Ex Vivo Мультимодальная визуализация донорских глаз человека на основе ОКТ для исследования возрастной макулярной дегенерации

Резюме

Лабораторные анализы могут использовать прогностическую ценность мультимодальной визуализации возрастной макулярной дегенерации (ВМД) на основе продольной оптической когерентной томографии (ОКТ). Донорские глаза человека с ВМД и без нее визуализируются с помощью ОКТ, цветной, сканирующей лазерной офтальмоскопии ближнего инфракрасного диапазона с отражением и аутофлуоресценции на двух длинах волн возбуждения перед разделением ткани.

Аннотация

Последовательность прогрессирования возрастной макулярной дегенерации (ВМД), полученная с помощью мультимодальной (MMI) клинической визуализации на основе оптической когерентной томографии (ОКТ), может повысить прогностическую ценность лабораторных результатов. В этой работе ex vivo OCT и MMI применялись к человеческим донорским глазам перед рассечением ткани сетчатки. Глаза были извлечены у белых доноров в возрасте ≥80 лет, не страдающих диабетом, со временем от смерти до сохранения (DtoP) ≤6 ч. Глобусы были извлечены на месте, забиты 18-миллиметровым трепаном для облегчения удаления роговицы и погружены в буферный 4% параформальдегид. Цветные изображения глазного дна были получены после удаления переднего сегмента с помощью препарирующего прицела и зеркальной камеры с использованием транс-, эпи- и вспышки освещения при трех увеличениях. Глобусы были помещены в буфер в специально разработанной камере с линзой 60 диоптрий. Они были изображены с помощью ОКТ в спектральной области (куб макулы 30°, расстояние 30 мкм, среднее значение = 25), коэффициент отражения в ближнем инфракрасном диапазоне, автофлуоресценцию 488 нм и автофлуоресценцию 787 нм. Глаза ВМД показали изменение пигментного эпителия сетчатки (RPE) с друзами или субретинальными друзеноидными отложениями (SDD), с неоваскуляризацией или без нее и без признаков других причин. В период с июня 2016 г. по сентябрь 2017 г. было восстановлено 94 правых глаза и 90 левых глаз (DtoP: 3,9 ± 1,0 ч). Из 184 глаз у 40,2% была ВМД, в том числе ранняя промежуточная (22,8%), атрофическая (7,6%) и неоваскулярная (9,8%) ВМД, а у 39,7% были ничем не примечательные макулы. Друзены, SDD, гиперрефлективные очаги, атрофия и фиброваскулярные рубцы были идентифицированы с помощью ОКТ. Артефакты включали помутнение тканей, отслоения (бациллярные, ретинальные, RPE, хориоидальные), фовеальные кистозные изменения, волнообразный RPE и механические повреждения. Для проведения криосекций использовались объемы ОКТ для определения ориентиров головки ямки и зрительного нерва и специфических патологий. Объемы ex vivo регистрировались вместе с объемами in vivo путем выбора эталонной функции для отслеживания взгляда. Видимость патологии , наблюдаемой in vivo , зависит от качества сохранности. В течение 16 месяцев было восстановлено и поставлено 75 быстрых донорских глаз DtoP на всех стадиях ВМД с использованием клинических методов MMI.

Введение

Пятнадцать лет лечения неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (ВМД) с помощью анти-VEGF-терапии под руководством оптической когерентной томографии (ОКТ) позволили по-новому взглянуть на последовательность прогрессирования и микроархитектуру этой распространенной причины потери зрения. Ключевым признанием является то, что ВМД является трехмерным заболеванием, поражающим нейросенсорную сетчатку, пигментный эпителий сетчатки (RPE) и сосудистую оболочку. В результате ОКТ-визуализации исследуемых пациентов и других глаз пациентов клиники, прошедших лечение, в настоящее время признаны особенности патологии, выходящие за рамки тех, которые видны при цветной фотографии глазного дна, являющейся клиническим стандартом на протяжении десятилетий. К ним относятся интраретинальная неоваскуляризация (макулярная неоваскуляризация^{1 типа 3}, ранее ангиоматозная пролиферация), субретинальные друзеноидные отложения (SDD, также называемые ретикулярными псевдодрузами)², множественные пути судьбы RPE^3,4 и интенсивно глиотические клетки Мюллера при атрофии ^5,6.

