Ex Vivo (생체 외 ) 연령 관련 황반변성 연구를 위한 인간 기증자 눈의 OCT 기반 다중 모드 이미징

요약

실험실 분석은 연령 관련 황반변성(AMD)의 종방향 광간섭 단층촬영(OCT) 기반 다중 모드 영상의 예후 가치를 활용할 수 있습니다. AMD가 있거나 없는 인간 기증자의 눈은 조직 절편 전에 OCT, 색상, 근적외선 반사율 스캐닝 레이저 검안경 및 자가형광을 사용하여 이미지화됩니다.

초록

광간섭 단층촬영(OCT) 기반 멀티모달(MMI) 임상 영상에서 학습한 연령 관련 황반변성(AMD)의 진행 순서는 실험실 소견에 예후 가치를 더할 수 있습니다. 이 작업에서는 망막 조직 절편 전에 생체 외 OCT와 MMI를 인간 기증자의 눈에 적용했습니다. 눈은 ≥80세의 비당뇨병 백인 기증자로부터 회복되었으며 사망 후 보존 시간(DtoP)은 ≤6시간이었습니다. 글로브는 현장에서 회수되어 각막 제거를 용이하게 하기 위해 18mm 트레핀으로 점수를 매기고 완충된 4% 파라포름알데히드에 담갔습니다. 컬러 안저 이미지는 해부 스코프와 SLR 카메라로 전방 분절 제거 후 3배율에서 트랜스, 에피 및 플래시 조명을 사용하여 획득했습니다. 글로브는 60 디옵터 렌즈가 있는 맞춤형으로 설계된 챔버 내의 버퍼에 배치되었습니다. 스펙트럼 도메인 OCT(30° 황반 큐브, 30μm 간격, 평균 = 25), 근적외선 반사율, 488nm 자가형광 및 787nm 자가형광으로 이미지화되었습니다. AMD 눈은 신생혈관 형성 유무에 관계없이 다른 원인의 증거 없이 드루젠 또는 망막하 드루세노이드 침착물(SDD)이 있는 망막 색소 상피(RPE)의 변화를 보여주었습니다. 2016 년 6 월과 2017 년 9 월 사이에 94 개의 오른쪽 눈과 90 개의 왼쪽 눈이 회복되었습니다 (DtoP : 3.9 ± 1.0 h). 184개의 눈 중 40.2%가 초기 중등도(22.8%), 위축성(7.6%), 신생혈관성(9.8%) AMD를 포함하여 AMD를 가지고 있었고 39.7%는 눈에 띄지 않는 황반을 가지고 있었습니다. Drusen, SDD, 과반사 병소, 위축 및 섬유혈관 흉터는 OCT를 사용하여 확인되었습니다. 인공물에는 조직 혼탁, 박리(간균, 망막, RPE, 맥락막), 중심와 낭성 변화, 기복이 있는 RPE 및 기계적 손상이 포함되었습니다. 냉동 절편을 안내하기 위해 OCT 부피를 사용하여 중심와 및 시신경두 랜드마크와 특정 병리를 찾았습니다. 생체 외 부피는 시선 추적을 위한 기준 기능을 선택하여 생체 내 부피에 등록되었습니다. 생체 내에서 볼 수 있는 병리학의 생체 외 가시성은 보존 품질에 따라 다릅니다. 16개월 이내에 AMD의 모든 단계에서 75개의 신속한 DtoP 기증자 안구를 회복하고 임상 MMI 방법을 사용하여 병기를 결정했습니다.

서문

광간섭 단층촬영(OCT)의 지도 하에 항-VEGF 요법으로 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)을 관리한 15년은 시력 상실의 만연한 원인의 진행 순서와 미세 구조에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. 주요 인식은 AMD가 신경 감각 망막, 망막 색소 상피(RPE) 및 맥락막과 관련된 3차원 질환이라는 것입니다. 시험 환자와 치료받은 클리닉 환자의 동료 눈에 대한 OCT 영상의 결과, 수십 년 동안 임상 표준이었던 컬러 안저 사진에서 볼 수 있는 것 이상의 병리학적 특징이 이제 인식되고 있습니다. 여기에는 망막내 혈관신생(제3형 황반^혈관신생1, 이전의 혈관종성 증식), 망막하 드루세노이드 침착물(SDD, 망상 슈도드루젠이라고도 함)², RPE 운명의 다중 경로^3,4, 위축의 강렬한 신경교 뮐러 세포 ^5,6.

황반(세포 및 동물)이 결여된 모델 시스템은 이 복잡한 질병의 일부 조각을 재현한다 ^7,8,9. AMD의 부담을 개선하는 데 있어 더 큰 성공은 인간의 눈에서 원발성 병리를 발견하고 탐구하고, 황반의 독특한 세포 구성을 이해한 다음, 모델 시스템으로의 번역에서 비롯될 수 있습니다. 이 보고서는 학술 연구실과 안구 은행 간의 3 년간의 협력을 묘사합니다. 본원에 기술된 조직 특성화 방법의 목표는 두 가지이다: 1) 현미경으로 안저 모양 및 이미징 신호 소스의 기초를 입증함으로써 진화하는 진단 기술을 알리고, 2) 원뿔 전용 중심와 및 간상체가 풍부한 포와를 보존하는 표적(면역조직화학) 및 비표적 분자 발견 기술(이미징 질량 분석법, IMS 및 공간 전사체학)에 대해 AMD 표본을 분류합니다. 이러한 연구는 시선 추적을 통해 진행 순서와 종단 추적이 가능한 임상 OCT로의 번역을 가속화할 수 있습니다. 치료 효과를 모니터링하도록 설계된 이 기술은 망막 혈관을 사용하여 한 클리닉 방문에서 다음 클리닉 방문까지 스캔을 등록합니다. 눈 추적 OCT를 파괴적인 기술로 얻은 실험실 결과와 연결하면 분자 발견에 새로운 수준의 예후 가치를 제공할 수 있습니다.

