Ex Vivo Imagem Multimodal Baseada em OCT de Olhos de Doadores Humanos para Pesquisa em Degeneração Macular Relacionada à Idade

Resumo

Os ensaios laboratoriais podem alavancar o valor prognóstico da imagem multimodal baseada em tomografia de coerência óptica longitudinal (OCT) da degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Olhos de doadores humanos com e sem DMRI são fotografados usando OCT, oftalmoscopia a laser de varredura por reflectância no infravermelho próximo e autofluorescência em dois comprimentos de onda de excitação antes da secção do tecido.

Resumo

Uma sequência de progressão para degeneração macular relacionada à idade (DMRI) aprendida com imagens clínicas multimodais (MMI) baseadas em tomografia de coerência óptica (OCT) poderia adicionar valor prognóstico aos achados laboratoriais. Neste trabalho, OCT e IHM ex vivo foram aplicados em olhos de doadores humanos antes da secção do tecido da retina. Os olhos foram recuperados de doadores brancos não diabéticos com idade ≥80 anos, com tempo de morte até a preservação (DPP) de ≤6 h. Os globos foram recuperados no local, marcados com trefina de 18 mm para facilitar a remoção da córnea e imersos em paraformaldeído tamponada a 4%. As imagens de fundo de olho coloridas foram adquiridas após a remoção do segmento anterior com um telescópio dissecante e uma câmera SLR usando iluminação trans, epi e flash em três aumentos. Os globos foram colocados em um tampão dentro de uma câmara personalizada com uma lente de 60 dioptrias. Eles foram imageados com OCT de domínio espectral (cubo de mácula de 30°, espaçamento de 30 μm, média = 25), reflectância no infravermelho próximo, autofluorescência de 488 nm e autofluorescência de 787 nm. Os olhos com DMRI apresentavam alteração do epitélio pigmentado da retina (EPR), com depósitos drusenoides drusenoides (DDS) drusenóides (DRS) drusenos ou sub-retinianos, com ou sem neovascularização, e sem evidência de outras causas. Entre junho de 2016 e setembro de 2017, foram recuperados 94 olhos direitos e 90 esquerdos (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). Dos 184 olhos, 40,2% tinham DMRI, incluindo DMRI intermediária precoce (22,8%), atrófica (7,6%) e neovascular (9,8%), e 39,7% tinham máculas normais. Drusen, SDDs, focos hiper-reflexivos, atrofia e cicatrizes fibrovasculares foram identificados usando OCT. Os artefatos incluíram opacificação tecidual, descolamentos (bacilar, retiniano, EPR, coroidal), alteração cística foveal, EPR ondulante e dano mecânico. Para guiar a criossecção, volumes de OCT foram usados para encontrar os pontos de referência da fóvea e da cabeça do nervo óptico e patologias específicas. Os volumes ex vivo foram registrados com os volumes in vivo , selecionando-se a função de referência para rastreamento ocular. A visibilidade ex vivo da patologia observada in vivo depende da qualidade da preservação. Dentro de 16 meses, 75 olhos de doadores rápidos DtoP em todos os estágios da DMRI foram recuperados e estadiados usando métodos clínicos de MMI.

Introdução

Quinze anos de manejo da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI) com terapia anti-VEGF sob a orientação da tomografia de coerência óptica (OCT) ofereceram novos insights sobre a sequência de progressão e a microarquitetura dessa causa prevalente de perda de visão. Um reconhecimento importante é que a DMRI é uma doença tridimensional que envolve a retina neurossensorial, o epitélio pigmentado da retina (EPR) e a coroide. Como resultado das imagens de OCT de pacientes do estudo e dos olhos de pacientes clínicos tratados, as características da patologia além daquelas vistas pela fotografia de fundo de olho colorido, um padrão clínico por décadas, são agora reconhecidas. Estes incluem neovascularização intrarretiniana (neovascularização macular tipo 3¹, anteriormente proliferação angiomatosa), depósitos drusenoides sub-retinianos (SDDs, também chamados pseudodrusen reticulares)², múltiplas vias do destino do EPR^3,4 e células de Müller intensamente glióticas em atrofia ^5,6.

