Ex Vivo Imágenes multimodales basadas en OCT de ojos de donantes humanos para la investigación de la degeneración macular relacionada con la edad

Resumen

Los ensayos de laboratorio pueden aprovechar el valor pronóstico de la tomografía de coherencia óptica longitudinal (OCT) basada en imágenes multimodales de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). Los ojos de donantes humanos con y sin DMAE se obtienen imágenes mediante OCT, color, oftalmoscopia láser de escaneo de reflectancia en el infrarrojo cercano y autofluorescencia en dos longitudes de onda de excitación antes de la sección del tejido.

Resumen

Una secuencia de progresión para la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) aprendida a partir de imágenes clínicas multimodales (MMI) basadas en la tomografía de coherencia óptica (OCT) podría agregar valor pronóstico a los hallazgos de laboratorio. En este trabajo, se aplicaron OCT y MMI ex vivo a los ojos de donantes humanos antes de la sección del tejido retiniano. Los ojos fueron recuperados de donantes blancos no diabéticos de ≥80 años de edad, con un tiempo de muerte a preservación (DtoP) de ≤6 h. Los globos se recuperaron in situ, se marcaron con un trepano de 18 mm para facilitar la extracción de la córnea y se sumergieron en paraformaldehído al 4% tamponado. Las imágenes de fondo de ojo en color se adquirieron después de la extracción del segmento anterior con un endoscopio de disección y una cámara SLR que usaba iluminación trans, epi y flash a tres aumentos. Los globos se colocaron en un búfer dentro de una cámara diseñada a medida con una lente de 60 dioptrías. Se obtuvieron imágenes con OCT de dominio espectral (cubo de mácula de 30 °, espaciado de 30 μm, promedio = 25), reflectancia en el infrarrojo cercano, autofluorescencia de 488 nm y autofluorescencia de 787 nm. Los ojos de la DMAE mostraron un cambio en el epitelio pigmentario de la retina (EPR), con drusas o depósitos druenoides subretinianos (SDD), con o sin neovascularización, y sin evidencia de otras causas. Entre junio de 2016 y septiembre de 2017, se recuperaron 94 ojos derechos y 90 ojos izquierdos (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). De los 184 ojos, el 40,2% tenía DMAE, incluyendo DMAE intermedia temprana (22,8%), atrófica (7,6%) y neovascular (9,8%), y el 39,7% tenía máculas poco notables. Las drusas, las SDD, los focos hiperreflectantes, la atrofia y las cicatrices fibrovasculares se identificaron mediante OCT. Los artefactos incluyeron opacificación tisular, desprendimientos (bacilar, retinal, EPR, coroideo), cambio quístico foveal, un EPR ondulado y daño mecánico. Para guiar la criosección, se utilizaron volúmenes de OCT para encontrar los puntos de referencia de la fóvea y la cabeza del nervio óptico y patologías específicas. Los volúmenes ex vivo se registraron con los volúmenes in vivo seleccionando la función de referencia para el seguimiento ocular. La visibilidad ex vivo de la patología observada in vivo depende de la calidad de conservación. En 16 meses, se recuperaron y estadificaron 75 ojos de donantes de DtoP rápida en todas las etapas de la DMAE utilizando métodos clínicos de IMM.

Introducción

Quince años de manejo de la degeneración macular neovascular relacionada con la edad (DMAE) con terapia anti-VEGF bajo la guía de la tomografía de coherencia óptica (OCT) ha ofrecido nuevos conocimientos sobre la secuencia de progresión y la microarquitectura de esta causa prevalente de pérdida de visión. Un reconocimiento clave es que la DMAE es una enfermedad tridimensional que involucra la retina neurosensorial, el epitelio pigmentario de la retina (EPR) y la coroides. Como resultado de las imágenes de OCT de los pacientes del ensayo y los ojos de los pacientes clínicos tratados, ahora se reconocen las características de la patología más allá de las observadas por la fotografía de fondo de ojo en color, un estándar clínico durante décadas. Estos incluyen neovascularización intrarretiniana (neovascularización macular tipo 3¹, anteriormente proliferación angiomatosa), depósitos drusenoides subretinianos (SDD, también llamados pseudodrusas reticulares)², múltiples vías de destino del EPR^3,4 y células de Müller intensamente glióticas en la atrofia ^5,6.

