Ex Vivo (생체 외 ) 연령 관련 황반변성 연구를 위한 인간 기증자 눈의 OCT 기반 다중 모드 이미징

요약

실험실 분석은 연령 관련 황반변성(AMD)의 종방향 광간섭 단층촬영(OCT) 기반 다중 모드 영상의 예후 가치를 활용할 수 있습니다. AMD가 있거나 없는 인간 기증자의 눈은 조직 절편 전에 OCT, 색상, 근적외선 반사율 스캐닝 레이저 검안경 및 자가형광을 사용하여 이미지화됩니다.

초록

광간섭 단층촬영(OCT) 기반 멀티모달(MMI) 임상 영상에서 학습한 연령 관련 황반변성(AMD)의 진행 순서는 실험실 소견에 예후 가치를 더할 수 있습니다. 이 작업에서는 망막 조직 절편 전에 생체 외 OCT와 MMI를 인간 기증자의 눈에 적용했습니다. 눈은 ≥80세의 비당뇨병 백인 기증자로부터 회복되었으며 사망 후 보존 시간(DtoP)은 ≤6시간이었습니다. 글로브는 현장에서 회수되어 각막 제거를 용이하게 하기 위해 18mm 트레핀으로 점수를 매기고 완충된 4% 파라포름알데히드에 담갔습니다. 컬러 안저 이미지는 해부 스코프와 SLR 카메라로 전방 분절 제거 후 3배율에서 트랜스, 에피 및 플래시 조명을 사용하여 획득했습니다. 글로브는 60 디옵터 렌즈가 있는 맞춤형으로 설계된 챔버 내의 버퍼에 배치되었습니다. 스펙트럼 도메인 OCT(30° 황반 큐브, 30μm 간격, 평균 = 25), 근적외선 반사율, 488nm 자가형광 및 787nm 자가형광으로 이미지화되었습니다. AMD 눈은 신생혈관 형성 유무에 관계없이 다른 원인의 증거 없이 드루젠 또는 망막하 드루세노이드 침착물(SDD)이 있는 망막 색소 상피(RPE)의 변화를 보여주었습니다. 2016 년 6 월과 2017 년 9 월 사이에 94 개의 오른쪽 눈과 90 개의 왼쪽 눈이 회복되었습니다 (DtoP : 3.9 ± 1.0 h). 184개의 눈 중 40.2%가 초기 중등도(22.8%), 위축성(7.6%), 신생혈관성(9.8%) AMD를 포함하여 AMD를 가지고 있었고 39.7%는 눈에 띄지 않는 황반을 가지고 있었습니다. Drusen, SDD, 과반사 병소, 위축 및 섬유혈관 흉터는 OCT를 사용하여 확인되었습니다. 인공물에는 조직 혼탁, 박리(간균, 망막, RPE, 맥락막), 중심와 낭성 변화, 기복이 있는 RPE 및 기계적 손상이 포함되었습니다. 냉동 절편을 안내하기 위해 OCT 부피를 사용하여 중심와 및 시신경두 랜드마크와 특정 병리를 찾았습니다. 생체 외 부피는 시선 추적을 위한 기준 기능을 선택하여 생체 내 부피에 등록되었습니다. 생체 내에서 볼 수 있는 병리학의 생체 외 가시성은 보존 품질에 따라 다릅니다. 16개월 이내에 AMD의 모든 단계에서 75개의 신속한 DtoP 기증자 안구를 회복하고 임상 MMI 방법을 사용하여 병기를 결정했습니다.

서문

광간섭 단층촬영(OCT)의 지도 하에 항-VEGF 요법으로 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)을 관리한 15년은 시력 상실의 만연한 원인의 진행 순서와 미세 구조에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. 주요 인식은 AMD가 신경 감각 망막, 망막 색소 상피(RPE) 및 맥락막과 관련된 3차원 질환이라는 것입니다. 시험 환자와 치료받은 클리닉 환자의 동료 눈에 대한 OCT 영상의 결과, 수십 년 동안 임상 표준이었던 컬러 안저 사진에서 볼 수 있는 것 이상의 병리학적 특징이 이제 인식되고 있습니다. 여기에는 망막내 혈관신생(제3형 황반^혈관신생1, 이전의 혈관종성 증식), 망막하 드루세노이드 침착물(SDD, 망상 슈도드루젠이라고도 함)², RPE 운명의 다중 경로^3,4, 위축의 강렬한 신경교 뮐러 세포 ^5,6.

황반(세포 및 동물)이 결여된 모델 시스템은 이 복잡한 질병의 일부 조각을 재현한다 ^7,8,9....

프로토콜

버밍엄에 있는 앨라배마 대학교의 기관 검토 위원회는 Good Laboratory Practices 및 Biosafety Level 2/2+를 준수하는 실험실 연구를 승인했습니다. 모든 미국 안구 은행은 2006년 통일 해부학적 선물법(Uniform Anatomical Gifts Act)과 미국 식품의약국(FDA)을 준수합니다. Advancing Sight Network를 포함한 대부분의 미국 안구 은행은 미국 안구 은행 협회(Eye Bank Association of America)의 의료 표준을 준수합니다.

재료 표에는 소모품과 장비가 나열되어 있습니다. 보충 자료 1은 해부, 안저 사진 및 OCT 기반 MMI에 대한 개요를 제공합니다. 보충 자료 2는 OCT 기반 MMI에 대한 세부 정보를 제공합니다.

1. 조직 채취 기준

1. 서류미비 기증자 선별검사에서 AMD 안구의 수율을 최대화하려면 허용 가능한 기증자에 대해 연령 ≥80세, 백인, 비당뇨병 환자, ≤6시간 사망 보존(DtoP) 기준을 설정하십시오.
   알림: DtoP는 사망 시점부터 병원이나 실험실....

토론

COVID 이전 시대의 16개월 동안 인구 기반 스크리닝 접근 방식을 사용하여 AMD로 75명의 기증자 안구를 조달할 수 있었습니다. 모두 짧은 DtoP로 회수되었고 OCT 고정 MMI를 사용하여 병기되었습니다. 연령 기준(>80세)은 이식 가능한 각막을 위한 조직 회복의 일반적인 연령 범위를 벗어납니다. 고령에도 불구하고 우리의 기준은 AMD의 모든 단계에서 눈을 떴습니다. 많은 RPE 표현형은 모든 AMD 단계에 공통적.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12