Sistemas modelo desprovidos de máculas (células e animais) recriam algumas fatias dessa complexa doença ^7,8,9. Mais sucesso em melhorar a carga da DMRI poderia vir da descoberta e exploração da patologia primária em olhos humanos, entendendo a composição celular única da mácula, seguida de tradução para sistemas modelo. Este relatório retrata uma colaboração de três décadas entre um laboratório de pesquisa acadêmica e um banco de olhos. Os objetivos dos métodos de caracterização tecidual aqui descritos são dois: 1) informar a evolução da tecnologia diagnóstica, demonstrando a base da aparência do fundo de olho e fontes de sinal de imagem com microscopia, e 2) classificar espécimes de DMRI para técnicas de descoberta molecular direcionadas (imunohistoquímica) e não direcionadas (espectrometria de massa por imagem, IMS e transcriptômica espacial) que preservam a fóvea somente cônica e a para- e perifovea ricas em bastonetes. Tais estudos poderiam acelerar a tradução para OCT clínica, para a qual uma sequência de progressão e acompanhamento longitudinal são possíveis por meio do rastreamento ocular. Essa tecnologia, projetada para monitorar os efeitos do tratamento, registra exames de uma consulta clínica para outra usando vasos da retina. Associar a OCT rastreada pelos olhos aos resultados laboratoriais obtidos com técnicas destrutivas poderia fornecer um novo nível de valor prognóstico aos achados moleculares.

Em 1993, o laboratório de pesquisa capturou fotografias coloridas de fundo de olho post-mortem no filme¹⁰. Esse esforço foi inspirado na soberba fotomicroscopia e histologia da retina periférica humana de Foos e colaboradores11,12,13 e nas extensas correlações clínico-patológicas da DMRI de Sarks et al.14,15. A partir de 2009, a imagem multimodal (IHM) ex vivo ancorada na OCT de domínio espectral foi adotada. Essa transição foi inspirada pelos esforços semelhantes de outros 16,17 e, principalmente, pela constatação de que grande parte da ultraestrutura descrita pelos Sarks estava disponível em três dimensões, ao longo do tempo, na clínica ^18,19. O objetivo era adquirir olhos com máculas aderidas em um prazo razoável para estudos bem fundamentados dos fenótipos em nível celular na retina, PSE e coroide. A intenção era ir além da estatística "por olho" para "por tipo de lesão", padrão influenciado pelos conceitos de "placa vulnerável" das doenças^{cardiovasculares20,21}.

O protocolo deste relato reflete a experiência com cerca de 400 pares de olhos doadores acessados em vários fluxos. Em 2011-2014, foi criado o site do Projeto MACULA de histopatologia da AMD, que inclui espessuras de camadas e anotações de 142 espécimes arquivados. Esses olhos foram preservados de 1996 a 2012 em fixador de glutaraldeído-paraformaldeído para histologia de alta resolução de resina epóxi e microscopia eletrônica. Todos os fundos de fundo foram fotografados coloridos quando recebidos e refotografados pela OCT imediatamente antes da histologia. Um suporte ocular originalmente projetado para estudos do nervo óptico²² foi usado para acomodar um punch de tecido de espessura total de 8 mm de diâmetro centrado na fóvea. OCT B-scans através do centro foveal e um local 2 mm superior, correspondente à histologia nos mesmos níveis, foram enviados para o site, além de uma fotografia de fundo de olho colorida. A escolha dos planos da OCT foi ditada pela proeminência da patologia da DMRI sob a fóvea²³ e pela proeminência dos SDDs em áreas ricas em bastonetes superiores à fóvea^24,25.

A partir de 2013, olhos com MMI ancorados em OCT durante a vida estavam disponíveis para correlações clinicopatológicas diretas. A maioria (7 de 10 doadores) envolveu pacientes em uma clínica de referência de retina (autor: K.B.F.), que oferecia um registro diretivo avançado para pacientes interessados em doar seus olhos após a morte para fins de pesquisa. Os olhos foram recuperados e preservados pelo banco de olhos local, transferidos para o laboratório e preparados da mesma forma que os olhos do Projeto MACULA. Os volumes clínicos de OCT pré-mortem foram lidos perfeitamente em laboratório, alinhando as características patológicas observadas durante a vida com as características vistas ao microscópio²⁶.

A partir de 2014, a coleta prospectiva de olhos começou pela triagem para DMRI em olhos de doadores sem história clínica, mas preservados durante um limite de tempo definido (6 h). Para isso, o suporte para os olhos foi modificado para acomodar um globo inteiro. Isso reduziu a chance de descolamento ao redor das bordas de corte do punch de 8 mm usado anteriormente. Os olhos foram preservados em paraformaldeído tamponado a 4% para imunohistoquímica e transferidos para 1% no dia seguinte para armazenamento a longo prazo. Em 2016-2017 (pré-pandemia), foram recuperados 184 olhos de 90 doadores. As estatísticas e imagens deste relatório são geradas a partir desta série. Durante a era pandêmica (lockdowns e consequências de 2020), as coletas prospectivas para colaborações transcriptômicas e IMS continuaram em um ritmo reduzido, essencialmente usando os métodos de 2014.