Los sistemas modelo que carecen de máculas (células y animales) recrean algunas rebanadas de esta compleja enfermedad ^7,8,9. El éxito adicional en la mejora de la carga de la DMAE podría provenir del descubrimiento y la exploración de la patología primaria en los ojos humanos, la comprensión de la composición celular única de la mácula, seguido de la traducción a sistemas modelo. Este informe retrata una colaboración de tres décadas entre un laboratorio de investigación académica y un banco de ojos. Los objetivos de los métodos de caracterización tisular descritos en este documento son dobles: 1) informar la evolución de la tecnología de diagnóstico al demostrar la base de la apariencia del fondo de ojo y las fuentes de señales de imagen con microscopía, y 2) clasificar las muestras de DMAE para técnicas de descubrimiento molecular dirigidas (inmunohistoquímica) y no dirigidas (espectrometría de masas de imágenes, IMS y transcriptómica espacial) que preservan la fóvea y la fóvea y perifovea ricas en conos y barras. Dichos estudios podrían acelerar la traducción a OCT clínica, para lo cual es posible una secuencia de progresión y un seguimiento longitudinal a través del seguimiento ocular. Esta tecnología, que está diseñada para monitorear los efectos del tratamiento, registra escaneos de una visita clínica a la siguiente utilizando vasos retinianos. Vincular la OCT con seguimiento ocular con los resultados de laboratorio obtenidos con técnicas destructivas podría proporcionar un nuevo nivel de valor pronóstico a los hallazgos moleculares.

En 1993, el laboratorio de investigación capturó fotografías en color del fondo de ojo postmortem en la película¹⁰. Este esfuerzo fue inspirado por la excelente fotomicroscopía e histología de la retina periférica humana por Foos y colegas 11,12,13 y las extensas correlaciones clinicopatológicas de DMAE por Sarks et ^al.14,15. A partir de 2009, se adoptaron imágenes multimodales ex vivo (MMI) ancladas en OCT de dominio espectral. Esta transición fue inspirada por los esfuerzos similares de otros 16,17 y especialmente por la comprensión de que gran parte de la ultraestructura descrita por los Sarks estaba disponible en tres dimensiones, con el tiempo, en la clínica ^18,19. El objetivo era adquirir ojos con máculas adheridas en un marco de tiempo razonable para estudios con buena potencia de fenotipos a nivel celular en la retina, RPE y coroides. La intención era ir más allá de las estadísticas "por ojo" a "por tipo de lesión", un estándar influenciado por los conceptos de "placa vulnerable" de la enfermedad cardiovascular^20,21.

El protocolo en este informe refleja la experiencia con casi 400 pares de ojos de donantes accedidos en varias corrientes. En 2011-2014, se creó el sitio web del Proyecto MACULA de histopatología de DMAE, que incluye espesores de capas y anotaciones de 142 especímenes archivados. Estos ojos se conservaron de 1996 a 2012 en un fijador de glutaraldehído-paraformaldehído para histología de resina epoxi de alta resolución y microscopía electrónica. Todos los fundi habían sido fotografiados en color cuando se recibieron y fueron reimaginados por OCT justo antes de la histología. Se utilizó un soporte para ojos diseñado originalmente para estudios del nervio óptico²² para acomodar un punzón de tejido de espesor total de 8 mm de diámetro centrado en la fóvea. Se cargaron en el sitio web exploraciones B de OCT a través del centro foveal y un sitio 2 mm superior, correspondiente a histología en los mismos niveles, además de una fotografía de fondo de ojo en color. La elección de los planos OCT fue dictada por la prominencia de la patología DMAE bajo la fóvea²³ y la prominencia de las SDD en áreas ricas en varillas superiores a la fóvea^24,25.

A partir de 2013, los ojos fotografiados con IMM anclada en OCT durante la vida estaban disponibles para correlaciones clinicopatológicas directas. La mayoría (7 de 10 donantes) involucraron a pacientes en una práctica de derivación de retina (autor: K.B.F.), que ofrecía un registro de directivas avanzadas para pacientes interesados en donar sus ojos después de la muerte con fines de investigación. Los ojos fueron recuperados y preservados por el banco de ojos local, transferidos al laboratorio y preparados de la misma manera que los ojos del Proyecto MACULA. Los volúmenes clínicos de OCT pre-mortem fueron leídos sin problemas en el laboratorio, alineando así las características patológicas observadas durante la vida con las características observadas bajo el microscopio²⁶.

A partir de 2014, la recolección prospectiva de ojos comenzó con la detección de DMAE en ojos de donantes sin antecedentes clínicos, pero conservados durante un límite de tiempo definido (6 h). Para este propósito, el soporte del ojo se modificó para acomodar todo un globo. Esto redujo la posibilidad de desprendimiento alrededor de los bordes cortados del punzón de 8 mm utilizado anteriormente. Los ojos se conservaron en paraformaldehído tamponado al 4% para inmunohistoquímica y se transfirieron al 1% al día siguiente para el almacenamiento a largo plazo. En 2016-2017 (antes de la pandemia), se recuperaron 184 ojos de 90 donantes. Las estadísticas e imágenes de este informe se generan a partir de esta serie. Durante la era de la pandemia (cierres y secuelas de 2020), las colecciones prospectivas para la transcriptómica y las colaboraciones de IMS continuaron a un ritmo reducido, esencialmente utilizando los métodos de 2014.