1993 년 연구소는 필름¹⁰에 사후 안저의 컬러 사진을 캡처했습니다. 이러한 노력은 Foos와 동료 11,12,13에 의한 인간 말초 망막의 뛰어난 광현미경 및 조직학과 Sarks et ^al.14,15에 의한 광범위한 AMD 임상병리학적 상관관계에서 영감을 받았습니다. 2009년부터 스펙트럼 도메인 OCT에 고정된 생체 외 다중 모드 이미징(MMI)이 채택되었습니다. 이러한 전환은 다른 사람들의 유사한 노력에서 영감을 받았습니다.^16,17 특히 Sarks가 묘사한 미세 구조의 많은 부분이 시간이 지남에 따라 클리닉^18,19에서 3차원으로 이용 가능하다는 사실을 깨달았습니다^. 목표는 망막, RPE 및 맥락막의 세포 수준 표현형에 대한 강력한 연구를 위해 합리적인 시간 내에 황반이 부착된 눈을 획득하는 것이었습니다. 그 의도는 "눈당" 통계를 넘어 심혈관 질환^20,21의 "취약한 플라크" 개념의 영향을 받는 표준인 "병변 유형별"로 이동하는 것이었습니다.

이 보고서의 프로토콜은 여러 스트림에서 거의 400쌍의 기증자 안구에 대한 경험을 반영합니다. 2011-2014년에 142개의 보관된 표본의 층 두께와 주석을 포함하는 AMD 조직병리학의 Project MACULA 웹사이트가 만들어졌습니다. 이 눈은 1996년부터 2012년까지 고해상도 에폭시 수지 조직학 및 전자 현미경을 위한 글루타르알데히드-파라포름알데히드 고정액으로 보존되었습니다. 모든 fundi는 받았을 때 컬러로 촬영되었으며 조직학 직전에 OCT에 의해 다시 이미지화되었습니다. 원래 시신경 연구⁽²²)를 위해 설계된 아이 홀더는 중심와 중앙에 있는 8mm 직경의 전층 조직 펀치를 수용하는 데 사용되었습니다. 중심와 중심와를 통한 OCT B-스캔과 동일한 수준의 조직학에 해당하는 2mm 상부 부위와 컬러 안저 사진을 웹사이트에 업로드했습니다. OCT 평면의 선택은 fovea 23 하에서 AMD 병리의 두드러짐과 fovea^24,25보다 우수한 막대가 풍부한 영역에서 SDD의 두드러짐에 의해 결정되었습니다.

2013년부터 일생 동안 OCT 고정 MMI로 이미지화된 눈은 직접적인 임상병리학적 상관관계에 사용할 수 있었습니다. 대부분(기증자 10명 중 7명)은 망막 의뢰 진료(저자: KBF)에 있는 환자와 관련이 있으며, 연구 목적으로 사망 후 안구 기증에 관심이 있는 환자를 위한 고급 지침 레지스트리를 제공했습니다. 눈은 지역 안구 은행에 의해 회수 및 보존되어 실험실로 옮겨져 Project MACULA 눈과 동일한 방식으로 준비되었습니다. 사전 부검 임상 OCT 볼륨은 실험실에서 원활하게 판독되어 생애 동안 관찰된 병리학적 특징과 현미경에서 관찰된 특징을 일치시켰습니다²⁶.

2014년부터 전향적 안구 채취는 임상 병력이 없지만 정의된 기간(6시간) 동안 보존된 기증자 안구에서 AMD를 선별하는 것으로 시작되었습니다. 이를 위해 아이 홀더는 지구 전체를 수용 할 수 있도록 수정되었습니다. 이렇게 하면 이전에 사용된 8mm 펀치의 절단면 주위에서 분리될 가능성이 줄었습니다. 눈은 면역조직화학을 위해 4% 완충된 파라포름알데히드에 보존되었고 장기 보관을 위해 다음날 1%로 옮겨졌습니다. 2016-2017년(팬데믹 이전)에 90명의 기증자로부터 184개의 안구가 회복되었습니다. 이 보고서의 통계 및 이미지는 이 시리즈에서 생성됩니다. 팬데믹 시대(2020년 봉쇄 및 여파) 동안 전사체학 및 IMS 협업을 위한 전향적 수집은 본질적으로 2014년 방법을 사용하여 감소된 속도로 계속되었습니다.