Outros métodos para avaliação ocular do doador estão disponíveis. O Minnesota Grading System (MGS)^27,28 é baseado no sistema clínico AREDS para fotografia de fundo de olho^colorido29. As limitações desse método incluem a combinação de DMRI atrófica e neovascular em um estágio de "DMRI tardia". Além disso, a MGS envolve a remoção da retina neurossensorial antes da fotodocumentação da coroide do EPR. Essa etapa desloca os DDS em graus variados^30,31 e remove a correspondência espacial da retina externa e seu sistema de suporte. Assim, esforços para relacionar a demanda metabólica e a sinalização da retina à patologia na PSE-coróide podem ser impedidos. O Sistema Utah implementou a MMI usando fotografia colorida ex vivo e OCT para categorizar os olhos destinados à dissecção em regiões para extração de RNA e proteína³². Embora preferível às extrações inteiras da ocular, a área de 3 mm de diâmetro com maior risco de progressão da DMRI^33,34 representa apenas 25% de um punch centrado na fóvea de 6 mm de diâmetro. Assim, técnicas que possam localizar achados referentes à fóvea, como cortes seriados para imuno-histoquímica, são vantajosas.

Protocolo

O comitê de revisão institucional da Universidade do Alabama em Birmingham aprovou os estudos laboratoriais, que aderiram às Boas Práticas de Laboratório e Nível de Biossegurança 2/2+. Todos os bancos de olhos dos EUA estão em conformidade com o Uniform Anatomical Gifts Act de 2006 e a Food and Drug Administration dos EUA. A maioria dos bancos de olhos dos EUA, incluindo a Advancing Sight Network, está em conformidade com os padrões médicos da Eye Bank Association of America.

A Tabela de Materiais lista os suprimentos e equipamentos. O Material Suplementar 1 fornece uma visão geral da dissecção, fotografia de fundo de olho colorido e IHM baseada em OCT. O Material Suplementar 2 fornece detalhes do MMI baseado nos OCT.

1. Critérios para coleta de tecidos

1. Para maximizar o rendimento dos olhos de DMRI em uma triagem de doadores não documentados, defina os seguintes critérios para doadores aceitáveis: idade ≥80 anos, brancos, não diabéticos e ≤6 h de morte até a preservação (DtoP).
   NOTA: DtoP é definido como o tempo entre a morte e quando o olho é colocado em um conservante fornecido, seja no hospital ou no laboratório.

2. Meio de conservação e outras preparações (laboratório)

1. Faça paraformaldeído tamponada com fosfato a 4% a partir de 20% do estoque (comprado). Preparar 1 L adicionando 200 ml de paraformaldeído a 20% (factor de diluição de 5) a 800 ml de tampão fosfato de Sorenson 0,1 M. Teste e ajuste para garantir que o pH é 7,2, se necessário. Conservar a 4 °C.
2. Distribuir 30 mL de paraformaldeído tamponada com fosfato a 4% em frascos de 40 mL.
3. Estoque rotulado 40 mL recipientes de conservante no banco de olhos para que o tecido possa ser recuperado a qualquer momento e em qualquer dia.
4. Para o armazenamento dos olhos preservados, fazer paraformaldeído a 1% a partir da solução a 4%. Preparar 1 L adicionando 250 ml de paraformaldeído a 4% (factor de diluição de 4) a 750 ml de tampão fosfato de Sorenson 0,1 M. Teste e ajuste o pH se necessário. Conservar a 4 °C.
   1. Preparar 1 L de uma solução 0,1 M a partir da solução 0,2 M do tampão fosfato de Sorenson, pH 7,2, combinando 500 ml de água destilada e 500 ml de tampão Sorenson.
   2. Ajustar a queda de pH por gota usando 1 N de ácido clorídrico ou 1 N de hidróxido de sódio. Conservar a 4 °C.
5. Crie um suporte para estabilizar os olhos durante a dissecção. Encha uma placa de Petri com cera dental aquecida até ficar líquido. Quando estiver ligeiramente frio, faça uma impressão hemisférica nele com um rolamento de esferas grande e, em seguida, congele o prato para facilitar a remoção do rolamento de esferas.

