Pigmentepithel (RPE) und die Aderhaut betrifft. Als Ergebnis der OCT-Bildgebung von Studienpatienten und den Mitaugen der behandelten Klinikpatienten werden nun die Merkmale der Pathologie erkannt, die über die von der Farbfundusfotografie hinausgeh

Protokoll

Das institutionelle Prüfungsgremium der University of Alabama in Birmingham genehmigte die Laborstudien, die den Good Laboratory Practices und der Biosicherheitsstufe 2/2+ entsprachen. Alle US-Augenbanken entsprechen dem Uniform Anatomical Gifts Act von 2006 und der US Food and Drug Administration. Die meisten US-Augenbanken, einschließlich Advancing Sight Network, entsprechen den medizinischen Standards der Eye Bank Association of America.

Die Materialtabelle listet die Verbrauchsmaterialien und Ausrüstungen auf. Ergänzendes Material 1 bietet einen Überblick über die Dissektion, die Farbfundusfotografie un

Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt, dass zwischen 2016 und 2017 184 Augen von 94 weißen nicht-diabetischen Spendern im Alter von >80 Jahren geborgen wurden. Die mittlere Sterbezeit bis zur Konservierung betrug 3,9 h (Spanne: 2,0-6,4 h). Von den 184 untersuchten Augen hatten 75 (40,2%) eine sichere AMD. Die folgenden Kategorien wurden identifiziert: Unauffällig (39,7 %), Fragwürdig (11,4 %), Früh-Intermediäre AMD (22,8 %), Atrophisch (7,6 %), Neovaskulär (9,8 %), Sonstige (8,7 %) und Unbekannt/Nicht erfasst/Nicht bewe...

Diskussion

Mit einem bevölkerungsbasierten Screening-Ansatz über einen Zeitraum von 16 Monaten in der Vor-COVID-Ära konnten 75 Spenderaugen mit AMD beschafft werden. Alle wurden mit einem kurzen DtoP geborgen und mit einem OCT-verankerten MMI inszeniert. Das Alterskriterium (>80 Jahre) liegt außerhalb der typischen Altersspanne für Gewebegewinnungen, die für transplantierbare Hornhäute vorgesehen sind. Trotz des fortgeschrittenen Alters ergaben unsere Kriterien Augen in allen Stadien der AMD. Viele RPE-Phänotypen sind allen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12