기증자 눈 평가를 위한 다른 방법을 사용할 수 있습니다. MGS(Minnesota Grading System)^27,28는 안저 사진 촬영을 위한 AREDS 임상 시스템을 기반으로 합니다⁽²⁹). 이 방법의 한계는 위축성 AMD와 신생혈관성 AMD를 "후기 AMD"의 한 단계로 결합하는 것입니다. 또한, MGS는 RPE 맥락막의 광 문서화 전에 신경 감각 망막의 제거를 수반합니다. 이 단계는 SDD를 다양한 각도로 제거하고^(30,31) 외부 망막과 그 지지 시스템의 공간적 대응을 제거합니다. 따라서 대사 요구와 망막의 신호 전달을 RPE-맥락막의 병리학으로 연결하려는 노력이 방해받을 수 있습니다. 유타 시스템은 생체 외 컬러 사진과 OCT를 사용하여 MMI를 구현하여 해부 대상 눈을 RNA 및 단백질 추출을 위한 영역으로 분류했습니다³². 전체 아이컵 추출보다 바람직하지만, AMD 진행의 위험이 가장 높은 3mm 직경 영역(^33,34)은 6mm 직경의 중심와 중심 펀치의 25%에 불과합니다. 따라서, 면역조직화학을 위한 연속 절편과 같은 중심와와 관련하여 소견을 국소화할 수 있는 기술이 유리하다.

프로토콜

버밍엄에 있는 앨라배마 대학교의 기관 검토 위원회는 Good Laboratory Practices 및 Biosafety Level 2/2+를 준수하는 실험실 연구를 승인했습니다. 모든 미국 안구 은행은 2006년 통일 해부학적 선물법(Uniform Anatomical Gifts Act)과 미국 식품의약국(FDA)을 준수합니다. Advancing Sight Network를 포함한 대부분의 미국 안구 은행은 미국 안구 은행 협회(Eye Bank Association of America)의 의료 표준을 준수합니다.

재료 표에는 소모품과 장비가 나열되어 있습니다. 보충 자료 1은 해부, 안저 사진 및 OCT 기반 MMI에 대한 개요를 제공합니다. 보충 자료 2는 OCT 기반 MMI에 대한 세부 정보를 제공합니다.

1. 조직 채취 기준

1. 서류미비 기증자 선별검사에서 AMD 안구의 수율을 최대화하려면 허용 가능한 기증자에 대해 연령 ≥80세, 백인, 비당뇨병 환자, ≤6시간 사망 보존(DtoP) 기준을 설정하십시오.
   알림: DtoP는 사망 시점부터 병원이나 실험실에서 제공된 방부제에 눈을 넣는 시점까지의 시간으로 정의됩니다.

2. 보존 배지 및 기타 준비 (실험실)

1. 4 % 재고 (구매)에서 20 % 인산염 완충 파라 포름 알데히드를 만듭니다. 200 M Sorenson의 인산염 완충액 800 mL에 20 % 파라 포름 알데히드 (희석 계수 5)의 0.1 mL를 첨가하여 1 L를 준비한다. 필요한 경우 pH가 7.2가 되도록 테스트하고 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. 4% 인산염 완충 파라포름알데히드 30mL를 40mL 병에 분배합니다.
3. 안구 은행에 방부제 40mL 용기를 표시하여 언제 어디서나 조직을 회수할 수 있습니다.
4. 보존 된 눈을 보관하려면 4 % 용액에서 1 % 파라 포름 알데히드를 만드십시오. 1M Sorenson's phosphate buffer의 750mL에 4% 파라포름알데히드(희석 계수 4) 250mL를 첨가하여 0.1L를 준비합니다. 필요한 경우 pH를 테스트하고 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   1. 증류수 500mL와 Sorenson's 완충액 500mL를 혼합하여 Sorenson's phosphate buffer, pH 7.2의 0.2M 용액에서 0.1M 용액 1L를 준비합니다.
   2. 1 N 염산 또는 1 N 수산화나트륨을 사용하여 pH 강하를 적하합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
5. 해부하는 동안 눈을 안정시키는 홀더를 만듭니다. 액체가 될 때까지 가열 된 치과 용 왁스로 페트리 접시를 채 웁니다. 약간 차가울 때 큰 볼 베어링으로 반구 인상을 준 다음 볼 베어링을 쉽게 제거 할 수 있도록 접시를 얼립니다.

3. 안구 은행 방법

1. 연구 조직의 빠른 회복을 보장하려면 이식용 조직을 포함하여 모든 조직을 신속하게 회수하십시오.
2. 법에서 요구하는 대로 사망 후 1시간 이내에 사망 의뢰를 받고 조직 뒤에 오는 의뢰 순서 번호로 각 기증자를 추적합니다.
3. 잠재적인 임상 문서가 있는 사례를 찾으려면 연구 기증자 위험 평가 인터뷰에서 AMD 및 안과 질환 관련 질문을 하십시오.
4. 이동 시간을 최소화하려면 좁은 지역(예: 도시 및 인접 교외 카운티) 내에서 전체 지구본(이식용 각막만 구별됨)을 복구합니다.
5. 조직 회복을 위해 방부제 2병(완충된 4% 파라포름알데히드)을 고인의 병실로 가져옵니다(시신이 영안실로 옮겨지기를 기다리는 것과 반대).
6. 회복 전과 회복 중에 조사관과 의사 소통하여 전달 및 타이밍을 확인하십시오.
7. 병원 현장에서 지구본을 회수하고 일관된 취급 방법으로 개봉한 다음 열린 눈을 방부제에 담그십시오(그림 1).
   1. 지혈제로 안정화된 거즈 덮개를 사용하여 절제된 기증자의 눈을 제자리에 고정합니다.
   2. 2mm 너비의 공막 테두리로 각막을 쉽게 제거하려면 직경 18mm의 트레핀을 사용하여 지구본에 점수를 매깁니다.
   3. 공막 테두리가 있는 각막을 제거하려면 끝이 구부러진 스프링이 장착된 가위를 사용하여 득점된 원을 따라 자르고 지혈제로 잘린 거즈로 지구를 안정화합니다.
   4. 공막에서 각막을 들어 올려 홍채와 모양체를 노출시킵니다.
   5. 방부제가 유리체 챔버로 침투하는 것을 용이하게하기 위해, 홍채에 2mm 길이의 슬릿을 동공 가장자리에 수직으로 만듭니다. 4°C에서 방부제 30mL가 든 검체 용기에 눈을 넣고 젖은 얼음 위의 실험실로 옮깁니다.
8. 안구 은행에서 연구실 데이터베이스로 비식별화된 기증자 정보를 전자적으로 전송합니다.
   참고: 데이터베이스는 의뢰 번호, 안구 은행 조직 번호, 추적을 위한 실험실 ID 번호 및 기타 관련 정보를 유지합니다.