3. Métodos de banco de olhos

1. Para garantir a rápida recuperação dos tecidos de pesquisa, recupere todos os tecidos rapidamente, incluindo aqueles destinados ao transplante.
2. Receba encaminhamentos de óbito, conforme exigido por lei, dentro de 1 h após o óbito, e acompanhe cada doador com um número de sequência de referência que acompanhe o tecido.
3. Para encontrar casos com potencial documentação clínica, faça perguntas específicas sobre DMRI e doenças oculares na entrevista de avaliação de risco de doadores de pesquisa.
4. Para minimizar o tempo de viagem, recupere globos inteiros (diferente apenas de córneas para transplante) dentro de uma área compacta (ou seja, cidade e condado suburbano adjacente).
5. Leve dois frascos de conservante (paraformaldeído tamponada a 4%) para o quarto do hospital do falecido para recuperação do tecido (em vez de esperar que o corpo seja transferido para um necrotério).
6. Antes e durante a recuperação, comunique-se com os investigadores para confirmar a entrega e o prazo.
7. Recuperar os globos oculares no local, abri-los por métodos de manuseio consistentes e imergir o olho aberto em conservante (Figura 1).
   1. Segure o olho do doador excisado no lugar usando uma bainha de gaze estabilizada por um hemostático.
   2. Para facilitar a remoção da córnea com uma borda de esclera de 2 mm de largura, use uma trefina de 18 mm de diâmetro para pontuar o globo ocular.
   3. Para liberar a córnea com uma borda de esclera acompanhante, corte ao longo do círculo marcado usando tesoura com mola com pontas curvas enquanto estabiliza o globo com a gaze cortada do hemostático.
   4. Levante a córnea da esclera, expondo a íris e o corpo ciliar.
   5. Para facilitar a penetração do conservante na câmara vítrea, faça uma fenda de 2 mm de comprimento na íris perpendicular à margem pupilar. Colocar os olhos em frascos de amostra com 30 mL de conservante a 4 °C e transferir para o laboratório em gelo úmido.
8. Transmitir eletronicamente informações de doadores não identificados do banco de olhos para o banco de dados do laboratório de pesquisa.
   NOTA: O banco de dados mantém o número de referência, o número de tecido do banco de olhos e o número de identificação do laboratório para rastreamento, além de outras informações relevantes.

4. Preparação de tecidos para fotografia de fundo de olho colorido ex vivo

1. Utilizar dois microscópios estéreo, um para dissecção e outro para fotografia de fundo de olho colorido.
   NOTA: Para que a transiluminação visualize alterações pigmentares, use uma base para microscopia de campo escuro.
2. Remova os remanescentes do segmento anterior (íris e lente). Para estabilizar o olho durante a dissecção, coloque-o na placa de Petri preenchida com cera (Material Suplementar 1, lâminas 7-8). Para evitar que o corpo ciliar e a retina anexada colapsem na cavidade vítrea, minimize a perturbação do anel de vítreo espesso aderido ao corpo ciliar (base vítrea).
3. Marque o polo superior para orientação. Coloque o globo anterior para baixo no prato. Encontre os tendões de inserção dos músculos reto superior e oblíquo superior. Usando um aplicador de madeira, aplique com moderação uma tinta de marcação em uma linha de 10 mm no sentido anterior para posterior (ou seja, perpendicular à inserção tendínea do músculo reto superior).
4. Antes de fotografar, encha o fundo de olho com o tampão de fosfato de Sorensen frio.
5. Insira um grânulo de rubi de 1 mm no fundo de olho como uma barra de escala interna a ser exibida em cada imagem²⁷.
6. Adquira imagens coloridas com uma câmera reflex de lente única montada em um microscópio estéreo equipado com um flash de anel. Use iluminação trans, epi e flash em cada uma das três ampliações padrão para capturar imagens destinadas a destacar áreas específicas (Material Suplementar 1, slide 11): 1) o fundo do ombro, 2) o polo posterior (arcadas vasculares, cabeça do nervo óptico, fóvea) e 3) a fóvea dentro da mácula lútea (mancha amarela).

5. Preparação para fotografia de fundo de olho colorido ex vivo

1. Ligue a câmera e o monitor. Conecte o obturador remoto e solte o atuador no monitor de câmera/televisão (TV) de interface multimídia de alta definição (HDMI) e no cabo de exibição.
2. Defina as configurações da câmera para a função ISO manual e a posição de travamento do espelho (travada no lugar para reduzir a vibração).
   NOTA: Consulte o manual do usuário do fabricante para obter as configurações na câmera usada. Aprenda com a exibição da câmera as configurações de sobre/subexposição relativas ao histograma e leituras de exposição.
3. Dispor duas fontes de luz, cada uma com duas guias de luz flexíveis posicionadas perpendicularmente uma à outra, para iluminação nas quatro direções cardeais no estágio do microscópio (Material Suplementar 1, página 10).
4. Ligue as fontes de luz de epi-iluminação até a potência máxima.
   NOTA: É útil, mas não é necessário ter uma cobertura de feltro preto ao redor do palco para limitar a dispersão de luz/flash para o fotógrafo.
5. Ao microscópio dissecante, utilizar pinça para inserir o polo posterior em um cadinho de quartzo de 30 mL preenchido com tampão. Deixe o tecido afundar para o fundo. Insira uma bandagem, como uma esponja de tecido, entre o olho e a parede do cadinho para evitar o movimento. Introduzir o talão de rubi de 1 mm no polo posterior.
   NOTA: O talão pode cair no copo do nervo óptico.
6. Coloque cuidadosamente o globo no cadinho no palco do estereomicroscópio e observe o fundo ocular interior através das oculares do microscópio. Usando a menor magnificação, orientar o olho identificando a marca de tecido na posição das 12 horas, a cabeça do nervo óptico (ONH) e a fóvea 5° abaixo da ONH. Gire o olho de modo que a fóvea caia abaixo de uma linha através da ONH em 5°.
   NOTA: Se for um olho direito, a ONH está à direita da fóvea, como visto através das oculares do microscópio. Se for um olho esquerdo, a ONH fica à esquerda da fóvea.
7. Ligue a visualização remota do monitor a partir da câmera. Certifique-se de que o controle deslizante divisor de feixe do microscópio esteja configurado para observar através da porta da foto e não através da porta para os olhos. Dependendo do caminho da luz e do espelho, esteja preparado para girar o tecido 180° no palco para uma orientação adequada.