Модельные системы, в которых отсутствуют макулы (клетки и животные), воссоздают некоторые срезы этого сложного заболевания ^7,8,9. Дальнейший успех в облегчении бремени ВМД может быть достигнут благодаря открытию и исследованию первичной патологии в глазах человека, пониманию уникального клеточного состава макулы с последующей трансляцией в модельные системы. В этом отчете рассказывается о тридцатилетнем сотрудничестве между академической исследовательской лабораторией и глазным банком. Описанные здесь методы характеризации тканей преследуют две цели: 1) информировать развивающуюся диагностическую технологию, демонстрируя основы внешнего вида глазного дна и источников сигнала визуализации с помощью микроскопии, и 2) классифицировать образцы ВМД для целевых (иммуногистохимия) и нецелевых методов молекулярного обнаружения (масс-спектрометрия визуализации, IMS и пространственная транскриптомика), которые сохраняют только колбочку и богатые палочками пара- и перифовеи. Такие исследования могут ускорить переход к клинической ОКТ, для которой последовательность прогрессирования и продольное наблюдение возможны с помощью отслеживания взгляда. Эта технология, предназначенная для мониторинга эффектов лечения, регистрирует сканирование от одного посещения клиники до другого с использованием сосудов сетчатки. Связь ОКТ с отслеживанием глаз с лабораторными результатами, полученными с помощью деструктивных методов, может обеспечить новый уровень прогностической ценности молекулярных результатов.

В 1993 году исследовательская лаборатория сделала цветные фотографии посмертного глазного дна на^{пленку 10}. Эти усилия были вдохновлены превосходной фотомикроскопией и гистологией периферической сетчатки человека Foos и его коллегами 11,12,13 и обширными клинико-патологическими корреляциями AMD Sarks et ^al.14,15. Начиная с 2009 года, была принята мультимодальная визуализация ex vivo (MMI), основанная на ОКТ в спектральной области. Этот переход был вдохновлен аналогичными усилиями других 16,17 и особенно осознанием того, что большая часть ультраструктуры, описанной Сарками, со временем была доступна в трех измерениях в клинике ^18,19. Цель состояла в том, чтобы получить глаза с прикрепленными макулами в разумные сроки для мощных исследований фенотипов клеточного уровня в сетчатке, RPE и сосудистой оболочке. Цель состояла в том, чтобы выйти за рамки статистики «на глаз» к «типу поражения», стандарту, на который повлияли концепции «уязвимого налета» от сердечно-сосудистых заболеваний^20,21.

Протокол, приведенный в этом отчете, отражает опыт присоединения почти 400 пар донорских глаз в нескольких потоках. В 2011-2014 гг. был создан веб-сайт проекта MACULA по гистопатологии ВМД, который включает толщину слоев и аннотации из 142 архивных образцов. Эти глаза были сохранены с 1996 по 2012 год в глутаральдегидно-параформальдегидном фиксаторе для гистологии эпоксидной смолы высокого разрешения и электронной микроскопии. Все фундусы были сфотографированы в цвете при получении и были повторно сфотографированы с помощью ОКТ непосредственно перед гистологией. Держатель для глаз, первоначально разработанный для исследований^{зрительного нерва 22}, использовался для размещения пуансона ткани на всю толщину диаметром 8 мм, сосредоточенного на ямке. На сайт были загружены ОКТ-сканирование через фовеальный центр и участок на 2 мм выше, соответствующий гистологии на тех же уровнях, а также цветная фотография глазного дна. Выбор плоскостей ОКТ был продиктован выпуклостью патологии ВМД под ямкой²³ и выпуклостью SDD в богатых палочками участках, превосходящих ямку^24,25.

Начиная с 2013 года, глаза, визуализированные с помощью ОКТ-анкордированной MMI в течение жизни, были доступны для прямых клинико-патологических корреляций. Большинство (7 из 10 доноров) включали пациентов в реферальную практику сетчатки (автор: K.B.F.), которая предлагала расширенный директивный реестр для пациентов, заинтересованных в пожертвовании своих глаз после смерти для исследовательских целей. Глаза были извлечены и сохранены местным глазным банком, переданы в лабораторию и подготовлены так же, как глаза проекта MACULA. Предсмертные клинические тома ОКТ были легко счищены в лаборатории, что позволило согласовать признаки патологии, наблюдаемые в течение жизни, с особенностями, наблюдаемыми под микроскопом²⁶.

Начиная с 2014 года, проспективный сбор глаз начинался с скрининга на ВМД в донорских глазах без клинического анамнеза, но сохраненных в течение определенного периода времени (6 часов). Для этого держатель для глаз был модифицирован для размещения целого глобуса. Это уменьшило вероятность отрыва по срезанным кромкам ранее использовавшегося 8-мм пуансона. Глаза консервировали в 4% буферном параформальдегиде для иммуногистохимии и переводили на 1% на следующий день для длительного хранения. В 2016-2017 гг. (до пандемии) было восстановлено 184 глаза от 90 доноров. Статистика и изображения в этом отчете взяты из этой серии. В эпоху пандемии (блокировки и последствия 2020 года) перспективные коллекции для транскриптомики и сотрудничества IMS продолжались более медленными темпами, в основном с использованием методов 2014 года.