4. 생체 외 색소 안저 촬영을 위한 조직 준비

1. 두 개의 실체 현미경을 사용하는데, 하나는 해부용이고 다른 하나는 안저 사진용입니다.
   참고: 투과조명으로 색소 변화를 시각화하려면 암시야 현미경용 베이스를 사용하십시오.
2. 앞쪽 세그먼트 잔여 (홍채 및 수정체)를 제거하십시오. 해부하는 동안 눈을 안정시키려면 왁스로 채워진 페트리 접시에 넣으십시오(보충 자료 1, 슬라이드 7-8). 모양체와 부착된 망막이 유리체 내로 붕괴되는 것을 방지하기 위해, 모양체에 부착된 두꺼운 유리체의 고리(유리체 기저부)의 섭동을 최소화한다.
3. 방향을 위해 상위 극을 표시하십시오. 접시에 지구본을 앞쪽이 아래로 향하게 놓습니다. 상직근과 상사근의 삽입힘줄을 찾습니다. 나무 어플리케이터를 사용하여 앞쪽에서 뒤쪽 방향(즉, 상직근의 힘줄 삽입에 수직)으로 10mm 선으로 마킹 잉크를 조금씩 도포합니다.
4. 사진을 찍기 전에 차가운 Sorensen의 인산염 완충액으로 안저를 채 웁니다.
5. 1 mm 루비 비드를 내부 스케일 바로서 안저에 삽입하여 각 이미지(²⁷)에 나타나게 한다.
6. 링 플래시가 장착된 실체 현미경에 장착된 일안 반사식 카메라로 컬러 이미지를 획득합니다. 세 가지 표준 배율 각각에서 트랜스, 에피 및 플래시 조명을 사용하여 특정 영역을 강조하기 위한 이미지를 캡처합니다(보충 자료 1, 슬라이드 11): 1) 적도의 안저, 2) 후극(혈관 아케이드, 시신경두, 중심와), 3) 황반 내의 중심와(노란색 반점).

5. 생체 외 색소 안저 사진 촬영 준비

1. 카메라와 모니터를 켭니다. 리모트 셔터를 꽂고 HDMI(High-Definition Multimedia Interface) 카메라/TV(TV) 모니터 및 디스플레이 케이블에서 액추에이터를 분리합니다.
2. 카메라 설정을 수동 ISO 기능으로 설정하고 미러 잠금 위치(진동을 줄이기 위해 제자리에 고정됨)로 설정합니다.
   참고: 사용하는 카메라의 설정에 대해서는 제조업체의 사용 설명서를 참조하십시오. 카메라 디스플레이에서 히스토그램 및 노출 판독값을 기준으로 노출 과다/노출 부족 설정을 학습합니다.
3. 현미경 스테이지의 4개 기본 방향으로 조명을 비추기 위해 각각 서로 수직으로 배치된 두 개의 유연한 광 가이드가 있는 두 개의 광원을 배열합니다(보충 자료 1, 10페이지).
4. 에피 조명 광원을 최대 전력으로 켭니다.
   알림: 사진 작가의 빛/플래시 산란을 제한하기 위해 무대 주위에 검은색 펠트 덮개가 있는 것이 도움이 되지만 반드시 필요한 것은 아닙니다.
5. 해부 현미경에서 집게를 사용하여 버퍼로 채워진 30mL 석영 도가니에 후극을 삽입합니다. 조직이 바닥으로 가라앉도록 합니다. 움직임을 방지하기 위해 눈과 도가니 벽 사이에 티슈 스폰지와 같은 버팀대를 삽입합니다. 1mm 루비 비드를 뒤쪽 기둥에 삽입합니다.
   알림: 구슬이 시신경 컵에 떨어질 수 있습니다.
6. 도가니에 있는 지구본을 조심스럽게 실체 현미경 무대에 놓고 현미경 접안렌즈를 통해 내부 안저 안저를 관찰합니다. 가장 낮은 배율을 사용하여 12시 위치의 조직 표시, 시신경두(ONH) 및 ONH 아래 5°의 중심와를 식별하여 눈의 방향을 지정합니다. 중심와가 ONH를 통과하는 선 아래로 5° 떨어지도록 눈을 회전시킵니다.
   참고: 오른쪽 눈인 경우 ONH는 현미경의 접안렌즈를 통해 볼 수 있듯이 중심와 오른쪽에 있습니다. 왼쪽 눈이라면 ONH는 중심와의 왼쪽에 있습니다.
7. 카메라에서 보는 리모트 모니터를 켭니다. 현미경 빔 스플리터 슬라이더가 접안렌즈용 포트가 아닌 포토 포트를 통해 관찰하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 빛과 거울의 경로에 따라 적절한 방향을 위해 무대에서 티슈를 180° 회전할 준비를 하십시오.