Existen otros métodos para la evaluación ocular del donante. El Minnesota Grading System (MGS)^27,28 se basa en el sistema clínico AREDS para la fotografía de fondo de ojo en color ²⁹. Las limitaciones de este método incluyen la combinación de DMAE atrófica y neovascular en una etapa de "DMAE tardía". Además, el MGS implica la extirpación de la retina neurosensorial antes de la fotodocumentación de la coroides del EPR. Este paso desaloja las SDD en diversos grados^30,31 y elimina la correspondencia espacial de la retina externa y su sistema de soporte. Por lo tanto, los esfuerzos para vincular la demanda metabólica y la señalización de la retina a la patología en el EPR-coroides pueden verse obstaculizados. El Sistema de Utah implementó MMI utilizando fotografía en color ex vivo y OCT para categorizar los ojos destinados a la disección en regiones para extracciones de ARN y proteínas³². Aunque es preferible a las extracciones enteras del ocular, el área de 3 mm de diámetro con mayor riesgo de progresión de la DMAE^33,34 representa solo el 25% de un punzón centrado en la fóvea de 6 mm de diámetro. Por lo tanto, las técnicas que pueden localizar los hallazgos en referencia a la fóvea, como la sección seriada para inmunohistoquímica, son ventajosas.

Protocolo

La junta de revisión institucional de la Universidad de Alabama en Birmingham aprobó los estudios de laboratorio, que se adhirieron a las Buenas Prácticas de Laboratorio y al Nivel de Bioseguridad 2/2+. Todos los bancos de ojos de EE.UU. cumplen con la Ley Uniforme de Regalos Anatómicos de 2006 y la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. La mayoría de los bancos de ojos de los Estados Unidos, incluida Advancing Sight Network, cumplen con los estándares médicos de la Eye Bank Association of America.

La Tabla de materiales enumera los suministros y equipos. El material complementario 1 proporciona una visión general de la disección, la fotografía de fondo de ojo en color y el MMI basado en OCT. El material complementario 2 proporciona detalles del MMI basado en PTU.

1. Criterios para la recogida de tejidos

1. Para maximizar el rendimiento de los ojos de DMAE en una pantalla de donantes indocumentados, establezca los siguientes criterios para donantes aceptables: edad ≥80 años, blanco, no diabético y ≤6 h de muerte a preservación (DtoP).
   NOTA: DtoP se define como el tiempo entre la muerte y cuando el ojo se coloca en un conservante provisto, ya sea en el hospital o en el laboratorio.

2. Medio de conservación y otros preparados (laboratorio)

1. Hacer paraformaldehído tamponado con fosfato al 4% a partir de existencias al 20% (compradas). Prepare 1 L agregando 200 ml de paraformaldehído al 20% (factor de dilución de 5) a 800 ml de tampón fosfato de Sorenson 0.1 M. Pruebe y ajuste para asegurarse de que el pH sea 7.2, si es necesario. Conservar a 4 °C.
2. Dispense 30 ml de paraformaldehído tamponado con fosfato al 4% en frascos de 40 ml.
3. Envases de 40 ml de conservante etiquetados en el banco de ojos para que el tejido se pueda recuperar en cualquier momento y en cualquier día.
4. Para el almacenamiento de ojos preservados, haga paraformaldehído al 1% de la solución al 4%. Prepare 1 L agregando 250 ml de paraformaldehído al 4% (factor de dilución de 4) a 750 ml de tampón fosfato de Sorenson 0.1 M. Pruebe y ajuste el pH si es necesario. Conservar a 4 °C.
   1. Preparar 1 L de una solución 0,1 M de la solución 0,2 M del tampón fosfato de Sorenson, pH 7,2, combinando 500 ml de agua destilada y 500 ml de tampón de Sorenson.
   2. Ajuste el pH gota a gota usando ácido clorhídrico 1 N o hidróxido de sodio 1 N. Conservar a 4 °C.
5. Cree un soporte para estabilizar los ojos durante la disección. Llene una placa de Petri con cera dental calentada hasta que esté líquida. Cuando esté ligeramente frío, haga una impresión hemisférica en él con un rodamiento de bolas grande y luego congele el plato para facilitar la extracción del rodamiento de bolas.