Существуют и другие методы оценки донорского глаза. Миннесотская система оценок (MGS)^27,28 основана на клинической системе AREDS для цветной фотографии глазного дна ²⁹. К ограничениям этого метода относится объединение атрофической и неоваскулярной ВМД в одну стадию «поздней ВМД». Кроме того, MGS влечет за собой удаление нейросенсорной сетчатки перед фотодокументацией сосудистой оболочки RPE. Этот шаг в разной степени смещает SDD ^30,31 и удаляет пространственное соответствие наружной сетчатки и ее поддерживающей системы. Таким образом, усилия по установлению связи метаболического спроса и передачи сигналов от сетчатки к патологии в РПЭ-сосудистой оболочке могут быть затруднены. Система штата Юта внедрила MMI с использованием цветной фотографии ex vivo и ОКТ для категоризации глаз, предназначенных для вскрытия, на области для экстракции РНК и белка³². Несмотря на то, что это предпочтительнее удаления целого наглазника, площадь диаметром 3 мм с наибольшим риском прогрессирования ВМД^33,34 составляет только 25% от пуансона диаметром 6 мм, ориентированного на ямку. Таким образом, методы, которые могут локализовать результаты в отношении ямки, такие как серийное сечение для иммуногистохимии, являются преимущественными.

протокол

Институциональный наблюдательный совет Университета Алабамы в Бирмингеме одобрил лабораторные исследования, которые соответствовали надлежащей лабораторной практике и уровню биобезопасности 2/2+. Все офтальмологические банки США соответствуют Единому закону об анатомических подарках 2006 года и Управлению по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Большинство офтальмологических банков США, в том числе Advancing Sight Network, соответствуют медицинским стандартам Американской ассоциации глазных банков.

В таблице материалов перечислены расходные материалы и оборудование. В дополнительном материале 1 представлен обзор вскрытия, цветной фотографии глазного дна и MMI на основе ОКТ. В дополнительном материале 2 содержатся подробные сведения о MMI на основе OCT.

1. Критерии забора тканей

1. Чтобы максимизировать выход глаз ВМД при скрининге недокументированных доноров, установите следующие критерии для приемлемых доноров: возраст ≥80 лет, белый, без диабета и ≤6 ч от смерти до сохранения (DtoP).
   ПРИМЕЧАНИЕ: DtoP определяется как время между смертью и помещением глаза в предоставленный консервант либо в больнице, либо в лаборатории.

2. Консервационная среда и другая подготовка (лаборатория)

1. Сделайте 4% фосфатно-буферный параформальдегид из 20% запаса (покупной). Приготовьте 1 л, добавив 200 мл 20% параформальдегида (коэффициент разбавления 5) к 800 мл 0,1 М фосфатного буфера Соренсона. При необходимости проверьте и отрегулируйте, чтобы убедиться, что pH составляет 7,2. Хранить при температуре 4 °C.
2. Распределите 30 мл 4% фосфатно-буферного параформальдегида в банки по 40 мл.
3. Храните маркированные контейнеры с консервантом объемом 40 мл в глазном банке, чтобы ткань можно было восстановить в любое время и в любой день.
4. Для хранения законсервированных глаз из 1% раствора делают 4% параформальдегид. Приготовьте 1 л, добавив 250 мл 4% параформальдегида (коэффициент разбавления 4) к 750 мл 0,1 М фосфатного буфера Соренсона. При необходимости проверьте и отрегулируйте pH. Хранить при температуре 4 °C.
   1. Приготовьте 1 л 0,1 М раствора из 0,2 М раствора фосфатного буфера Соренсона, рН 7,2, комбинируя 500 мл дистиллированной воды и 500 мл буфера Соренсона.
   2. Отрегулируйте рН по каплям, используя 1 Н соляной кислоты или 1 Н гидроксида натрия. Хранить при температуре 4 °C.
5. Создайте держатель для стабилизации глаз во время рассечения. Наполните чашку Петри зубным воском, нагретым до состояния жидкости. Когда он немного остынет, сделайте в нем полусферический оттиск с помощью большого шарикоподшипника, а затем заморозьте блюдо, чтобы облегчить снятие шарикоподшипника.