6. 생체 외 컬러 안저 사진을 이용한 이미지 획득

1. 에피 조명이 켜진 상태에서 전체 18mm 트레핀 절개가 전체 시야를 차지하도록 배율을 설정합니다. 중심와 구덩이의 바닥에 초점을 맞출 수 있도록 배율을 높입니다. 배율을 이전 설정으로 줄입니다.
2. 노출 시간이 카메라 미터의 중앙 범위에 있도록 ISO 설정을 1,600-3,000 범위로 조정합니다.
3. 원격 셔터 트리거를 누릅니다. 거울이 위쪽 위치에 고정되도록 귀를 기울이십시오. 노출을 위해 방아쇠를 다시 누르십시오.
4. 올바른 노출을 위해 사전 설정된 메타데이터에 빨강, 녹색, 파랑(RGB) 및 색상 히스토그램을 표시하여 모니터에서 이미지를 관찰합니다. 노출이 허용되면 계속 진행하십시오. 그렇지 않은 경우 매개 변수를 삭제하고 다시 평가한 다음 이미지를 다시 지정합니다.
5. 에피 조명용 구즈넥 램프를 끄고 1/4초 노출, 1/250초의 카메라 셔터 속도, 100-320의 ISO로 플래시를 켭니다. 플래시 속도를 기본값으로 설정하거나 카메라 초기 설정 중에 수정하십시오. 이미지를 획득하고 히스토그램에서 적절한 노출을 확인합니다.
6. 플래시를 끄고 트랜스 일루미네이션 광원을 켭니다. ISO를 5,000 이상으로 재설정하고 사진 시스템의 잠재적인 진동으로 인해 노출 시간이 1/30초 미만으로 떨어지지 않도록 합니다. 이미지를 획득하고 히스토그램에서 적절한 노출을 확인합니다.
7. 배율을 높여 시야에서 ONH와 중심와를 모두 볼 수 있습니다. 에피 조명 램프를 켭니다. ISO 범위를 1,600-3,000으로 설정합니다. 노출 시간이 카메라의 중앙 범위에 있는지 확인하십시오.
8. 에피 일루미네이션 램프를 끄고 플래시를 켜서 노출을 1/4초, 카메라 셔터 속도를 1/250초로 설정하고 ISO를 400-800으로 설정합니다. 이미지를 획득하고 히스토그램에서 적절한 노출을 확인합니다.
9. 플래시를 끄고 암시야 베이스를 사용하여 트랜스 조명을 켭니다. ISO를 5,000 이상으로 재설정합니다. 노출 시간이 사진 시스템의 잠재적인 진동으로 인해 1/30초보다 느리지 않은지 확인하십시오. 이미지를 획득하고 적절한 히스토그램을 확인합니다.
10. 투과조명을 끄고 에피 일루미네이션 램프를 다시 켭니다.
11. 6.7단계에서 사용한 배율로 확대합니다. 필요한 경우 초점을 다시 맞춥니다.
12. ISO를 3,000-6,000 범위 내에서 높이고 카메라의 적절한 노출 범위 내에 있도록 노출 시간을 조정합니다. 이미지를 획득합니다.
    알림: 루비 비드가 더 이상 필드에 나타나지 않을 수 있습니다. 그렇다면 참조를 위해 이 배율에서 비드의 개별 이미지를 캡처합니다.
13. 에피 일루미네이션 램프를 끕니다. 노출을 1/4초로 설정하고 카메라 셔터 속도를 1/250초로 설정하여 플래시를 켭니다. 플래시 속도를 기본값으로 설정하거나 카메라 초기 설정 중에 변경하고 ISO를 500-1,000으로 설정합니다. 이미지를 획득합니다. 적절한 노출을 위해 히스토그램을 확인하십시오.
14. 플래시를 끄고 트랜스 일루미네이션 램프를 켭니다. ISO를 8,000 이상으로 재설정하면 더 민감한 이미지 센서로 더 빠른 노출 시간을 얻을 수 있습니다. 사진 시스템의 잠재적인 진동으로 인해 노출 시간이 1/30초 미만으로 떨어지지 않도록 하십시오. 이미지를 획득합니다.
15. 카메라에서 컴퓨터로 이미지를 내보냅니다. 일부를 다시 캡처해야 하는 경우를 대비하여 현미경 단계에서 표본을 제거하기 전에 이미지를 검토하십시오.