3. Métodos de banco de ojos

1. Para garantizar la rápida recuperación de los tejidos de investigación, recuperar rápidamente todos los tejidos, incluidos los destinados al trasplante.
2. Reciba referencias de muerte, según lo exige la ley, dentro de 1 h de la muerte, y haga un seguimiento de cada donante con un número de secuencia de referencia que siga el tejido.
3. Para encontrar casos con documentación clínica potencial, haga preguntas específicas sobre DMAE y enfermedades oculares en la entrevista de evaluación de riesgos del donante.
4. Para minimizar el tiempo de viaje, recupere globos enteros (a diferencia de solo córneas para trasplante) dentro de un área compacta (es decir, ciudad y condado suburbano adyacente).
5. Lleve dos frascos de conservante (paraformaldehído tamponado al 4%) a la habitación del hospital del difunto para la recuperación del tejido (en lugar de esperar a que el cuerpo sea trasladado a una morgue).
6. Antes y durante la recuperación, comuníquese con los investigadores para confirmar el parto y el momento.
7. Recupere los globos in situ en el hospital, ábralos mediante métodos de manipulación consistentes y sumerja el ojo abierto en conservante (Figura 1).
   1. Mantenga el ojo del donante extirpado en su lugar con una funda de gasa estabilizada por un hemostático.
   2. Para facilitar la extracción de la córnea con un borde de esclerótica de 2 mm de ancho, use un trepano de 18 mm de diámetro para marcar el globo.
   3. Para liberar la córnea con un borde acompañante de esclerótica, corte a lo largo del círculo marcado con tijeras accionadas por resorte con puntas curvas mientras estabiliza el globo con la gasa hemostática recortada.
   4. Levante la córnea de la esclerótica, exponiendo el iris y el cuerpo ciliar.
   5. Para facilitar la penetración del conservante en la cámara vítrea, haga una hendidura de 2 mm de largo en el iris perpendicular al margen pupilar. Colocar los ojos en frascos de muestras con 30 ml de conservante a 4 °C y transferirlos al laboratorio sobre hielo húmedo.
8. Transmita electrónicamente la información del donante anónimo desde el banco de ojos a la base de datos del laboratorio de investigación.
   NOTA: La base de datos mantiene el número de referencia, el número de tejido del banco de ojos y el número de identificación del laboratorio para el seguimiento, además de otra información relevante.

4. Preparación del tejido para fotografía de fondo de ojo en color ex vivo

1. Utilice dos microscopios estéreo, uno para la disección y otro para la fotografía de fondo de ojo en color.
   NOTA: Para que la transiluminación visualice los cambios pigmentarios, utilice una base para microscopía de campo oscuro.
2. Retire los restos del segmento anterior (iris y cristalino). Para estabilizar el ojo durante la disección, colóquelo en la placa de Petri llena de cera (Material suplementario 1, diapositivas 7-8). Para evitar que el cuerpo ciliar y la retina unida colapsen en la cavidad vítrea, minimice la perturbación del anillo de vítreo grueso unido al cuerpo ciliar (base vítrea).
3. Marque el poste superior para orientación. Coloque el globo con el lado anterior hacia abajo en el plato. Encuentra los tendones de inserción del recto superior y los músculos oblicuos superiores. Usando un aplicador de madera, aplique con moderación una tinta de marcado en una línea de 10 mm en dirección anterior a posterior (es decir, perpendicular a la inserción tendinosa del músculo recto superior).
4. Antes de la fotografía, llene el fondo de ojo con el tampón de fosfato frío de Sorensen.
5. Inserte una cuenta de rubí de 1 mm en el fondo de ojo como una barra de escala interna para que aparezca en cada imagen²⁷.
6. Adquiera imágenes en color con una cámara réflex de lente única montada en un microscopio estéreo equipado con un flash de anillo. Utilice iluminación trans, epi y flash en cada uno de los tres aumentos estándar para capturar imágenes destinadas a resaltar áreas específicas (Material Suplementario 1, diapositiva 11): 1) el fondo de ojo hasta el ecuador, 2) el polo posterior (arcadas vasculares, cabeza del nervio óptico, fóvea) y 3) la fóvea dentro de la mácula lútea (mancha amarilla).

5. Preparación para la fotografía de fondo de ojo en color ex vivo

1. Encienda la cámara y el monitor. Conecte el obturador remoto y suelte el actuador en el monitor de la cámara/televisión (TV) de la interfaz multimedia de alta definición (HDMI) y en el cable de visualización.
2. Ajuste la configuración de la cámara a la función ISO manual y la posición de bloqueo del espejo (bloqueada en su lugar para reducir la vibración).
   NOTA: Consulte el manual del usuario del fabricante para conocer los ajustes de la cámara utilizada. Aprenda de la pantalla de la cámara los ajustes de sobreexposición o subexposición relativos al histograma y las lecturas de exposición.
3. Coloque dos fuentes de luz, cada una con dos guías de luz flexibles colocadas perpendiculares entre sí, para la iluminación en las cuatro direcciones cardinales en la etapa del microscopio (Material suplementario 1, página 10).
4. Encienda las fuentes de luz de epiiluminación a plena potencia.
   NOTA: Es útil pero no necesario tener un sudario de fieltro negro alrededor del escenario para limitar la dispersión de luz / flash para el fotógrafo.
5. En el microscopio de disección, use fórceps para insertar el polo posterior en un crisol de cuarzo de 30 ml lleno de tampón. Permita que el tejido se hunda hasta el fondo. Inserte un aparato ortopédico, como una esponja de tejido, entre el ojo y la pared del crisol para evitar el movimiento. Inserte la cuenta de rubí de 1 mm en el polo posterior.
   NOTA: La cuenta puede caer en la copa del nervio óptico.
6. Coloque cuidadosamente el globo en el crisol sobre la platina del microscopio estereoscópico y observe el fondo ocular interior a través de los oculares del microscopio. Usando el aumento más bajo, oriente el ojo identificando la marca de tejido en la posición de las 12 en punto, la cabeza del nervio óptico (ONH) y la fóvea 5 ° por debajo de la ONH. Gire el ojo para que la fóvea caiga por debajo de una línea a través de la ONH en 5°.
   NOTA: Si se trata de un ojo derecho, la ONH está a la derecha de la fóvea, como se ve a través de los oculares del microscopio. Si es un ojo izquierdo, la ONH está a la izquierda de la fóvea.
7. Encienda la visualización del monitor remoto desde la cámara. Asegúrese de que el control deslizante del divisor de haz del microscopio esté configurado para observar a través del puerto de fotos y no a través del puerto para los oculares. Dependiendo de la trayectoria de la luz y el espejo, prepárese para girar el tejido 180° en el escenario para una orientación adecuada.

