عزل شبه آلي للجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام مفكك الأنسجة

Summary

يصف هذا البروتوكول العزل شبه الآلي للجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الدهنية وتحقيق تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. استخدام مفكك الأنسجة لهضم كولاجيناز يقلل من التباين التجريبي ويزيد من التكاثر.

Abstract

تتيح الدراسة المختبرية لتمايز الخلايا الشحمية ذات اللون الأبيض والبني والبيج التحقيق في وظائف الخلايا الشحمية المستقلة للخلايا الشحمية وآلياتها. خطوط خلايا preadipocyte البيضاء الخالدة متاحة للجمهور وتستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن ظهور الخلايا الشحمية البيج في الأنسجة الدهنية البيضاء استجابة للإشارات الخارجية يصعب تلخيصه إلى أقصى حد باستخدام خطوط خلايا الخلايا الشحمية البيضاء المتاحة للجمهور. عادة ما يتم تنفيذ عزل الجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الأولية الأولية وإجراء تمايز الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، فإن فرم وهضم كولاجيناز الأنسجة الدهنية باليد يمكن أن يؤدي إلى تباين تجريبي ويكون عرضة للتلوث. هنا ، نقدم بروتوكولا شبه آلي معدل يستخدم مفكك الأنسجة لهضم الكولاجيناز لتحقيق عزل أسهل ل SVF ، بهدف تقليل التباين التجريبي وتقليل التلوث وزيادة قابلية التكاثر. يمكن استخدام الخلايا الشحمية التي تم الحصول عليها والخلايا الشحمية المتمايزة للتحليلات الوظيفية والآلية.

Introduction

تجذب بيولوجيا الأنسجة الدهنية اهتماما متزايدا بسبب الانتشار المتزايد للسمنة ومرض السكري من النوع 2 على مستوى^{العالم 1}. تخزن الخلايا الشحمية الطاقة الزائدة في شكل قطرات دهنية ، يتم إطلاقها عند الجوع. علاوة على ذلك ، تحافظ الأنسجة الدهنية على توازن الطاقة الجهازية من خلال العمل كعضو في الغدد الصماء والتواصل مع الأنسجة الأخرى ^2,3. ومن المثير للاهتمام أن كلا من الأنسجة الدهنية الزائدة (السمنة) وفقدان الدهون (الحثل الشحمي) مرتبطان بمقاومة الأنسولين ومرض السكري¹. تنقسم الخلايا الشحمية إلى ثلاثة أنواع: الأبيض والبني والبيج¹. تخزن الخلايا الشحمية ا....

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) بجامعة طوكيو وتم إجراؤها وفقا للإرشادات المؤسسية لجامعة طوكيو.

1. إعداد محلول الانزيم والمتوسطة

1. ضع جانبي الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (الجانب الأيمن والأيسر ، حوالي 150 ملغ) من فأر عمره 7-8 أسابيع و 2.5 مل من محلول الإنزيم في الأنبوب C من المنفصل.
2. إعادة تكوين الإنزيم D مع 3 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / F12 بدون مصل بقري جنيني (FBS) أو مضادات حيوية ، والإنزيم R مع 2.7 مل من DMEM / F12 بدون FBS أو المضادات الحيوية ، والإنزيم A مع 1 مل من المخزن المؤقت A.
3. ....

النتائج

ينتج عن هذا البروتوكول خلايا دهنية متمايزة تماما ومحملة بالدهون بعد 7 أيام من إحداث تمايز الخلايا الشحمية. يمكن تقييم درجة تمايز الخلايا الشحمية عن طريق تلطيخ الزيت الأحمر للدهون الثلاثية والدهون (الشكل 1 أ) ، أو تحليل تعبير mRNA باستخدام qPCR-RT لجينات الخلايا الشحمية ، مثل المنظم الرئيسي لتكو?.......

Discussion

هنا ، وصفنا بروتوكولا لعزل SVF من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا preadipocytes وإجراء تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. أدى استخدام جهاز فصل الأنسجة لهضم الكولاجيناز إلى تقليل التباين التجريبي ، وتقليل خطر التلوث ، وزيادة قابلية التكاثر. في حين أن هذا الإجراء هو خطوة حاسمة ضمن ا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056