7. 생체 외 OCT 및 스캐닝 레이저 검안경(SLO)에 대한 이미지 획득 개요

1. 스펙트럼 도메인 OCT의 경우, 60 디옵터 렌즈⁽³⁵)를 갖는 챔버를 갖는 맞춤형 아이 홀더 내의 포스페이트 완충액에 글로브를 놓는다. 아이홀더를 임상 OCT 영상 장치의 브래킷에 장착하고 환자가 이마를 쉴 수 있는 위치에 부착합니다. OCT 장치는 각 이미지에 배율 막대를 자동으로 삽입합니다.
2. 동시에 동일한 장치를 사용하고 눈을 홀더에 고정한 상태에서 근적외선 반사율(NIR, 유치 소프트웨어에서 로케이터 이미지로 사용), 488nm 여기 안저 자가형광(FAF) 및 적색 없는(RF) 반사율을 사용하여 스캐닝 레이저 검안경(SLO)으로 글로브를 이미지화합니다.
   알림: 이 장치의 787nm 여기 FAF는 빔 스플리터가 SLO로의 광선 투과율을 감소시키기 때문에 가끔씩만 적합합니다. 이러한 이유로 787nm FAF 이미지를 위한 두 번째 장치(다음 항목 참조)가 사용됩니다.
3. 개별적으로, 그러나 눈이 여전히 아이 홀더에 있는 상태에서, 이 양식을 잘 표시하는 별도의 장치를 사용하여 RPE 교란⁽³⁶)을 검출하기 위해 787nm FAF로 글로브를 이미지화한다.

8. 생체 외 OCT/SLO에 대한 이미지 획득 프로토콜(보충 자료 2의 슬라이드 참조)

