A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يصف هذا البروتوكول العزل شبه الآلي للجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الدهنية وتحقيق تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. استخدام مفكك الأنسجة لهضم كولاجيناز يقلل من التباين التجريبي ويزيد من التكاثر.

Abstract

تتيح الدراسة المختبرية لتمايز الخلايا الشحمية ذات اللون الأبيض والبني والبيج التحقيق في وظائف الخلايا الشحمية المستقلة للخلايا الشحمية وآلياتها. خطوط خلايا preadipocyte البيضاء الخالدة متاحة للجمهور وتستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن ظهور الخلايا الشحمية البيج في الأنسجة الدهنية البيضاء استجابة للإشارات الخارجية يصعب تلخيصه إلى أقصى حد باستخدام خطوط خلايا الخلايا الشحمية البيضاء المتاحة للجمهور. عادة ما يتم تنفيذ عزل الجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الأولية الأولية وإجراء تمايز الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، فإن فرم وهضم كولاجيناز الأنسجة الدهنية باليد يمكن أن يؤدي إلى تباين تجريبي ويكون عرضة للتلوث. هنا ، نقدم بروتوكولا شبه آلي معدل يستخدم مفكك الأنسجة لهضم الكولاجيناز لتحقيق عزل أسهل ل SVF ، بهدف تقليل التباين التجريبي وتقليل التلوث وزيادة قابلية التكاثر. يمكن استخدام الخلايا الشحمية التي تم الحصول عليها والخلايا الشحمية المتمايزة للتحليلات الوظيفية والآلية.

Introduction

تجذب بيولوجيا الأنسجة الدهنية اهتماما متزايدا بسبب الانتشار المتزايد للسمنة ومرض السكري من النوع 2 على مستوىالعالم 1. تخزن الخلايا الشحمية الطاقة الزائدة في شكل قطرات دهنية ، يتم إطلاقها عند الجوع. علاوة على ذلك ، تحافظ الأنسجة الدهنية على توازن الطاقة الجهازية من خلال العمل كعضو في الغدد الصماء والتواصل مع الأنسجة الأخرى 2,3. ومن المثير للاهتمام أن كلا من الأنسجة الدهنية الزائدة (السمنة) وفقدان الدهون (الحثل الشحمي) مرتبطان بمقاومة الأنسولين ومرض السكري1. تنقسم الخلايا الشحمية إلى ثلاثة أنواع: الأبيض والبني والبيج1. تخزن الخلايا الشحمية ا....

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) بجامعة طوكيو وتم إجراؤها وفقا للإرشادات المؤسسية لجامعة طوكيو.

1. إعداد محلول الانزيم والمتوسطة

  1. ضع جانبي الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (الجانب الأيمن والأيسر ، حوالي 150 ملغ) من فأر عمره 7-8 أسابيع و 2.5 مل من محلول الإنزيم في الأنبوب C من المنفصل.
  2. إعادة تكوين الإنزيم D مع 3 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / F12 بدون مصل بقري جنيني (FBS) أو مضادات حيوية ، والإنزيم R مع 2.7 مل من DMEM / F12 بدون FBS أو المضادات الحيوية ، والإنزيم A مع 1 مل من المخزن المؤقت A.
  3. ....

النتائج

ينتج عن هذا البروتوكول خلايا دهنية متمايزة تماما ومحملة بالدهون بعد 7 أيام من إحداث تمايز الخلايا الشحمية. يمكن تقييم درجة تمايز الخلايا الشحمية عن طريق تلطيخ الزيت الأحمر للدهون الثلاثية والدهون (الشكل 1 أ) ، أو تحليل تعبير mRNA باستخدام qPCR-RT لجينات الخلايا الشحمية ، مثل المنظم الرئيسي لتكو?.......

Discussion

هنا ، وصفنا بروتوكولا لعزل SVF من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا preadipocytes وإجراء تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. أدى استخدام جهاز فصل الأنسجة لهضم الكولاجيناز إلى تقليل التباين التجريبي ، وتقليل خطر التلوث ، وزيادة قابلية التكاثر. في حين أن هذا الإجراء هو خطوة حاسمة ضمن ا?.......

Disclosures

ليس لدى أي من المؤلفين مصلحة مالية منافسة تتعلق بهذا العمل.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا تاكاهيتو وادا وسايكو يوشيدا (جامعة طوكيو ، طوكيو ، اليابان) على مساعدتهم التجريبية. تم تمويل هذا العمل من خلال المنح التالية إلى Y.H.: منحة بحثية من برنامج الباحث الشاب الممتاز بجامعة طوكيو. الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) منحة KAKENHI للعلماء في بداية حياتهم المهنية ، رقم المنحة 19K17976 ؛ منحة للعداء الأول لأبحاث السكري المستقبلية (FFDR) من مؤسسة اليابان لعلم الإنزيمات التطبيقي ، رقم المنحة 17F005 ؛ منحة من مؤسسة البحوث الدوائية ؛ منحة من مؤسسة موتشيدا التذكارية للبحوث الطبية والصيدلانية ؛ منحة من مؤسسة MSD لعلوم الحياة ؛ منحة من مؤسسة دايوا للأوراق المالية الصحية ؛ منحة من مؤسسة طوكيو للبحوث الكيميائية الحيوية ؛ منحة أبحاث علوم الحياة ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm dishCorning430167
12 well plateCorning3513
60 mm dishIWAKI3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and ratMiltenyi Biotec130-105-808contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µmBD falcon#352350
Collagen coated dishes, 100 mmBD#356450
Collagen coated dishes, 60 mmBD#354401
Collagen I Coat Microplate 6 wellIWAKI4810-010
DexamethasoneWako041-18861
Dissecting ForcepsN/AN/Aautoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharpN/AN/Aautoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharpN/AN/Aautoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementGibco10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)N/AN/A
gentleMACS C TubesMilteny Biotec130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Humulin R Injection U-100Eli Lilly872492
IndomethacinSigmaI7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)Sigma17018-1G
Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019
Neomycin SulfateFujifilm146-08871 
Opti-MEMInvitrogen 31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)Add gene#1780
PBS tabletsTakaraT900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Linecell biolabRV-101
PolybreneNacalai Tesque12996-81
Power Sybr Green Master MixApplied Biosystems4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master MixTOYOBO#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
RosiglitazoneWako180-02653
T3SigmaT2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)Gibco25200-056

References

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

We use cookies to enhance your experience on our website.

By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.

Learn More