6. Adquisición de imágenes mediante fotografía de fondo de ojo en color ex vivo

1. Con la epiiluminación encendida, ajuste el aumento de modo que toda la incisión trefina de 18 mm ocupe todo el campo de visión. Aumente el aumento para que sea posible enfocar el fondo del hoyo foveal. Reduzca la ampliación a la configuración anterior.
2. Ajuste la configuración ISO en el rango de 1,600-3,000 para que los tiempos de exposición caigan en el rango central del medidor en la cámara.
3. Pulse el disparador del obturador remoto. Escuche que el espejo se bloquee en la posición hacia arriba. Presione el gatillo nuevamente para la exposición.
4. Observe la imagen en el monitor, con los metadatos preestablecidos que muestran rojo, verde, azul (RGB) y un histograma de color para la exposición correcta. Si la exposición es aceptable, proceda; Si no es así, elimine, vuelva a evaluar los parámetros y vuelva a crear una imagen.
5. Apague las luces de cuello de cisne para la epiiluminación para resaltar las drusas, y encienda el flash, con una exposición de 1/4 s, una velocidad de obturación de la cámara de 1/250 s y un ISO de 100-320. Ajuste la velocidad del flash a la predeterminada o modifíquela durante la configuración inicial de la cámara. Adquiera una imagen y verifique el histograma para la exposición adecuada.
6. Apague el flash y encienda la fuente de luz de transiluminación. Restablezca el ISO por encima de 5.000 y asegúrese de que el tiempo de exposición no baje de 1/30 s debido a la posible vibración en el sistema fotográfico. Adquiera una imagen y verifique el histograma para la exposición adecuada.
7. Aumente el aumento para ver tanto la ONH como la fóvea en el campo de visión. Encienda las lámparas de epiiluminación. Establezca el rango ISO en 1.600-3.000. Asegúrese de que los tiempos de exposición caigan en el rango central de la cámara.
8. Apague las luces de epiiluminación y encienda el flash, con una exposición de 1/4 s, la velocidad de obturación de la cámara preestablecida en 1/250 s y el ISO ajustado en 400-800. Adquiera una imagen y verifique el histograma para la exposición adecuada.
9. Apague el flash y encienda la transiluminación utilizando la base de campo oscuro. Restablezca el ISO por encima de 5.000. Asegúrese de que el tiempo de exposición no sea inferior a 1/30 s debido a la vibración potencial en el sistema fotográfico. Adquiera una imagen y verifique un histograma adecuado.
10. Apague la transiluminación y vuelva a encender las lámparas de epiiluminación.
11. Aumente el aumento al utilizado en el paso 6.7. Vuelva a enfocarse si es necesario.
12. Aumente el ISO dentro del rango de 3,000-6,000 y ajuste el tiempo de exposición para que caiga dentro del rango de exposición adecuado de la cámara. Adquirir una imagen.
    NOTA: Es posible que la cuenta de rubí ya no aparezca en el campo de visión. Si es así, capture imágenes separadas de la cuenta en este aumento como referencia.
13. Apague las lámparas de epiiluminación. Encienda el flash con una exposición de 1/4 s y con la velocidad de obturación de la cámara a 1/250 s. Ajuste la velocidad del flash a la predeterminada, o cámbiela durante la configuración inicial de la cámara, y establezca el ISO en 500-1,000. Adquiere la imagen. Compruebe el histograma para la exposición adecuada.
14. Apague el flash y encienda las luces de transiluminación. Restablezca el ISO por encima de 8.000 para permitir un tiempo de exposición más rápido con un sensor de imagen más sensible. Asegúrese de que el tiempo de exposición no sea inferior a 1/30 s debido a la vibración potencial en el sistema fotográfico. Adquirir una imagen.
15. Exporte las imágenes de la cámara a un ordenador. Revise las imágenes antes de retirar la muestra de la etapa de microscopio en caso de que sea necesario capturar algunas nuevamente.