1. 조직 마킹 염료로 상직근을 나타냅니다. 레이저를 켭니다(파란색 화살표, 보충 자료 2, 1페이지).
2. 보충 자료 2의 2페이지를 참조하여 전체 장치를 베이스(녹색 화살표)에 대해 두 축으로 이동한 다음 조이스틱을 시계 방향/반시계 방향(cw/ccw, 파란색 화살표)으로 돌려 높이(y)를 올려 OCT 헤드를 배치합니다. 검은색 레버를 R(*) 위치에 놓고 노브(주황색 화살표)를 돌려 이미지의 초점을 맞춥니다. 나비 나사(보라색 화살표)를 고정하여 장치를 잠급니다.
3. 아이를 홀더에 삽입하고 스페이서로 뒤쪽에서 안정화합니다(보충 자료 1, 13페이지). 공막이 찌그러지지 않도록 가능한 한 적은 압력을 가하십시오. 상직근의 조직 표시가 위를 향하도록 합니다.
   알림: 아이홀더 전면에서 OCT 장치까지의 대략적인 거리는 25mm입니다.
4. OCT 장치에 대한 독점 시각화 및 분석 소프트웨어를 엽니다. 왼쪽 열에 환자 목록이 나타납니다. 내부 코드 번호로 색인 된 안구 기증자는 "환자"입니다. 제조업체의 사용 설명서를 참조하십시오.
5. 새 환자 아이콘을 선택합니다. 필요에 따라 환자 데이터 정보를 작성합니다. 확인을 선택합니다. YYYYNNNL,R_agesex과 같이 개별 눈에 논리적으로 정렬된 번호 매기기 시스템을 사용합니다. 예를 들어 2017016R_97F일 수 있습니다.
6. 다음 창에서 데이터 입력을 계속한 후 OK를 누릅니다. 드롭다운 메뉴에서 연산자와 연구를 선택합니다.
   참고: 입력한 정보는 내보낼 수 있는 메타데이터에 나타납니다.
7. 빈 화면을 본 후 노란색 버튼을 터치하여 이미지 획득을 시작합니다.
8. IR + OCT(근적외선 반사율 + OCT)를 누릅니다. 레이저가 안저의 실시간 SLO 이미지와 OCT B-스캔을 획득할 수 있도록 합니다.
   1. ONH와 중심와를 기준으로 올바른 해부학적 위치를 확정하고 나무 어플리케이터를 사용하여 홀더의 눈 위치를 조정합니다. 제어판에서 검은색 원형 버튼을 돌려 강도를 조정합니다.
   2. 동일한 버튼을 눌러 평균 9-100 프레임을 만듭니다 (빨간색 화살표, 9이면 충분하고 100은 크림색으로 보입니다). 장치의 방향이 올바르면 안저에 초점이 맞춰져야 하고 OCT B-스캔이 디스플레이의 상단 1/3에 나타나야 합니다(보충 자료 2, 9페이지, 이중 빨간색 화살표).
   3. 안저 이미지에서 커서를 사용하여 파란색 선을 중심와 중앙으로 이동합니다(보충 자료 2, 9페이지, 흰색 화살표). 획득을 누릅니다.
      참고: 다른 기본 버튼은 Retina, EDI(꺼짐) 및 Line Scan입니다.
9. 다음 획득을 위해 RF + OCT 를 누릅니다. 위치를 다시 확인하여 이미지가 움직이거나 품질이 저하되지 않았는지 확인합니다. 평균을 구하려면 검은색 버튼을 누릅니다. 획득을 누릅니다.
10. 자가형광 이미징을 위한 내부 큐브를 488nm 및 787nm 여기 파장으로 전환합니다(보충 자료 2, 10페이지).
    알림: 스위치 뒤의 큐브 위치가 표시됩니다.
11. Autofluorescence mode(자동 형광 모드)를 선택합니다. 선형을 다시 확인합니다. 획득을 누릅니다.
12. RPE 중단 및 위축이 의심되는 경우 787nm 자가형광에 대해 ICGA (인도시아닌 그린 혈관조영술)를 선택합니다. 눈 위치를 다시 확인한 다음 Acquire를 누릅니다.
    참고: 안저 이미지는 내부 큐브가 빔을 감쇠시키기 때문에 이 양식에 나타나지 않는 경우가 많습니다.
13. 내부 큐브를 IR의 경우 R 로 다시 전환하고 볼륨 수집을 위해 적색 없는 이미징으로 전환합니다.
    알림: 스위치 후의 큐브 위치는 보충 자료 13의 2페이지에 나와 있습니다.
14. OCT 볼륨을 가져오려면 IR 및 볼륨 설정을 선택합니다. 제어 모듈(14° 황반 큐브, 30μm 간격, 실험 요구 사항에 따라 평균화)에서 적절한 버튼을 전환하여 보충 자료 2 페이지의 모든 설정을 일치시킵니다.
15. 근적외선 반사 안저 보기는 파란색 B-스캔 선으로 덮여 있습니다. 오른쪽 창의 위쪽 1/3에 있는 OCT 위치를 다시 확인합니다. 제어 모듈에서 Acquire를 누르고 볼륨 스캔이 완료될 때까지 5분 동안 기다립니다. 이미징 수집이 완료되면 EXIT를 선택합니다. 이미지가 저장됩니다(빨간색 화살표).
    알림: 파란색 선은 이전 보기에 표시된 거리를 마이크로미터 단위로 구분합니다. 스캔은 아래쪽(아래쪽)에서 번호 매기기를 시작하여 위쪽으로 진행합니다. 빨간색 선 진행에 유의하십시오.
16. 컴퓨터가 화면에 나타날 획득 한 이미지를 처리하도록 허용합니다 (보충 자료 2, 16 페이지).
17. 한 기증자의 반대쪽 눈을 촬영할 때 눈 사이의 장착 브래킷 위치를 변경하지 마십시오. 왼쪽 눈이 먼저 이미지화되면 결과가 OD(오른쪽 눈) 열에 표시됩니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 모든 이미지를 선택한 다음 교환 OS/OD를 선택합니다. 이미지가 OS 열로 이동합니다.
18. Window > Database> 선택을 누릅니다. 화면은 기본적으로 패널 6으로 설정되며 오른쪽 열에 기증자 눈이 추가됩니다(보충 자료 2, 18페이지). 드롭다운 메뉴에서 환자를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 배치를 선택한 다음 E2E 파일을 내보냅니다.
19. 파일 전송을 위해 바탕 화면에 생성된 미리 결정된 폴더를 찾습니다. 확인을 선택합니다. 이 폴더에는 외장 하드 드라이브에 복사하고 보관할 E2E 파일이 포함되어 있습니다.
20. 홀더의 눈을 787nm 자가형광에 주로 사용되는 스캐닝 레이저 검안경으로 가져옵니다.
    참고: 이미지 획득 및 보관에 대해서는 제조업체의 사용 설명서를 참조하십시오.
21. 컴퓨터와 레이저를 켭니다.
22. 새 환자 아이콘을 선택합니다. 필요에 따라 환자 데이터를 작성합니다.
23. 눈 데이터시트를 동일하게 유지하려면 OK를 누릅니다. C-커브가 동일하게 유지되면 계속을 누릅니다.
24. 스터디 모드를 선택하고 필요한 경우 암호를 입력합니다. C-커브를 7.7mm로 유지하고 확인을 누릅니다.
25. 계속을 선택하여 C-커브를 확인합니다. 노란색 표시등을 선택하여 카메라를 시작합니다.
26. R 위치를 선택합니다. 지구본을 정렬하고 방향을 지정합니다. 위와 같이 초점을 맞추고 방향을 지정할 IR 모드를 선택합니다.
27. 베이스를 기준으로 전체 장치를 두 축으로 움직인 다음(보충 자료 2, 28페이지, 녹색 화살표) 장치의 높이(y)를 올림(파란색 화살표)하여 카메라 헤드의 방향을 지정합니다. 노브(주황색 화살표)를 돌려 이미지의 초점을 맞춥니다. 검은색 레버는 R(*) 위치에 있습니다. 이 헤드가 제자리에 놓이면 나비 나사(보라색 화살표)를 돌려 장치를 잠급니다.
28. 보충 자료 29의 2페이지와 같이 화면이 나타납니다.
29. 선택기 노브를 R 에서 A로 이동합니다. 파란색, 100% 강도, 30° 시야 및 단상 이미징에서 ICGA (787nm 자가형광 달성)를 선택합니다.
    참고: 염료 인도시아닌 그린과 마찬가지로 멜라닌은 787nm 파장의 빛에 의해 여기됩니다.
30. 보충 자료 31의 2페이지와 같이 화면이 나타납니다. 평균을 구하려면 검은색 디스크를 누른 다음 Acquire를 선택합니다.
31. Window > Database를 선택합니다. SLO 장치에서 E2E 파일 가져오기를 선택합니다. 이러한 파일은 외장 하드 드라이브에 저장되고 바탕 화면에 업로드됩니다.
32. 열기를 선택합니다. 표시가 기본값인지 확인하고 확인을 선택합니다.
33. 환자는 이제 SLO에서 획득한 이미지(파란색 화살표)를 보여주는 탭과 OCT 장치에서 획득한 이미지(빨간색 화살표)를 보여주는 다른 탭의 두 개의 탭을 가지고 있습니다(보충 자료 2페이지, 34페이지).
34. 786nm(ICGA) 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 바탕 화면의 SLO 786 파일로 사진을 내보냅니다.
35. 786nm 자가형광 SLO 이미지를 저장하려면 환자를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 이미지를 RAW 파일(.vol 파일의 경우)로 바탕 화면의 폴더에 내보냅니다.
36. 아카이브 컴퓨터로 전송하기 위해 OCT 장치에서 이미지를 내보내려면 RAWEXPORT 에서 RAW라는 폴더에 복사/붙여넣기를 합니다.

