Ex Vivo Imaging multimodale basato su OCT di occhi di donatori umani per la ricerca sulla degenerazione maculare legata all'età

Riepilogo

I test di laboratorio possono sfruttare il valore prognostico dell'imaging multimodale basato sulla tomografia a coerenza ottica longitudinale (OCT) della degenerazione maculare legata all'età (AMD). Gli occhi dei donatori umani con e senza AMD vengono ripresi utilizzando OCT, colore, oftalmoscopia laser a scansione di riflettanza nel vicino infrarosso e autofluorescenza a due lunghezze d'onda di eccitazione prima del sezionamento dei tessuti.

Abstract

Una sequenza di progressione per la degenerazione maculare legata all'età (AMD) appresa dall'imaging clinico multimodale basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT) (MMI) potrebbe aggiungere valore prognostico ai risultati di laboratorio. In questo lavoro, OCT e MMI ex vivo sono stati applicati agli occhi di donatori umani prima del sezionamento del tessuto retinico. Gli occhi sono stati recuperati da donatori bianchi non diabetici di età compresa tra ≥80 anni, con un tempo di morte per conservazione (DtoP) di ≤6 ore. I globi sono stati recuperati in loco, incisi con un trephine di 18 mm per facilitare la rimozione della cornea e immersi in paraformaldeide tamponata al 4%. Le immagini del fondo oculare a colori sono state acquisite dopo la rimozione del segmento anteriore con un cannocchiale da dissezione e una fotocamera reflex utilizzando l'illuminazione trans, epi- e flash a tre ingrandimenti. I globi sono stati collocati in un buffer all'interno di una camera progettata su misura con una lente da 60 diottrie. Sono stati fotografati con dominio spettrale OCT (cubo di macula di 30°, spaziatura di 30 μm, media = 25), riflettanza nel vicino infrarosso, autofluorescenza a 488 nm e autofluorescenza a 787 nm. Gli occhi AMD hanno mostrato un cambiamento nell'epitelio pigmentato retinico (RPE), con depositi di drusen o drusenoidi sottoretinici (SDD), con o senza neovascolarizzazione e senza evidenza di altre cause. Tra giugno 2016 e settembre 2017 sono stati recuperati 94 occhi destri e 90 occhi sinistri (DtoP: 3,9 ± 1,0 ore). Dei 184 occhi, il 40,2% aveva AMD, inclusa la AMD intermedia precoce (22,8%), atrofica (7,6%) e neovascolare (9,8%) e il 39,7% aveva macule insignificanti. Drusen, SDD, focolai iperriflettenti, atrofia e cicatrici fibrovascolari sono stati identificati utilizzando OCT. Gli artefatti includevano opacizzazione tissutale, distacchi (bacillare, retinica, RPE, coroideale), cambiamento cistico foveale, un RPE ondulato e danni meccanici. Per guidare la criosezione, sono stati utilizzati volumi OCT per trovare i punti di riferimento della fovea e della testa del nervo ottico e patologie specifiche. I volumi ex vivo sono stati registrati con i volumi in vivo selezionando la funzione di riferimento per l'eye tracking. La visibilità ex vivo della patologia osservata in vivo dipende dalla qualità della conservazione. Entro 16 mesi, 75 occhi rapidi di donatori di DtoP in tutte le fasi dell'AMD sono stati recuperati e messi in scena utilizzando metodi clinici MMI.

Introduzione

Quindici anni di gestione della degenerazione maculare legata all'età (AMD) neovascolare con terapia anti-VEGF sotto la guida della tomografia a coerenza ottica (OCT) hanno offerto nuove conoscenze sulla sequenza di progressione e sulla microarchitettura di questa causa prevalente di perdita della vista. Un riconoscimento chiave è che l'AMD è una malattia tridimensionale che coinvolge la retina neurosensoriale, l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e la coroide. Come risultato dell'imaging OCT dei pazienti dello studio e degli occhi dei pazienti della clinica trattati, le caratteristiche della patologia oltre a quelle viste dalla fotografia del fondo oculare a colori, ....

Protocollo

Il comitato di revisione istituzionale dell'Università dell'Alabama a Birmingham ha approvato gli studi di laboratorio, che hanno aderito alle buone pratiche di laboratorio e al livello di biosicurezza 2/2+. Tutte le banche degli occhi degli Stati Uniti sono conformi all'Uniform Anatomical Gifts Act del 2006 e alla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. La maggior parte delle banche degli occhi statunitensi, tra cui Advancing Sight Network, sono conformi agli standard medici della Eye Bank Association of America.

La tabella dei materiali elenca le forniture e le attrezzature. Il materiale supplementare 1

Discussione

Utilizzando un approccio di screening basato sulla popolazione durante un periodo di 16 mesi nell'era pre-COVID, è stato possibile procurarsi 75 occhi di donatori con AMD. Tutti sono stati recuperati con un breve DtoP e messi in scena utilizzando MMI ancorato OCT. Il criterio di età (>80 anni) è al di fuori della fascia di età tipica per i recuperi di tessuto destinati a cornee trapiantabili. Nonostante l'età avanzata, i nostri criteri hanno portato gli occhi in tutte le fasi di AMD. Molti fenotipi RPE sono comuni a.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12