3. Методы глазного банка

1. Чтобы обеспечить быстрое восстановление исследуемых тканей, быстро восстанавливают все ткани, в том числе и предназначенные для трансплантации.
2. Получайте направления на смерть, как того требует закон, в течение 1 часа после смерти и отслеживайте каждого донора с помощью порядкового номера направления, который следует за тканью.
3. Чтобы найти случаи с потенциальной клинической документацией, задайте вопросы, связанные с ВМД и заболеваниями глаз, в интервью по оценке риска доноров.
4. Чтобы свести к минимуму время в пути, восстанавливайте целые глобусы (а не только роговицы для трансплантации) на компактной территории (т.е. в городе и прилегающем пригородном округе).
5. Принесите две банки консерванта (буферизованного 4% параформальдегида) в больничную палату умершего для восстановления тканей (в отличие от ожидания, пока тело перевезут в морг).
6. До и во время выздоровления общайтесь со следователями, чтобы подтвердить доставку и сроки.
7. Извлеките глобусы на месте в больнице, откройте их с помощью последовательных методов обработки и погрузите открытый глаз в консервант (рис. 1).
   1. Удерживайте иссеченный донорский глаз на месте, используя оболочку из марли, стабилизированную гемостатом.
   2. Чтобы облегчить удаление роговицы с ободком склеры шириной 2 мм, используйте трепан диаметром 18 мм для забивания глобуса.
   3. Чтобы освободить роговицу с сопутствующим ободком склеры, разрежьте вдоль забитого круга с помощью подпружиненных ножниц с изогнутыми кончиками, стабилизируя глобус с помощью марли, обрезанной гемостатом.
   4. Поднимите роговицу со склеры, обнажив радужную оболочку и цилиарное тело.
   5. Для облегчения проникновения консерванта в стекловидную камеру делают щель длиной 2 мм в радужной оболочке перпендикулярно зрачковому краю. Поместите глаза в банки с образцами с 30 мл консерванта при температуре 4 ° C и перенесите в лабораторию на влажном льду.
8. Передача обезличенной информации о донорах в электронном виде из банка глаз в базу данных исследовательской лаборатории.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В базе данных хранится реферальный номер, номер ткани глазного банка и идентификационный номер лаборатории для отслеживания, а также другая соответствующая информация.

4. Подготовка тканей к цветной фотосъемке глазного дна ex vivo

1. Используйте два стереомикроскопа, один для вскрытия и один для цветной фотографии глазного дна.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансиллюминации для визуализации пигментных изменений используйте основу для темнопольной микроскопии.
2. Удалите остатки переднего сегмента (радужную оболочку и хрусталик). Чтобы стабилизировать глаз во время вскрытия, поместите его в чашку Петри, наполненную воском (дополнительный материал 1, слайды 7-8). Чтобы цилиарное тело и прикрепленная сетчатка не схлопывались в полость стекловидного тела, минимизируйте возмущение кольца толстого стекловидного тела, прикрепленного к цилиарному телу (основанию стекловидного тела).
3. Отметьте верхний полюс для ориентации. Положите глобус передней стороной вниз в блюдо. Найдите вставные сухожилия верхней прямой мышцы и верхней косой мышцы. Используя деревянный аппликатор, осторожно нанесите маркировочные чернила по линии 10 мм в направлении от переднего к заднему (т. е. перпендикулярно сухожильному введению верхней прямой мышцы).
4. Перед фотосъемкой заполните глазное ное дно холодным фосфатным буфером Соренсена.
5. Вставьте рубиновую бусину диаметром 1 мм в глазное дно в виде внутренней шкалы, которая будет отображаться на каждом изображении²⁷.
6. Получайте цветные изображения с помощью однообъективной зеркальной камеры, установленной на стереомикроскопе с кольцевой вспышкой. Используйте транс-, эпи- и вспышку при каждом из трех стандартных увеличений для получения изображений, предназначенных для выделения определенных областей (дополнительный материал 1, слайд 11): 1) глазное дно до экватора, 2) задний полюс (сосудистые аркады, головка зрительного нерва, ямка) и 3) ямка в желтой пятне (желтое пятно).

5. Подготовка к цветной фотосъемке глазного дна ex vivo

1. Включите камеру и монитор. Подключите дистанционный затвор и отпустите привод в мониторе камеры/телевизора (ТВ) мультимедийного интерфейса высокой четкости (HDMI) и кабеле дисплея.
2. Установите в настройках камеры ручную функцию ISO и положение блокировки зеркала (зафиксировано на месте для уменьшения вибрации).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству пользователя производителя для получения информации о настройках используемой камеры. Узнайте на дисплее камеры настройки передержки/недодержки относительно гистограммы и показаний экспозиции.
3. Расположите два источника света, каждый с двумя гибкими световодами, расположенными перпендикулярно друг другу, для освещения в четырех основных направлениях на предметном столике микроскопа (Дополнительный материал 1, стр. 10).
4. Включите источники света с эпиподсветкой на полную мощность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно, но не обязательно иметь черный войлочный кожух вокруг сцены, чтобы ограничить рассеяние света / вспышки для фотографа.
5. На препарирующем микроскопе используйте щипцы, чтобы вставить задний полюс в кварцевый тигель объемом 30 мл, заполненный буфером. Дайте ткани опуститься на дно. Вставьте связку, например, тканевую губку, между глазом и стенкой тигля, чтобы предотвратить движение. Вставьте рубиновую бусину диаметром 1 мм в задний полюс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шарик может попасть в чашечку зрительного нерва.
6. Осторожно поместите глобус в тигель на столик стереомикроскопа и осмотрите внутреннее глазное дно через окуляры микроскопа. Используя наименьшее увеличение, сориентируйте глаз, определив тканевую метку в положении «12 часов», головку зрительного нерва (ONH) и ямку на 5° ниже ONH. Поверните глаз так, чтобы ямка опустилась ниже линии, проходящей через ONH, на 5°.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если это правый глаз, ONH находится справа от ямки, как видно из глаз микроскопа. Если это левый глаз, ONH находится слева от ямки.
7. Включите удаленный просмотр монитора с камеры. Убедитесь, что ползунок светоделителя микроскопа настроен на наблюдение через фотопорт, а не через порт для окуляров. В зависимости от световой и зеркальной траектории будьте готовы повернуть ткань на сцене на 180° для правильной ориентации.