9. 이미징 검토

1. 각 기증자에 대한 폴더에 이미지(색상, .vol 파일, SLO 이미지)를 조합하고 각 눈에 대한 하위 폴더가 있는 경우 실험실 ID별로 폴더를 연속적으로 색인화합니다.
2. 표준화된 보고서를 위해 데이터베이스에 조직 인상(품질, 병리)을 기록합니다.
3. 내보낸 OCT 볼륨을 사내 ImageJ 플러그인을 사용하여 검토합니다.
   1. 중심와 딥의 중심, 바깥쪽 망막 밴드의 안쪽 상승 또는 가장 얇은 지점으로 인식할 수 있는 중심와 중심을 찾으십시오. 대부분의 경우, 이들은 일치하지만 항상 그런 것은 아니며, 이는 중심와 보존, 개인의 다양성 및 병리학의 존재에 달려 있기 때문입니다.
   2. 상부 중심와에서 표준 스캔을 찾습니다(상부 방향으로 2mm/67 B-스캔, 즉, 스캔 횟수 증가).
   3. 나중에 빠르게 참조할 수 있도록 전체 볼륨의 .tif 스택을 저장합니다.
   4. OCT 볼륨 전체를 스크롤하여 스캔 1(하위)부터 시작하면서 피처가 인식되는 스캔 번호를 기록합니다.
   5. 황반 외에 유두 주위 부위를 확인하십시오.
      참고: 노령 눈의 유두주위 맥락망막 위축에는 독특한 기저층 침착 및 신생혈관이 포함됩니다. 이것은 근시성 눈과 녹내장뿐만 아니라 노화 및 AMD³⁷에서 색소 변화의 일반적인 영역입니다.
4. 컬러 사진을 검사하고 가능하면 OCT에서 본 결과와 연결합니다.
   참고: 일반적으로 OCT를 통해 대부분의 결과를 먼저 보는 것이 더 쉽습니다. 컬러 사진은 SLO의 영역 외부 영역, 모반을 포함한 맥락막 색소 침착, 헴 및 단단한 삼출물의 존재, 신생혈관 AMD의 검은색 색소에 대한 넓은 시야를 제공합니다. 중심와에 있는 어두운 안료는 앞쪽 부분의 느슨한 멜라노솜을 나타낼 수 있으며 피펫을 사용하여 완충액으로 부드럽게 씻어내야 합니다.
5. SLO 이미지를 검사하고 가능한 경우 결과를 OCT에서 볼 수 있는 이미지와 연결합니다.
6. 중심와 및 중심와에 표준 B-스캔을 저장하고, 주목할 만한 병리학 또는 기타 특징이 있는 추가 B-스캔을 저장하고, 병리학 보고서에 SLO 이미지를 저장합니다.
7. 눈을 다음과 같이 분류하십시오: 눈에 띄지 않음, 의심스러움, 중급 AMD, 위축성 AMD, 신생혈관성 AMD, 기타, 알 수 없음, 등급을 매길 수 없음, 기록되지 않음. "의심스러운"은 변경 사항이 다른 분류에 충분히 심각한지 명확하지 않은 경우에 사용됩니다. "등급이 매겨지지 않음"은 망막이 심하게 박리된 눈과 같이 유용한 OCT 스캔이 부족한 눈을 위해 예약되어 있습니다. "기록되지 않음"은 사진 촬영 없이 수령 즉시 처리되는 눈을 위해 예약되어 있습니다.
8. AMD에 대해 다음 기준을 사용하십시오: 드루젠 또는 망막하 드루세노이드 침착물이 있는 심각한 RPE 변화, 체액 또는 섬유증과 같은 신생혈관 형성의 징후가 있거나 없고 다른 원인의 증거가 없음(SDD를 수용하기 위해 Curcio et ^al.10에서 업데이트됨).
   참고: 최종 진단은 조직학적 분석으로 확인됩니다.

결과

표 1은 2016-2017년 동안 80세>94명의 백인 비당뇨병 기증자로부터 184개의 눈이 회복되었음을 보여줍니다. 평균 사망 후 보존 시간은 3.9시간(범위: 2.0-6.4시간)이었습니다. 검토된 184명의 눈 중 75명(40.2%)이 특정 AMD를 가지고 있었습니다. 다음 범주가 확인되었습니다: 눈에 띄지 않음(39.7%), 의심스러움(11.4%), 중급 초중급 AMD(22.8%), 위축성(7.6%), 신생혈관성(9.8%), 기타(8.7%), 알 수 없음/기록되지 ...

토론

COVID 이전 시대의 16개월 동안 인구 기반 스크리닝 접근 방식을 사용하여 AMD로 75명의 기증자 안구를 조달할 수 있었습니다. 모두 짧은 DtoP로 회수되었고 OCT 고정 MMI를 사용하여 병기되었습니다. 연령 기준(>80세)은 이식 가능한 각막을 위한 조직 회복의 일반적인 연령 범위를 벗어납니다. 고령에도 불구하고 우리의 기준은 AMD의 모든 단계에서 눈을 떴습니다. 많은 RPE 표현형은 모든 AMD 단계에 공통적...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12