6. Aquisição de imagens utilizando fotografia de fundo de olho colorido ex vivo

1. Com a epi-iluminação ligada, ajuste a ampliação para que toda a incisão trefina de 18 mm ocupe todo o campo de visão. Aumente a ampliação para que seja possível focar no fundo da fossa foveal. Reduza a ampliação para a configuração anterior.
2. Ajuste as configurações ISO na faixa de 1.600-3.000 para que os tempos de exposição caiam na faixa central do medidor na câmera.
3. Pressione o gatilho do obturador remoto. Ouça o espelho para travar na posição de cima. Pressione o gatilho novamente para exposição.
4. Observe a imagem no monitor, com os metadados predefinidos mostrando vermelho, verde, azul (RGB) e um histograma colorido para a exposição correta. Se a exposição for aceitável, prossiga; Caso contrário, exclua, reavalie os parâmetros e crie novas imagens.
5. Desligue as lâmpadas de pescoço de ganso para epi-iluminação para destacar drusen, e ligue o flash, com uma exposição de 1/4 s, uma velocidade do obturador da câmera de 1/250 s e um ISO de 100-320. Defina a velocidade do flash para o padrão ou modifique-a durante a configuração inicial da câmera. Adquira uma imagem e verifique o histograma para uma exposição adequada.
6. Desligue o flash e ligue a fonte de luz de transiluminação. Redefina o ISO para acima de 5.000 e garanta que o tempo de exposição não fique abaixo de 1/30 s devido a possíveis vibrações no sistema fotográfico. Adquira uma imagem e verifique o histograma para uma exposição adequada.
7. Aumente a ampliação para visualizar a ONH e a fóvea no campo de visão. Ligue as lâmpadas de epi-iluminação. Defina o intervalo ISO para 1.600-3.000. Certifique-se de que os tempos de exposição caiam na faixa central da câmera.
8. Desligue as lâmpadas de epi-iluminação e ligue o flash, com uma exposição de 1/4 s, a velocidade predefinida do obturador da câmera definida como 1/250 s e o ISO definido como 400-800. Adquira uma imagem e verifique o histograma para uma exposição adequada.
9. Desligue o flash e ligue a transiluminação usando a base de campo escuro. Redefina o ISO para acima de 5.000. Certifique-se de que o tempo de exposição não seja mais lento do que 1/30 s devido a vibrações potenciais no sistema fotográfico. Adquira uma imagem e verifique se há um histograma adequado.
10. Desligue a transiluminação e ligue as lâmpadas de epi-iluminação novamente.
11. Aumente a ampliação para a utilizada no passo 6.7. Reconcentre-se se necessário.
12. Aumente o ISO dentro da faixa de 3.000-6.000 e ajuste o tempo de exposição para ficar dentro da faixa de exposição adequada da câmera. Adquira uma imagem.
    Observação : o grânulo rubi pode não aparecer mais no campo de exibição. Em caso afirmativo, capture imagens separadas do talão nesta ampliação para referência.
13. Desligue as lâmpadas de epi-iluminação. Ligue o flash com uma exposição de 1/4 s e com a velocidade do obturador da câmera para 1/250 s. Defina a velocidade do flash para o padrão ou altere-a durante a configuração inicial da câmera e defina o ISO como 500-1.000. Adquira a imagem. Verifique o histograma para a exposição adequada.
14. Desligue o flash e ligue as lâmpadas de transiluminação. Redefina o ISO para acima de 8.000 para permitir um tempo de exposição mais rápido com um sensor de imagem mais sensível. Certifique-se de que o tempo de exposição não fique abaixo de 1/30 s devido a vibrações potenciais no sistema fotográfico. Adquira uma imagem.
15. Exporte as imagens da câmera para um computador. Revise as imagens antes de remover o espécime do estágio do microscópio caso algum precise ser capturado novamente.