7. Descripción general de la adquisición de imágenes para OCT ex vivo y oftalmoscopia láser de barrido (SLO)

1. Para OCT de dominio espectral, coloque los globos en tampón fosfato en un soporte ocular personalizado con una cámara con una lente de 60 dioptrías³⁵. Monte el soporte del ojo en un soporte en un dispositivo de imágenes de OCT clínica y colóquelo donde el paciente apoyaría su frente. El dispositivo OCT inserta automáticamente una barra de escala en cada imagen.
2. Al mismo tiempo, utilizando el mismo dispositivo y con el ojo todavía en el soporte, obtenga una imagen de los globos con un oftalmoscopio láser de barrido (SLO) utilizando reflectancia infrarroja cercana (NIR, utilizada como imagen localizadora por el software permanente), autofluorescencia del fondo de ojo de excitación (FAF) de 488 nm y reflectancia libre de rojo (RF).
   NOTA: El FAF de excitación de 787 nm en este dispositivo solo es adecuado ocasionalmente porque un divisor de haz reduce la transmitancia de luz al SLO. Por esta razón, se utiliza un segundo dispositivo para imágenes FAF de 787 nm (ver siguiente punto).
3. Por separado, pero con el ojo todavía en el soporte del ojo, tome una imagen de los globos con FAF de 787 nm para detectar la perturbación del EPR³⁶ utilizando un dispositivo separado que muestre bien esta modalidad.