6. Получение изображения с использованием цветной фотографии глазного дна ex vivo

1. При включенной эпиподсветке установите увеличение так, чтобы весь 18-миллиметровый трепан-разрез занимал все поле зрения. Увеличьте увеличение, чтобы можно было сфокусироваться на дне фовеальной ямки. Уменьшите масштаб до предыдущего значения.
2. Отрегулируйте настройки ISO в диапазоне 1,600-3,000 так, чтобы время экспозиции попадало в центральный диапазон измерителя на камере.
3. Нажмите на спусковой крючок дистанционного затвора. Прислушайтесь, пока зеркало не зафиксируется в верхнем положении. Нажмите на спусковой крючок еще раз для экспозиции.
4. Наблюдайте за изображением на мониторе с предустановленными метаданными, показывающими красный, зеленый, синий (RGB) и цветную гистограмму для правильной экспозиции. Если воздействие приемлемо, продолжайте; Если нет, то удалите, переоцените параметры и повторно создайте образ.
5. Выключите лампы на гусиной шее для эпи-подсветки, чтобы выделить друзы, и включите вспышку с экспозицией 1/4 с, выдержкой камеры 1/250 с и ISO 100-320. Установите скорость вспышки по умолчанию или измените ее во время первоначальной настройки камеры. Получите изображение и проверьте гистограмму на правильность экспозиции.
6. Выключите вспышку и включите источник света с транссветом. Сбросьте ISO до уровня выше 5,000 и убедитесь, что время экспозиции не опускается ниже 1/30 с из-за потенциальной вибрации в фотосистеме. Получите изображение и проверьте гистограмму на правильность экспозиции.
7. Увеличьте увеличение, чтобы увидеть как ONH, так и fovea в поле зрения. Включите лампы эпи-подсветки. Установите диапазон ISO на 1,600-3,000. Убедитесь, что время экспозиции находится в центральном диапазоне камеры.
8. Выключите лампы эпи-подсветки и включите вспышку с экспозицией 1/4 с, предустановленной выдержкой камеры на 1/250 с и ISO на 400-800. Получите изображение и проверьте гистограмму на правильность экспозиции.
9. Выключите вспышку и включите транс-подсветку с помощью базы темного поля. Сбросьте ISO до уровня выше 5,000. Убедитесь, что время экспозиции не медленнее 1/30 с из-за потенциальной вибрации в фотографической системе. Получите изображение и проверьте правильность гистограммы.
10. Выключите трансиллюминацию и снова включите лампы эпи-подсветки.
11. Увеличьте увеличение до того, которое использовалось на шаге 6.7. При необходимости переориентируйтесь.
12. Увеличьте ISO в диапазоне 3,000-6,000 и отрегулируйте время экспозиции, чтобы оно соответствовало правильному диапазону экспозиции камеры. Приобретите изображение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рубиновая бусина может больше не отображаться в поле зрения. Если это так, сделайте отдельные изображения бусины с этим увеличением для справки.
13. Выключите лампы эпи-подсветки. Включите вспышку с выдержкой 1/4 с и с выдержкой фотоаппарата до 1/250 с. Установите скорость вспышки по умолчанию или измените ее во время первоначальной настройки камеры и установите ISO на 500-1,000. Приобретите изображение. Проверьте гистограмму на правильность экспозиции.
14. Выключите вспышку и включите лампы пересветки. Сбросьте ISO до уровня выше 8,000, чтобы обеспечить более быстрое время экспозиции с более чувствительным датчиком изображения. Следите за тем, чтобы время экспозиции не опускалось ниже 1/30 с из-за потенциальной вибрации в фотосистеме. Приобретите изображение.
15. Экспортируйте изображения с камеры на компьютер. Просмотрите изображения, прежде чем извлекать образец из столика микроскопа, на случай, если некоторые из них необходимо захватить снова.