7. Visão geral da aquisição de imagens para OCT ex vivo e oftalmoscopia a laser de varredura (SLO)

1. Para OCT de domínio espectral, coloque os globos em tampão fosfato em um suporte de olho personalizado com uma câmara com uma lente de 60 dioptrias³⁵. Monte o suporte ocular em um suporte em um dispositivo de imagem clínica da OCT e conecte-o ao local onde o paciente descansaria a testa. O dispositivo OCT insere automaticamente uma barra de escala em cada imagem.
2. Ao mesmo tempo, usando o mesmo dispositivo e com o olho ainda no suporte, crie imagens dos globos com um oftalmoscópio a laser de varredura (SLO) usando reflectância no infravermelho próximo (NIR, usada como imagem localizadora pelo software de residência), autofluorescência de fundo de excitação de 488 nm (FAF) e reflectância livre de vermelho (RF).
   NOTA: O FAF de excitação de 787 nm neste dispositivo só é ocasionalmente adequado porque um divisor de feixe reduz a transmitância da luz para o SLO. Por esta razão, um segundo dispositivo para imagens FAF de 787 nm (ver próximo ponto) é usado.
3. Separadamente, mas com o olho ainda no suporte ocular, imagine os globos com FAF de 787 nm para detectar distúrbio de EPR³⁶ usando um dispositivo separado que exibe bem essa modalidade.

