A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يصف هذا البروتوكول العزل شبه الآلي للجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الدهنية وتحقيق تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. استخدام مفكك الأنسجة لهضم كولاجيناز يقلل من التباين التجريبي ويزيد من التكاثر.
تتيح الدراسة المختبرية لتمايز الخلايا الشحمية ذات اللون الأبيض والبني والبيج التحقيق في وظائف الخلايا الشحمية المستقلة للخلايا الشحمية وآلياتها. خطوط خلايا preadipocyte البيضاء الخالدة متاحة للجمهور وتستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن ظهور الخلايا الشحمية البيج في الأنسجة الدهنية البيضاء استجابة للإشارات الخارجية يصعب تلخيصه إلى أقصى حد باستخدام خطوط خلايا الخلايا الشحمية البيضاء المتاحة للجمهور. عادة ما يتم تنفيذ عزل الجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الأولية الأولية وإجراء تمايز الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، فإن فرم وهضم كولاجيناز الأنسجة الدهنية باليد يمكن أن يؤدي إلى تباين تجريبي ويكون عرضة للتلوث. هنا ، نقدم بروتوكولا شبه آلي معدل يستخدم مفكك الأنسجة لهضم الكولاجيناز لتحقيق عزل أسهل ل SVF ، بهدف تقليل التباين التجريبي وتقليل التلوث وزيادة قابلية التكاثر. يمكن استخدام الخلايا الشحمية التي تم الحصول عليها والخلايا الشحمية المتمايزة للتحليلات الوظيفية والآلية.
تجذب بيولوجيا الأنسجة الدهنية اهتماما متزايدا بسبب الانتشار المتزايد للسمنة ومرض السكري من النوع 2 على مستوىالعالم 1. تخزن الخلايا الشحمية الطاقة الزائدة في شكل قطرات دهنية ، يتم إطلاقها عند الجوع. علاوة على ذلك ، تحافظ الأنسجة الدهنية على توازن الطاقة الجهازية من خلال العمل كعضو في الغدد الصماء والتواصل مع الأنسجة الأخرى 2,3. ومن المثير للاهتمام أن كلا من الأنسجة الدهنية الزائدة (السمنة) وفقدان الدهون (الحثل الشحمي) مرتبطان بمقاومة الأنسولين ومرض السكري1. تنقسم الخلايا الشحمية إلى ثلاثة أنواع: الأبيض والبني والبيج1. تخزن الخلايا الشحمية ا....
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) بجامعة طوكيو وتم إجراؤها وفقا للإرشادات المؤسسية لجامعة طوكيو.
1. إعداد محلول الانزيم والمتوسطة
ينتج عن هذا البروتوكول خلايا دهنية متمايزة تماما ومحملة بالدهون بعد 7 أيام من إحداث تمايز الخلايا الشحمية. يمكن تقييم درجة تمايز الخلايا الشحمية عن طريق تلطيخ الزيت الأحمر للدهون الثلاثية والدهون (الشكل 1 أ) ، أو تحليل تعبير mRNA باستخدام qPCR-RT لجينات الخلايا الشحمية ، مثل المنظم الرئيسي لتكو?.......
هنا ، وصفنا بروتوكولا لعزل SVF من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا preadipocytes وإجراء تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. أدى استخدام جهاز فصل الأنسجة لهضم الكولاجيناز إلى تقليل التباين التجريبي ، وتقليل خطر التلوث ، وزيادة قابلية التكاثر. في حين أن هذا الإجراء هو خطوة حاسمة ضمن ا?.......
ليس لدى أي من المؤلفين مصلحة مالية منافسة تتعلق بهذا العمل.
يود المؤلفون أن يشكروا تاكاهيتو وادا وسايكو يوشيدا (جامعة طوكيو ، طوكيو ، اليابان) على مساعدتهم التجريبية. تم تمويل هذا العمل من خلال المنح التالية إلى Y.H.: منحة بحثية من برنامج الباحث الشاب الممتاز بجامعة طوكيو. الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) منحة KAKENHI للعلماء في بداية حياتهم المهنية ، رقم المنحة 19K17976 ؛ منحة للعداء الأول لأبحاث السكري المستقبلية (FFDR) من مؤسسة اليابان لعلم الإنزيمات التطبيقي ، رقم المنحة 17F005 ؛ منحة من مؤسسة البحوث الدوائية ؛ منحة من مؤسسة موتشيدا التذكارية للبحوث الطبية والصيدلانية ؛ منحة من مؤسسة MSD لعلوم الحياة ؛ منحة من مؤسسة دايوا للأوراق المالية الصحية ؛ منحة من مؤسسة طوكيو للبحوث الكيميائية الحيوية ؛ منحة أبحاث علوم الحياة ....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm dish | Corning | 430167 | |
12 well plate | Corning | 3513 | |
60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
PBS tablets | Takara | T900 | |
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
T3 | Sigma | T2877-100mg | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.