7. Обзор получения изображений для ОКТ ex vivo и сканирующей лазерной офтальмоскопии (SLO)

1. Для ОКТ в спектральной области поместите глобусы в фосфатный буфер в специальный держатель для глаз с камерой с линзой 60 диоптрий³⁵. Установите держатель для глаз на кронштейн на клиническом устройстве ОКТ-визуализации и прикрепите его к тому месту, где пациент будет опираться лбом. Устройство центра развертывания Office автоматически вставляет масштабную линейку в каждое изображение.
2. В то же время, используя то же устройство и с глазом, все еще находящимся в держателе, снимите глобусы с помощью сканирующего лазерного офтальмоскопа (SLO) с использованием ближнего инфракрасного отражения (NIR, используемого в качестве локаторного изображения внутренним программным обеспечением), автофлуоресценции возбуждения глазного дна 488 нм (FAF) и отражения без красного (RF).
   ПРИМЕЧАНИЕ: FAF возбуждения 787 нм в этом устройстве подходит только изредка, потому что светоделитель снижает коэффициент пропускания света в SLO. По этой причине используется второе устройство для изображений FAF с длиной волны 787 нм (см. следующий пункт).
3. Отдельно, но с глазом, все еще находящимся в держателе глаза, получите изображение глобусов с FAF 787 нм для обнаружения возмущения^{RPE 36} с помощью отдельного устройства, которое хорошо отображает эту модальность.

8. Протокол получения изображений для ex vivo OCT/SLO (см. слайды в Дополнительном материале 2)