8. Protocolo de aquisição de imagens para OCT/SLO ex vivo (ver slides no Material Suplementar 2)

1. Indicar o músculo reto superior com corante tecidual marcador. Ligue o laser (seta azul, Material Suplementar 2, página 1).
2. Referindo-se à página 2 do Material Suplementar 2, posicione a cabeça do OCT movendo toda a unidade em dois eixos em relação à base (seta verde) e, em seguida, elevando a altura (y) girando o joystick no sentido horário/anti-horário (cw/ccw, setas azuis). Foque a imagem girando o botão (seta laranja), com a alavanca preta na posição R (*). Bloqueie a unidade prendendo o parafuso do polegar (seta roxa).
3. Inserir o olho no suporte e estabilizar a partir da face posterior com espaçadores (Material Suplementar 1, página 13). Exerça o mínimo de pressão possível para evitar amassar a esclera. Orientar com a marcação tecidual para o músculo reto superior voltado para cima.
   NOTA: A distância aproximada da frente do suporte ocular ao dispositivo OCT é de 25 mm.
4. Abra o software proprietário de visualização e análise para o dispositivo OCT. Uma lista de pacientes aparecerá na coluna da esquerda. Os doadores de olhos indexados por um número de código interno são os "pacientes". Consulte o manual do usuário do fabricante.
5. Selecione o ícone Novo paciente . Preencha as informações de dados do paciente conforme necessário. Selecione OK. Use um sistema de numeração logicamente ordenado para olhos individuais, como YYYYNNNL,R_agesex. Por exemplo, isso pode ser 2017016R_97F.
6. Depois de continuar a entrada de dados na janela a seguir, pressione OK. Selecione o operador e estude no menu suspenso.
   Observação : as informações inseridas aparecerão nos metadados exportáveis.
7. Depois de visualizar uma tela em branco, toque no botão amarelo para iniciar a aquisição da imagem.
8. Pressione IR + OCT (refletância no infravermelho próximo + OCT). Permitir que o laser adquira uma imagem SLO ao vivo do fundo de olho e OCT B-scan.
   1. Finalize a posição anatômica correta com base na ONH e na fóvea e use um aplicador de madeira para ajustar a posição dos olhos no suporte. No painel de controle, gire o botão redondo preto para ajustar a intensidade.
   2. Pressione o mesmo botão para uma média de 9-100 quadros (setas vermelhas; 9 é suficiente, 100 parece cremoso). Se a unidade estiver orientada corretamente, o fundo de olho deve estar em foco, e o OCT B-scan deve aparecer no terço superior do visor (Material Suplementar 2, página 9, seta vermelha dupla).
   3. Na imagem do fundo, use o cursor para mover a linha azul para centralizar a fóvea (Material Suplementar 2, página 9, seta branca). Pressione Adquirir.
      Observação : outros botões padrão são Retina, EDI (desativado) e verificação de linha.
9. Pressione RF + OCT para a próxima aquisição. Verifique novamente a posição para garantir que a imagem não tenha sido movida ou degradada. Pressione o botão preto para obter a média. Pressione Adquirir.
10. Alterne o cubo interno para obtenção de imagens de autofluorescência para os comprimentos de onda de excitação de 488 nm e 787 nm (Material Suplementar 2, página 10).
    Observação : A posição do cubo após a opção é mostrada.
11. Selecione Modo de fluorescência automática . Verifique novamente o alinhamento. Pressione Adquirir.
12. Para casos suspeitos de ruptura e atrofia do EPR, selecione ICGA (angiografia verde com indocianina ) para autofluorescência de 787 nm. Verifique novamente a posição dos olhos e pressione Adquirir.
    OBS: Uma imagem de fundo de olho muitas vezes não aparece nesta modalidade porque o cubo interno atenua o feixe.
13. Alterne o cubo interno de volta para R para IR e imagens livres vermelhas para aquisição de volume.
    NOTA: A posição do cubo após o interruptor é mostrada na página 13 do Material Suplementar 2.
14. Para adquirir os volumes da OCT, selecione IR e a configuração de volume. Corresponda a todas as configurações na página 14 do Material Suplementar 2 alternando os botões apropriados no módulo de controle (cubo de mácula de 30°, espaçamento de 30 μm, média dependendo dos requisitos experimentais).
15. Observe que a visão do fundo de reflectância no infravermelho próximo é coberta por linhas azuis de varredura B. Verifique novamente a posição da OCT no terço superior da janela direita. Pressione Acquire no módulo de controle e aguarde 5 min até que a varredura de volume seja concluída. Quando a aquisição da imagem estiver concluída, selecione EXIT. As imagens serão salvas (seta vermelha).
    Observação : as linhas azuis delimitam as distâncias mostradas na exibição anterior em micrômetros. As varreduras começam a numeração de baixo (inferior) e prosseguem para cima. Observe a progressão da linha vermelha.
16. Permitir que o computador processe as imagens adquiridas, que aparecerão na tela (Material Suplementar 2, página 16).
17. Ao obter imagens dos olhos de um doador, não altere a posição do suporte de montagem entre os olhos. Se o olho esquerdo for fotografado primeiro, os resultados serão mostrados na coluna OD (olho direito). Clique com o botão direito do mouse para selecionar todas as imagens e, em seguida, selecione Exchange OS/OD. As imagens serão deslocadas para a coluna do sistema operacional.
18. Pressione Select > janela > banco de dados. O padrão da tela é o painel 6 com a adição do olho doador fotografado na coluna da direita (Material Suplementar 2, página 18). Clique com o botão direito do mouse no paciente no menu suspenso, escolha Lote e exporte o arquivo E2E.
19. Navegue até a pasta pré-determinada criada na área de trabalho para transferências de arquivos. Selecione OK. A pasta contém os arquivos E2E a serem copiados em um disco rígido externo e arquivados.
20. Traga o olho em seu suporte para o oftalmoscópio a laser de varredura, que é usado principalmente para autofluorescência de 787 nm.
    NOTA: consulte o guia do usuário do fabricante para a aquisição e arquivamento das imagens.
21. Ligue o computador e o laser.
22. Selecione o ícone Novo paciente . Preencha os dados do paciente conforme necessário.
23. Para manter a folha de dados do olho igual, pressione OK. Como a curva C permanece a mesma, pressione Continuar.
24. Selecione Modo de estudo e digite a senha, se necessário. Mantenha a curva C em 7,7 mm. Pressione Ok.
25. Selecione Continuar para verificar a curva C. Selecione o indicador amarelo para iniciar a câmera.
26. Selecione a posição R . Alinhar e orientar o globo. Selecione o modo IR para focar e orientar como acima.
27. Orientar a cabeça da câmera movendo toda a unidade em dois eixos em relação à base (Material Suplementar 2, página 28, seta verde) e, em seguida, elevando a altura (y) da unidade (setas azuis). Focalize a imagem girando o botão (seta laranja). A alavanca preta está na posição R (*). Depois que essa cabeça estiver na posição, bloqueie a unidade girando o parafuso do polegar (seta roxa).
28. Observe que a tela aparece como mostrado na página 29 do Material Suplementar 2.
29. Mova o botão seletor de R para A. Selecione ICGA (para alcançar autofluorescência de 787 nm) em azul, 100% de intensidade, um campo de visão de 30° e imagem monofásica.
    NOTA: Como o corante verde indocianina , a melanina é excitada pela luz de comprimento de onda de 787 nm.
30. Observe que a tela aparece como mostrado na página 31 do Material Suplementar 2. Pressione o disco preto para obter a média e selecione Adquirir.
31. Escolha Janela > Banco de Dados. Selecione Importar arquivos E2E do dispositivo SLO; Esses arquivos são armazenados em um disco rígido externo e carregados na área de trabalho.
32. Selecione Abrir. Verifique se as marcas são o padrão e selecione OK.
33. Note-se que o paciente passa a contar com duas abas: uma mostrando as imagens adquiridas do SLO (seta azul) e outra mostrando as imagens adquiridas do aparelho OCT (seta vermelha) (Material Suplementar 2, página 34).
34. Clique com o botão direito do mouse na imagem de 786 nm (ICGA) e exporte a imagem para um arquivo rotulado SLO 786 na área de trabalho.
35. Para salvar a imagem SLO de autofluorescência de 786 nm, selecione o paciente e clique com o botão direito do mouse para exportar imagens como arquivos RAW (para arquivos .vol) para uma pasta na área de trabalho.
36. Para exportar imagens do dispositivo OCT para transferência para o computador de arquivamento, copie/cole de RAWEXPORT para uma pasta rotulada RAW.

