使用组织解离器从小鼠白色脂肪组织中半自动分离基质血管部分

摘要

该协议描述了从小鼠脂肪组织中半自动分离基质血管部分（SVF）以获得前脂肪细胞并在 体外实现脂肪细胞分化。使用组织解离剂进行胶原酶消化可减少实验变异并提高可重复性。

摘要

白色、棕色和米色脂肪细胞分化的 体外 研究能够研究脂肪细胞的细胞自主功能及其机制。永生化的白色前脂肪细胞系是公开的，并被广泛使用。然而，使用公开的白色脂肪细胞系很难充分概括白色脂肪细胞响应外部线索在白色脂肪组织中出现米色脂肪细胞。通常从小鼠脂肪组织中分离基质血管部分（SVF）以获得原代前脂肪细胞并进行脂肪细胞分化。然而，用手切碎和胶原酶消化脂肪组织会导致实验变化，并且容易受到污染。在这里，我们提出了一种改进的半自动方案，该方案利用组织解离剂进行胶原酶消化，以实现更容易的SVF分离，目的是减少实验变异，减少污染并提高可重复性。获得的前脂肪细胞和分化的脂肪细胞可用于功能和机理分析。

引言

由于^全球肥胖和2型糖尿病的患病率日益增加，脂肪组织生物学一直受到越来越多的关注1。脂肪细胞以脂滴的形式储存多余的能量，这些脂滴在饥饿时释放。此外，脂肪组织通过充当内分泌器官并与其他组织交流来维持全身能量稳态^2，3。有趣的是，过多的脂肪组织（肥胖）和脂肪损失（脂肪营养不良）都与胰岛素抵抗和糖尿病有关¹。脂肪细胞分为三种类型：白色、棕色和米色¹.白色脂肪细胞主要以脂质的形式储存多余的能量，而棕色和米色的脂肪细胞通过线粒体解偶联蛋白-1（Ucp1）以热量的形式耗散能量^1，4。值得注意的是，米色脂肪细胞（也称为“诱导”棕色脂肪细胞）响应寒冷或交感神经刺激出现在白色脂肪组织中，并表现出与“经典”棕色脂肪细胞重叠但不同的基因表达^模式5。最近，棕色和米色脂肪细胞有望成为抗肥胖和抗糖尿病治疗的潜在靶标，旨在“增强能量耗散”而不是“抑制能量摄入”⁴。支持性地，FTO肥胖变体rs1421085在人类中的风险等位基因，在

研究方案

本协议中描述的所有动物实验均由东京大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并根据东京大学的机构指南进行。

1. 酶溶液和培养基的制备

1. 将来自7-8周龄小鼠的腹股沟白色脂肪组织（右侧和左侧，约150mg）和2.5mL酶溶液放入解离器的管C中。
2. 用 3 mL 不含胎牛血清 （FBS） 或抗生素的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）/F12 复溶酶 D，用不含胎牛血清 （FBS） 或抗生素的 2.7 mL DMEM/F12 复溶酶 R，用不含 FBS 或抗生素的酶 A 复溶酶 A，用 1 mL 缓冲液 A 复溶酶 A。
3. 通过将 100 μL 酶 D、50 μL 酶 R、12.5 μL 酶 A 和 2.35 mL 不含 FBS 或抗生素的 DMEM/F12 加入试管 C 中制备 2.5 mL 酶溶液。

2.脂肪组织的分离

1. 通过颈椎脱位对7-8周龄的雄性C57BL / 6J小鼠（约20g）实施安乐死。
2. 在干净的工作台上，为了分离腹股沟白色脂肪组织，用钝/锋利的剪刀在腹部和下肢切开皮肤。使用锋利/锋利的剪刀从大腿内侧分离脂肪组织。腹股沟脂肪组织的一侧~75毫克。
3. 将分离出的脂肪组织放入冰上装有酶溶液的试管C中，并将管子....

讨论

在这里，我们描述了一种从小鼠脂肪组织中分离SVF以获得前脂肪细胞并在 体外进行脂肪细胞分化的方案。使用组织解离剂进行胶原酶消化减少了实验变异，降低了污染风险，并提高了可重复性。虽然此过程是所提出的协议中的关键步骤，但该过程是高度自动化的，不需要优化。但是，根据小鼠年龄和脂肪组织库，可能需要优化切碎，例如大小碎片或切割时间。

SVF 被称.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056