1. Обозначьте верхнюю прямую мышцу тканевым маркировочным красителем. Включите лазер (синяя стрелка, Дополнительный материал 2, стр. 1).
2. Ссылаясь на стр. 2 Дополнительного материала 2, расположите головку ОКТ, переместив весь блок по двум осям относительно основания (зеленая стрелка), а затем увеличив высоту (y), повернув джойстик по часовой стрелке/против часовой стрелки (cw/ccw, синие стрелки). Сфокусируйте изображение, повернув ручку (оранжевая стрелка) с черным рычагом в положении R (*). Зафиксируйте устройство, закрепив винт с накатанной головкой (фиолетовая стрелка).
3. Вставьте глаз в держатель и стабилизируйте его сзади с помощью прокладок (Дополнительный материал 1, стр. 13). Оказывайте как можно меньшее давление, чтобы избежать вмятин на склерах. Ориентируйтесь так, чтобы тканевая метка для верхней прямой мышцы была обращена вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительное расстояние от передней части держателя глаза до устройства OCT составляет 25 мм.
4. Откройте проприетарное программное обеспечение для визуализации и анализа для устройства OCT. В левом столбце появится список пациентов. Доноры глаз, индексируемые внутренним кодовым номером, являются «пациентами». Обратитесь к руководству пользователя от производителя.
5. Выберите значок «Новый пациент ». При необходимости заполните данные о пациенте. Нажмите кнопку ОК. Используйте логически упорядоченную систему нумерации для отдельных глаз, например YYYYNNNL,R_agesex. Например, это может быть 2017016R_97F.
6. Продолжив ввод данных в следующем окне, нажмите OK. Выберите оператора и изучите из выпадающего меню.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Введенная информация появится в экспортируемых метаданных.
7. После просмотра пустого экрана нажмите желтую кнопку, чтобы начать получение изображения.
8. Нажмите ИК + OCT (ближний инфракрасный коэффициент отражения + OCT). Позвольте лазеру получить живое SLO-изображение глазного дна и ОКТ B-сканирование.
   1. Определите правильное анатомическое положение на основе ONH и ямки и используйте деревянный аппликатор для регулировки положения глаз в держателе. На панели управления поверните черную круглую кнопку, чтобы отрегулировать интенсивность.
   2. Нажмите ту же кнопку, чтобы усреднить 9-100 кадров (красные стрелки; 9 достаточно, 100 выглядит кремовым). Если аппарат ориентирован правильно, глазное дно должно быть в фокусе, а ОКТ B-скан должен появиться в верхней трети дисплея (Дополнительный материал 2, стр. 9, двойная красная стрелка).
   3. На изображении глазного дна с помощью курсора переместите синюю линию, чтобы отцентрировать ямку (Дополнительный материал 2, стр. 9, белая стрелка). Нажмите Приобрести.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другими кнопками по умолчанию являются Retina, EDI (выкл.) и Line Scan.
9. Нажмите RF + OCT для следующего приобретения. Еще раз проверьте положение, чтобы убедиться, что изображение не сдвинулось и не ухудшилось. Нажмите черную кнопку для усреднения. Нажмите Приобрести.
10. Переключите внутренний куб для автофлуоресцентной визуализации на длины волн возбуждения 488 нм и 787 нм (дополнительный материал 2, стр. 10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Показано положение куба после переключателя.
11. Выберите режим автофлуоресценции . Еще раз проверьте выравнивание. Нажмите Приобрести.
12. При подозрении на нарушение и атрофию RPE выберите ICGA (индоцианиновую зеленую ангиографию) для автофлуоресценции 787 нм. Еще раз проверьте положение глаз и нажмите кнопку Приобрести.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение глазного дна часто не появляется в этой модальности, потому что внутренний куб ослабляет луч.
13. Переключите внутренний куб обратно в положение R для ИК-изображения и изображения без красного для получения объема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положение куба после переключателя показано на стр. 13 Дополнительного материала 2.
14. Чтобы получить тома центра развертывания Office, выберите IR и настройку тома. Сопоставьте все настройки, указанные на стр. 14 Дополнительного материала 2 , переключив соответствующие кнопки на модуле управления (куб макулы 30°, расстояние 30 мкм, усреднение в зависимости от требований эксперимента).
15. Обратите внимание, что вид глазного дна с отражением в ближнем инфракрасном диапазоне покрыт синими линиями B-скана. Еще раз проверьте положение центра развертывания Office в верхней трети правого окна. Нажмите «Получить » на модуле управления и подождите 5 минут, пока не завершится сканирование тома. Когда получение изображения будет завершено, выберите EXIT. Изображения будут сохранены (красная стрелка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Синие линии разграничивают расстояния, показанные на предыдущем представлении, в микрометрах. Сканирование начинается с нумерации снизу (снизу) и продолжается вверх. Обратите внимание на прогрессию красной линии.
16. Позвольте компьютеру обработать полученные изображения, которые появятся на экране (Дополнительный материал 2, стр. 16).
17. При визуализации других глаз одного донора не изменяйте положение монтажного кронштейна между глазами. Если сначала будет изображен левый глаз, результаты будут отображаться в столбце OD (правый глаз). Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать все образы, а затем выберите Exchange OS/OD. Образы перейдут в столбец ОС.
18. Нажмите кнопку Выбрать > окне > базы данных. По умолчанию на экране отображается панель 6 с добавлением донорского глаза, изображенного в правом столбце (Дополнительный материал 2, стр. 18). Щелкните правой кнопкой мыши пациента в раскрывающемся меню, выберите «Пакетная обработка» и экспортируйте файл E2E.
19. Перейдите в заранее определенную папку, созданную на рабочем столе для передачи файлов. Нажмите кнопку ОК. Папка содержит файлы E2E, которые необходимо скопировать на внешний жесткий диск и заархивировать.
20. Поднесите глаз в держателе к сканирующему лазерному офтальмоскопу, который в основном используется для автофлуоресценции 787 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: обратитесь к руководству пользователя производителя для получения и архивирования изображений.
21. Включите компьютер и лазер.
22. Выберите значок «Новый пациент ». При необходимости заполните данные о пациенте.
23. Чтобы сохранить таблицу глаз прежней, нажмите кнопку ОК. Поскольку С-образная кривая остается прежней, нажмите «Продолжить».
24. Выберите «Режим обучения» и при необходимости введите пароль. Держите С-образную кривую на расстоянии 7,7 мм. Нажмите ОК.
25. Нажмите кнопку Продолжить, чтобы проверить С-образную кривую. Выберите желтый индикатор, чтобы запустить камеру.
26. Выберите позицию R . Выровняйте и сориентируйте земной шар. Выберите ИК-режим , чтобы сфокусироваться и сориентироваться, как указано выше.
27. Сориентируйте головку камеры, переместив весь блок по двум осям относительно основания (дополнительный материал 2, стр. 28, зеленая стрелка), а затем подняв высоту (y) устройства (синие стрелки). Сфокусируйте изображение, вращая ручку (оранжевая стрелка). Черный рычаг находится в положении R (*). После того, как эта головка встанет на место, зафиксируйте устройство, повернув винт с накатанной головкой (фиолетовая стрелка).
28. Обратите внимание, что экран выглядит так, как показано на стр. 29 Дополнительного материала 2.
29. Переместите ручку селектора из положения R в положение A. Выберите ICGA (для достижения автофлуоресценции 787 нм) синего цвета, 100% интенсивности, поля зрения 30° и однофазной визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как и краситель индоцианин зеленый, меланин возбуждается светом с длиной волны 787 нм.
30. Обратите внимание, что экран выглядит так, как показано на стр. 31 Дополнительных материалов 2. Нажмите черный диск для усреднения, а затем выберите Приобрести.
31. Выберите «Окно» > «База данных». Выберите «Импортировать файлы E2E с устройства SLO»; Эти файлы хранятся на внешнем жестком диске и загружаются на рабочий стол.
32. Выберите Открыть. Убедитесь, что отметки установлены по умолчанию, и нажмите кнопку ОК.
33. Обратите внимание, что у пациента теперь есть две вкладки: одна показывает изображения, полученные с помощью SLO (синяя стрелка), а другая вкладка показывает изображения, полученные с помощью устройства OCT (красная стрелка) (Дополнительный материал 2, стр. 34).
34. Щелкните правой кнопкой мыши изображение с длиной волны 786 нм (ICGA) и экспортируйте изображение в файл с надписью SLO 786 на рабочем столе.
35. Чтобы сохранить изображение SLO с автофлуоресценцией 786 нм, выберите пациента и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы экспортировать изображения в виде файлов RAW (для файлов .vol) в папку на рабочем столе.
36. Чтобы экспортировать изображения с устройства развертывания Office для передачи на архивный компьютер, скопируйте или вставьте из RAWEXPORT в папку с меткой RAW.