8. Protocolo de adquisición de imágenes para OCT/SLO ex vivo (ver diapositivas en Material complementario 2)

1. Indique el músculo recto superior con tinte de marcado tisular. Encienda el láser (flecha azul, Material suplementario 2, página 1).
2. Haciendo referencia a la página 2 del material complementario 2, coloque el cabezal OCT moviendo toda la unidad en dos ejes con respecto a la base (flecha verde) y luego elevando la altura (y) girando el joystick en el sentido de las agujas del reloj/antihorario (cw/ccw, flechas azules). Enfoque la imagen girando la perilla (flecha naranja), con la palanca negra en la posición R (*). Bloquee la unidad asegurando el tornillo del pulgar (flecha púrpura).
3. Inserte el ojo en el soporte y estabilícelo desde la cara posterior con espaciadores (Material suplementario 1, página 13). Ejerza la menor presión posible para evitar abollar la esclerótica. Oriente con la marca de tejido para el músculo recto superior hacia arriba.
   NOTA: La distancia aproximada desde la parte frontal del portaojos hasta el dispositivo OCT es de 25 mm.
4. Abra el software de visualización y análisis patentado para el dispositivo OCT. Aparecerá una lista de pacientes en la columna izquierda. Los donantes de ojos indexados por un número de código interno son los "pacientes". Consulte el manual del usuario del fabricante.
5. Seleccione el icono Nuevo paciente . Complete la información de datos del paciente según sea necesario. Seleccione Aceptar. Utilice un sistema de numeración ordenado lógicamente para ojos individuales, como AAAAYNNNL,R_agesex. Por ejemplo, esto podría ser 2017016R_97F.
6. Después de continuar con la entrada de datos en la siguiente ventana, presione OK. Seleccione el operador y estudie en el menú desplegable.
   NOTA: La información introducida aparecerá en los metadatos exportables.
7. Después de ver una pantalla en blanco, toque el botón amarillo para iniciar la adquisición de la imagen.
8. Presione IR + OCT (reflectancia infrarroja cercana + OCT). Permita que el láser adquiera una imagen SLO en vivo del fondo de ojo y OCT B-scan.
   1. Finalice la posición anatómica correcta en función de la ONH y la fóvea, y utilice un aplicador de madera para ajustar la posición de los ojos en el soporte. En el panel de control, gire el botón redondo negro para ajustar la intensidad.
   2. Presione el mismo botón para promediar 9-100 cuadros (flechas rojas; 9 es suficiente, 100 se ve cremoso). Si la unidad está orientada correctamente, el fondo de ojo debe estar enfocado y el escaneo B de OCT debe aparecer en el tercio superior de la pantalla (Material complementario 2, página 9, flecha roja doble).
   3. En la imagen del fondo de ojo, use el cursor para mover la línea azul para centrar la fóvea (Material complementario 2, página 9, flecha blanca). Presione Adquirir.
      NOTA: Otros botones predeterminados son Retina, EDI (desactivado) y Escaneo de línea.
9. Presione RF + OCT para la próxima adquisición. Vuelva a comprobar la posición para asegurarse de que la imagen no se ha movido o degradado. Presione el botón negro para promediar. Presione Adquirir.
10. Cambie el cubo interno para obtener imágenes de autofluorescencia a las longitudes de onda de excitación de 488 nm y 787 nm (Material complementario 2, página 10).
    NOTA: Se muestra la posición del cubo después del interruptor.
11. Seleccione Modo de autofluorescencia . Vuelva a comprobar la alineación. Presione Adquirir.
12. Para casos sospechosos de alteración y atrofia del EPR, seleccione ICGA (angiografía verde de indocianina) para autofluorescencia de 787 nm. Vuelva a comprobar la posición de los ojos y, a continuación, presione Adquirir.
    NOTA: Una imagen de fondo de ojo a menudo no aparece en esta modalidad porque el cubo interno atenúa el haz.
13. Vuelva a cambiar el cubo interno a R para IR e imágenes sin rojo para la adquisición de volumen.
    NOTA: La posición del cubo después del interruptor se muestra en la página 13 del Material complementario 2.
14. Para adquirir los volúmenes de OCT, seleccione IR y la configuración del volumen. Haga coincidir todos los ajustes de la página 14 del Material complementario 2 alternando los botones apropiados en el módulo de control (cubo de mácula de 30°, espaciado de 30 μm, promedio según los requisitos experimentales).
15. Observe que la vista del fondo de ojo de reflectancia del infrarrojo cercano está cubierta de líneas azules de escaneo B. Vuelva a comprobar la posición de la OCT en el tercio superior de la ventana derecha. Presione Adquirir en el módulo de control y espere 5 minutos para que se complete el escaneo de volumen. Cuando se complete la adquisición de imágenes, seleccione SALIR. Las imágenes se guardarán (flecha roja).
    NOTA: Las líneas azules delimitan las distancias mostradas en la vista anterior en micrómetros. Los escaneos comienzan a numerarse desde la parte inferior (inferior) y continúan hacia arriba. Tenga en cuenta la progresión de la línea roja.
16. Permita que la computadora procese las imágenes adquiridas, que aparecerán en la pantalla (Material complementario 2, página 16).
17. Cuando obtenga imágenes de los ojos de un donante, no cambie la posición del soporte de montaje entre los ojos. Si primero se toma una imagen del ojo izquierdo, los resultados se mostrarán en la columna OD (ojo derecho). Haga clic con el botón secundario para seleccionar todas las imágenes y, a continuación, seleccione Exchange OS/OD. Las imágenes cambiarán a la columna del sistema operativo.
18. Pulse Seleccionar ventana > > base de datos. La pantalla predeterminada es el panel 6 con la adición del ojo donante fotografiado en la columna derecha (Material complementario 2, página 18). Haga clic derecho en el paciente en el menú desplegable, elija Lote y exporte el archivo E2E.
19. Vaya a la carpeta predeterminada creada en el escritorio para las transferencias de archivos. Seleccione Aceptar. La carpeta contiene los archivos E2E que se copiarán en un disco duro externo y se archivarán.
20. Lleve el ojo en su soporte al oftalmoscopio láser de escaneo, que se utiliza principalmente para la autofluorescencia de 787 nm.
    NOTA: consulte la guía del usuario del fabricante para la adquisición y el archivo de las imágenes.
21. Encienda la computadora y el láser.
22. Seleccione el icono Nuevo paciente . Complete los datos del paciente según sea necesario.
23. Para mantener la misma hoja de datos del ojo, pulse OK. Como la curva C permanece igual, pulse Continuar.
24. Seleccione Modo de estudio e introduzca la contraseña si es necesario. Mantenga la curva C en 7,7 mm. Pulse Aceptar.
25. Seleccione Continuar para verificar la curva C. Seleccione el indicador amarillo para iniciar la cámara.
26. Seleccione la posición R . Alinear y orientar el globo. Seleccione el modo IR para enfocar y orientar como se indica arriba.
27. Oriente el cabezal de la cámara moviendo toda la unidad en dos ejes con respecto a la base (Material suplementario 2, página 28, flecha verde) y luego elevando la altura (y) de la unidad (flechas azules). Enfoca la imagen girando la perilla (flecha naranja). La palanca negra está en la posición R (*). Después de que este cabezal esté en posición, bloquee la unidad girando el tornillo del pulgar (flecha púrpura).
28. Obsérvese que la pantalla aparece como se muestra en la página 29 del Material complementario 2.
29. Mueva la perilla selectora de R a A. Seleccione ICGA (para lograr una autofluorescencia de 787 nm) en azul, intensidad del 100%, un campo de visión de 30° e imágenes monofásicas.
    NOTA: Al igual que el colorante verde indocianina, la melanina es excitada por la luz de longitud de onda de 787 nm.
30. Obsérvese que la pantalla aparece como se muestra en la página 31 del Material Suplementario 2. Presione el disco negro para promediar y, a continuación, seleccione Adquirir.
31. Elija Windows > Database. Seleccione Importar archivos E2E desde el dispositivo SLO; Estos archivos se almacenan en un disco duro externo y se cargan en el escritorio.
32. Seleccione Abrir. Compruebe que las marcas son las predeterminadas y seleccione Aceptar.
33. Tenga en cuenta que el paciente ahora tiene dos pestañas: una que muestra las imágenes adquiridas del SLO (flecha azul) y la otra pestaña que muestra las imágenes adquiridas del dispositivo OCT (flecha roja) (Material complementario 2, página 34).
34. Haga clic con el botón derecho en la imagen de 786 nm (ICGA) y exporte la imagen a un archivo etiquetado como SLO 786 en el escritorio.
35. Para guardar la imagen SLO de autofluorescencia de 786 nm, seleccione el paciente y haga clic con el botón derecho para exportar imágenes como archivos RAW (para archivos .vol) a una carpeta del escritorio.
36. Para exportar imágenes desde el dispositivo OCT para transferirlas al equipo de archivo, copie y pegue desde RAWEXPORT a una carpeta etiquetada como RAW.

