Полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции из белой жировой ткани мыши с помощью тканевого диссоциатора

Резюме

Этот протокол описывает полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции (SVF) из жировой ткани мыши для получения преадипоцитов и достижения дифференцировки адипоцитов in vitro. Использование тканевого диссоциатора для расщепления коллагеназы уменьшает экспериментальную изменчивость и повышает воспроизводимость.

Аннотация

Исследование дифференцировки белых, коричневых и бежевых адипоцитов in vitro позволяет исследовать клеточно-автономные функции адипоцитов и их механизмы. Иммортализированные белые клеточные линии преадипоцитов находятся в открытом доступе и широко используются. Тем не менее, появление бежевых адипоцитов в белой жировой ткани в ответ на внешние сигналы трудно повторить в полной мере с использованием общедоступных клеточных линий белых адипоцитов. Выделение стромально-васкулярной фракции (SVF) из жировой ткани мыши обычно выполняется для получения первичных преадипоцитов и дифференцировки адипоцитов. Однако измельчение и переваривание жировой ткани коллагеназой вручную может привести к экспериментальным изменениям и подвержено загрязнению. Здесь мы представляем модифицированный полуавтоматический протокол, в котором используется тканевый диссоциатор для расщепления коллагеназы для достижения более легкой изоляции SVF с целью уменьшения экспериментальных вариаций, уменьшения загрязнения и повышения воспроизводимости. Полученные преадипоциты и дифференцированные адипоциты могут быть использованы для функционального и механистического анализа.

Введение

Биология жировой ткани привлекает все большее внимание из-за растущей распространенности ожирения и диабета 2 типа во всем мире¹. Адипоциты хранят избыточную энергию в виде липидных капель, которые высвобождаются при голодании. Кроме того, жировая ткань поддерживает системный энергетический гомеостаз, выступая в качестве эндокринного органа и сообщаясь с другими тканями ^2,3. Интересно, что как избыток жировой ткани (ожирение), так и потеря жира (липодистрофия) связаны с резистентностью к инсулину и диабетом¹. Адипоциты делятся на три типа: белые, коричневые и беж....

протокол

Все эксперименты на животных, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Токийского университета и выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами Токийского университета.

1. Приготовление ферментного раствора и среды

1. Поместите обе стороны паховой белой жировой ткани (правая и левая сторона, примерно 150 мг) от 7-8-недельной мыши и 2,5 мл раствора фермента в пробирку С диссоциатора.
2. Восстановите фермент D с помощью 3 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) / F12 без эмбриональной бычьей сыворотки ....

Результаты

Этот протокол дает полностью дифференцированные, насыщенные липидами адипоциты через 7 дней после индуцирования дифференцировки адипоцитов. Степень дифференцировки адипоцитов можно оценить с помощью окрашивания триглицеридов и липидов масляным красным цветом (рис. 1А

Обсуждение

Здесь мы описали протокол выделения SVF из жировой ткани мыши для получения преадипоцитов и выполнения дифференцировки адипоцитов in vitro. Использование тканевого диссоциатора для переваривания коллагеназы уменьшило экспериментальные вариации, снизило риск загрязнения и повысило .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056