9. Обзор изображений

1. Соберите изображения (цветные, файлы .vol, изображения SLO) в папки для каждого донора с подпапками для каждого глаза и последовательно проиндексируйте папки по идентификатору лаборатории.
2. Запишите отпечатки тканей (качество, патология) в базу данных для стандартизированного отчета.
3. Просмотрите экспортированные тома центра развертывания Office с помощью собственного подключаемого модуля ImageJ.
   1. Найдите центр ямки, который можно узнать по центру фовеального провала, внутреннему подъему наружных полос сетчатки или самой тонкой точке. В большинстве случаев они будут совпадать, но не всегда, так как это зависит от фовеальной сохранности, индивидуальной изменчивости и наличия патологии.
   2. Найдите стандартное сканирование в верхней перифове (2 мм/67 B-сканов в верхнем направлении; т. е. увеличивая количество сканов).
   3. Сохраните .tif стек всего тома для быстрого использования в будущем.
   4. Прокрутите том центра развертывания Office полностью, начиная со сканирования 1 (ниже), записывая при этом номера сканов, в которых распознаются объекты.
   5. Проверьте перипапиллярную область в дополнение к макуле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перипапиллярная хориоретинальная атрофия в старых глазах включает характерный базальный ламинарный отложение и неоваскуляризацию. Это распространенная область пигментных изменений при близорукости глаз и глаукоме, а также при старении и^{ВМД 37}.
4. Осмотрите цветные фотографии и свяжите любые результаты с теми, которые были замечены ОКТ, если это возможно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, большинство результатов легче увидеть с помощью ОКТ. Цветные фотографии дают большой обзор области за пределами области на SLO, хориоидальную пигментацию, включая невусы, наличие гемовых и твердых экссудатов, а также черный пигмент при неоваскулярной ВМД. Темный пигмент в ямке может представлять собой рыхлые меланосомы из переднего сегмента и должен быть аккуратно смыт буфером с помощью пипетки.
5. Проверьте изображения SLO и, если возможно, свяжите все результаты с теми, которые были видны с помощью OCT.
6. Сохраняйте стандартные B-сканы в ямке и перифове, дополнительные B-сканы с заметной патологией или другими признаками, а также изображения SLO в отчете о патологии.
7. Классифицируйте глаза следующим образом: ничем не примечательная, сомнительная, ранняя-средняя ВМД, атрофическая ВМД, неоваскулярная ВМД, другая, неизвестная, не поддающаяся градации, не зарегистрированная. «Сомнительный» используется, если неясно, являются ли изменения достаточно серьезными для другой категоризации. «Не градуируется» зарезервировано для глаз, в которых отсутствуют полезные ОКТ-сканирования, например, с сильно отслоившейся сетчаткой. «Не записано» зарезервировано для глаз, которые обрабатываются сразу после получения без фотографии.
8. Используйте следующие критерии для ВМД: тяжелое изменение РПЭ с друзами или субретинальными друзеноидными отложениями, с признаками неоваскуляризации или без них, такими как жидкость или фиброз, и без признаков других причин (обновлено из Curcio et ^al.10 для учета SDD).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный диагноз подтверждается гистологическим анализом.

Результаты

Из таблицы 1 видно, что в течение 2016-2017 гг. было восстановлено 184 глаза от 94 белых доноров, не страдающих диабетом, > возрасте 80 лет. Среднее время от смерти до сохранения составило 3,9 ч (диапазон: 2,0-6,4 ч). Из 184 обследованных глаз у 75 (40,2%) была определенная ВМД. Были выявлены следующие ...

Обсуждение

Используя популяционный подход к скринингу в течение 16-месячного периода в доковидную эпоху, удалось получить 75 донорских глаз с ВМД. Все они были восстановлены с помощью короткого DtoP и поставлены с использованием MMI с привязкой к OCT. Возрастной критерий (>80 лет) выходит за рамки типичног...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12