9. Revisión de imágenes

1. Reúna las imágenes (color, archivo .vol, imágenes SLO) en carpetas para cada donante con subcarpetas para cada ojo e indexe las carpetas consecutivamente por ID de laboratorio.
2. Registre las impresiones de tejido (calidad, patología) en una base de datos para un informe estandarizado.
3. Revise los volúmenes de OCT exportados con un complemento interno de ImageJ.
   1. Encuentra el centro de fóvea, que se puede reconocer por el centro de la inmersión foveal, el aumento hacia adentro de las bandas retinianas externas o el punto más delgado. En la mayoría de los casos, estos coincidirán, pero no siempre, ya que esto depende de la preservación foveal, la variabilidad individual y la presencia de patología.
   2. Encuentre una exploración estándar en la perifóvea superior (2 mm/67 exploraciones B de distancia en la dirección superior; es decir, aumentando el número de exploraciones).
   3. Guarde una pila .tif de todo el volumen para una referencia rápida en el futuro.
   4. Desplácese por el volumen de OCT en su totalidad, comenzando desde el escaneo 1 (inferior), mientras registra los números de escaneo en los que se reconocen las características.
   5. Revise el área peripapilar además de la mácula.
      NOTA: La atrofia coriorretiniana peripapilar en ojos más viejos incluye un depósito laminar basal distintivo y neovascularización. Esta es un área común de cambio pigmentario en los ojos miopes y el glaucoma, así como en el envejecimiento y la DMAE³⁷.
4. Inspeccione las fotografías en color y vincule cualquier hallazgo con los vistos por OCT si es posible.
   NOTA: En general, es más fácil ver primero la mayoría de los hallazgos de la OCT. Las fotografías en color proporcionan una gran vista del área fuera del área en el SLO, la pigmentación coroidea que incluye nevos, la presencia de hemo y exudados duros, y el pigmento negro en la DMAE neovascular. El pigmento oscuro en la fóvea puede representar melanosomas sueltos del segmento anterior y debe lavarse suavemente con tampón usando una pipeta.
5. Inspeccione las imágenes de SLO y vincule cualquier hallazgo con los vistos por OCT si es posible.
6. Guarde las exploraciones B estándar en la fóvea y la perifóvea, las exploraciones B adicionales con patología notable u otras características, y las imágenes SLO en un informe de patología.
7. Clasifique los ojos de la siguiente manera: No notable, Cuestionable, DMAE temprana-intermedia, DMAE atrófica, DMAE neovascular, Otro, Desconocido, No graduable, No registrado. "Cuestionable" se usa si no está claro si los cambios son lo suficientemente graves como para otra categorización. "No graduable" se reserva para los ojos que carecen de exploraciones OCT útiles, como aquellos con retinas severamente desprendidas. "No grabado" está reservado para los ojos que se procesan inmediatamente después de recibirlos sin fotografía.
8. Utilice estos criterios para la DMAE: cambio grave del EPR con depósitos drusos o drusas subretinianas, con o sin signos de neovascularización, como líquido o fibrosis, y sin evidencia de otras causas (actualizado de Curcio et ^al.10 para acomodar SDD).
   NOTA: El diagnóstico final se confirma mediante análisis histológico.

Resultados

La Tabla 1 muestra que durante 2016-2017, se recuperaron 184 ojos de 94 donantes blancos no diabéticos >80 años de edad. El tiempo medio de muerte a la preservación fue de 3,9 h (rango: 2,0-6,4 h). De los 184 ojos revisados, 75 (40,2%) tenían cierta DMAE. Se identificaron las siguientes categorías: No notable (39,7%), Cuestionable (11,4%), DMAE intermedia temprana (22,8%), atrófica (7,6%), Neovascular (9,8%), Otros (8,7%) y Desconocido/No registrado/No clasificable (<1%). La Fi...

Discusión

Utilizando un enfoque de detección basado en la población durante un período de 16 meses en la era pre-COVID, fue posible adquirir 75 ojos de donantes con DMAE. Todos fueron recuperados con un DtoP corto y escalonados usando MMI anclado en OCT. El criterio de edad (>80 años) está fuera del rango de edad típico para las recuperaciones de tejidos destinadas a córneas trasplantables. A pesar de la edad avanzada, nuestros criterios dieron como resultado ojos en todas las etapas de la DMAE. Muchos fenotipos de EPR son ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12