9. Revisão por imagem

1. Montar as imagens (coloridas, arquivo .vol, imagens SLO) em pastas para cada doador com subpastas para cada olho, e indexar as pastas consecutivamente por ID de laboratório.
2. Registre as impressões teciduais (qualidade, patologia) em um banco de dados para um relatório padronizado.
3. Revise os volumes da OCT exportados com um plug-in interno do ImageJ.
   1. Encontre o centro da fóvea, que pode ser reconhecido pelo centro do mergulho foveal, pela elevação interna das bandas retinianas externas ou pelo ponto mais fino. Na maioria dos casos, eles coincidem, mas nem sempre, pois isso depende da preservação foveal, da variabilidade individual e da presença de patologia.
   2. Encontre uma varredura padrão na perifovea superior (2 mm/67 B-scans de distância na direção superior; ou seja, aumentando o número de varreduras).
   3. Salve uma pilha de .tif de todo o volume para referência rápida no futuro.
   4. Percorra o volume da OCT na íntegra, a partir da varredura 1 (inferior), enquanto registra os números de varredura nos quais os recursos são reconhecidos.
   5. Verifique a área peripapilar, além da mácula.
      NOTA: A atrofia coriorretiniana peripapilar em olhos mais velhos inclui um depósito laminar basal distinto e neovascularização. Esta é uma área comum de alteração pigmentar em olhos míopes e glaucoma, bem como no envelhecimento e DMRI³⁷.
4. Inspecione as fotografias coloridas e vincule quaisquer descobertas às vistas pela OCT, se possível.
   NOTA: Em geral, é mais fácil ver a maioria das descobertas da OCT primeiro. Fotografias coloridas fornecem uma visão ampla da área fora da área no SLO, pigmentação coroidal, incluindo nevos, presença de heme e exsudatos duros, e pigmento preto na DMRI neovascular. O pigmento escuro na fóvea pode representar melanossomas frouxos do segmento anterior e deve ser lavado suavemente com tampão usando uma pipeta.
5. Inspecione as imagens do SLO e vincule quaisquer descobertas às vistas pela OCT, se possível.
6. Salve varreduras B padrão na fóvea e perifovea, varreduras B extras com patologia notável ou outras características e imagens SLO em um relatório de patologia.
7. Categorize os olhos da seguinte forma: Normal, Questionável, DMRI Intermediário Precoce, DMRI Atrófica, DMRI Neovascular, Outra, Desconhecida, Não Graduável, Não Registrada. "Questionável" é usado se não estiver claro se as alterações são graves o suficiente para outra categorização. "Não graduável" é reservado para olhos sem exames úteis de OCT, como aqueles com retinas severamente descoladas. "Não gravado" é reservado para olhos que são processados imediatamente após o recebimento sem fotografia.
8. Use estes critérios para DMRI: alteração grave do EPR com depósitos drusenoides drusenoides ou sub-retinianos, com ou sem sinais de neovascularização, como líquido ou fibrose, e sem evidência de outras causas (atualizado de Curcio et ^al.10 para acomodar SDDs).
   NOTA: O diagnóstico final é confirmado por análise histológica.

Resultados

A Tabela 1 mostra que, durante 2016-2017, foram recuperados 184 olhos de 94 doadores brancos não diabéticos >80 anos de idade. O tempo médio de morte até a preservação foi de 3,9 h (variação: 2,0-6,4 h). Dos 184 olhos revisados, 75 (40,2%) apresentavam DMRI alguma. Foram identificadas as seguintes categorias: Pouco notável (39,7%), Questionável (11,4%), DMRI Intermediário Precoce (22,8%), Atrófica (7,6%), Neovascular (9,8%), Outros (8,7%) e Ignorado/Não Registrado/Não Graduável (<1%).

Discussão

Usando uma abordagem de triagem de base populacional durante um período de 16 meses na era pré-COVID, foi possível obter 75 olhos de doadores com DMRI. Todos foram recuperados com uma DtoP curta e estadiados usando MMI ancorado em OCT. O critério de idade (>80 anos) está fora da faixa etária típica para recuperações teciduais destinadas a córneas transplantáveis. Apesar da idade avançada, nossos critérios resultaram em olhos em todos os estágios da DMRI. Muitos fenótipos de EPR são comuns a todos os está...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12