Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Resumo

O estudo in vitro da diferenciação de adipócitos brancos, marrons e beges permite a investigação das funções autônomas celulares dos adipócitos e seus mecanismos. Linhagens celulares de pré-adipócitos brancos imortalizadas são publicamente disponíveis e amplamente utilizadas. No entanto, a emergência de adipócitos beges no tecido adiposo branco em resposta a pistas externas é difícil de recapitular em toda a extensão usando linhagens de células de adipócitos brancos disponíveis publicamente. O isolamento da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino é comumente realizado para obtenção de pré-adipócitos primários e diferenciação de adipócitos. No entanto, a picagem e digestão manual do tecido adiposo pela colagenase pode resultar em variação experimental e é propensa à contaminação. Apresentamos um protocolo semi-automatizado modificado que utiliza um dissociador tecidual para digestão da colagenase para facilitar o isolamento da FVS, com o objetivo de reduzir a variação experimental, reduzir a contaminação e aumentar a reprodutibilidade. Os pré-adipócitos e adipócitos diferenciados obtidos podem ser utilizados para análises funcionais e mecanísticas.

Introdução

A biologia do tecido adiposo tem atraído cada vez mais atenção devido à crescente prevalência de obesidade e diabetes tipo 2 em todo o^mundo1. Os adipócitos armazenam energia em excesso na forma de gotículas lipídicas, que são liberadas após a fome. Além disso, o tecido adiposo mantém a homeostase energética sistêmica por servir como órgão endócrino e se comunicar com outros tecidos ^2,3. Curiosamente, tanto o excesso de tecido adiposo (obesidade) quanto a perda adiposa (lipodistrofia) estão ligados à resistência à insulina e ao diabetes¹. Os adipócitos são divididos em três tipos: branco, marrom e bege¹. Os adipócitos brancos armazenam principalmente o excesso de energia na forma de lipídios, enquanto os adipócitos marrom e bege dissipam energia na forma de calor via proteína desacopladora mitocondrial-1 (Ucp1)^1,4. Notavelmente, adipócitos beges (também chamados de adipócitos marrons "induzíveis") aparecem no tecido adiposo branco em resposta à estimulação fria ou simpática e exibem padrões de expressão gênica que se sobrepõem, mas são distintos daqueles adipócitos marrons "clássicos"⁵. Recentemente, adipócitos marrons e beges têm sido antecipados como alvos potenciais de tratamentos antiobesidade e antidiabetes que visam "aumentar a dissipação de energia" em vez de "suprimir a ingestão de energia"⁴. De forma favorável, o alelo de risco da variante de obesidade FTO rs1421085 em humanos, que exibe a associação mais forte com maior índice de massa corporal (IMC) entre variantes comuns^6,7 e exibe várias interações gene-ambiente ^8,9, é relatado para regular negativamente a diferenciação e função de adipócitos beges¹⁰. O receptor ativado por proliferadores de peroxissoma γ (PPARγ) é conhecido como um regulador transcricional mestre da adipogênese, sendo necessário e suficiente para a diferenciação dos adipócitos¹¹. Reguladores transcricionais, como o domínio homólogo PRD1-BF1-RIZ1 contendo 16 (PRDM16), o fator 2 inicial de células b (EBF2) e o fator nuclear I-A (NFIA), são cruciais para a diferenciação e função dos adipócitos marrom e bege 12,13,14,15,16,17,18. Por outro lado, a programação gênica do adipócito branco requer reguladores transcricionais, como a proteína intensificadora do tipo transducina 3 (TLE3) e a proteína dedo de zinco 423 (ZFP423)19,20,21.

Sistemas modelo in vitro permitem a realização de estudos moleculares que visam melhorar a compreensão do(s) mecanismo(s) subjacente(s) às funções e disfunções dos adipócitos. Embora^existam linhagens celulares de pré-adipócitos publicamente disponíveis e imortalizadas, como 3T3-L1 e 3T3-F442A22,23,24, a cultura de pré-adipócitos primários e a diferenciação em adipócitos seriam um modelo mais adequado para o estudo da adipogênese in vivo. O isolamento da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino é um método bem conhecido para a obtenção de pré-adipócitos primários^25,26. No entanto, a digestão do tecido adiposo pela colagenase, comumente realizada com agitador bacteriano com cremalheira, pode resultar em variação experimental e é propensa à contaminação^27,28. Aqui, descrevemos um protocolo alternativo que usa um dissociador de tecido suave de triagem celular ativada por magnetismo (MACS) para digestão de colagenase para obter um isolamento mais fácil da SVF.

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Tóquio e realizados de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade de Tóquio.

1. Preparação da solução enzimática e do meio

1. Colocar ambos os lados do tecido adiposo branco inguinal (lado direito e esquerdo, aproximadamente 150 mg) de um camundongo de 7-8 semanas de idade e 2,5 mL de solução enzimática no tubo C do dissociador.
2. Reconstituir a Enzima D com 3 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 sem soro fetal bovino (SFB) ou antibióticos, a Enzima R com 2,7 mL de DMEM/F12 sem SFB ou antibióticos e a Enzima A com 1 mL de tampão A.
3. Preparar 2,5 mL de solução enzimática adicionando 100 μL de Enzima D, 50 μL de Enzima R, 12,5 μL de Enzima A e 2,35 mL de DMEM/F12 sem SFB ou antibióticos no tubo C. Coloque o tubo C com solução enzimática no gelo.

2. Isolamento do tecido adiposo

1. Eutanásia de camundongos C57BL/6J machos de 7-8 semanas de idade (aproximadamente 20 g) por deslocamento cervical.
2. Em um banco limpo, para isolar o tecido adiposo branco inguinal, corte a pele com tesoura romba/afiada no abdômen e em direção aos membros inferiores. Isole o tecido adiposo do interior das coxas usando uma tesoura afiada. Um lado do tecido adiposo inguinal wieghs ~75 mg.
3. Coloque o tecido adiposo isolado no tubo C com solução enzimática sobre gelo e mantenha o tubo dentro da bancada limpa para manter a esterilidade.

3. Picagem e digestão do tecido adiposo

1. No banco limpo, adicionar 2,5 mL de solução enzimática ao tubo C.
2. Pique o tecido adiposo em pequenos pedaços cortando com tesoura afiada/afiada 50 vezes. Corte o tecido adiposo em ~2 mm² pedaços.
3. Feche firmemente a tampa do tubo C, vire o tubo de cabeça para baixo e prenda-o à manga do dissociador de tecido com a tampa. Em seguida, digerir a amostra por ~40 min a 37 °C.
   NOTA: Este estudo utilizou o suave MACS Octo Dissociator with Heaters (Miltenyi Biotec 130-096-427), e o programa pré-instalado "37C_mr_ATDK_1" foi seguido.

4. Filtração da suspensão celular

1. DMEM/F12 pré-aquecido contendo 10% de SFB e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C.
2. Retirar o tubo C do dissociador tecidual e interromper a digestão adicionando 5 mL de DMEM/F12 contendo 10% de SFB e 1% de penicilina-estreptomicina e pipetando suavemente quatro vezes.
3. Centrifugar a 700 x g durante 10 min a 20 °C.
4. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
5. Ressuspender o pellet adicionando 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% e pipetando suavemente cinco vezes.
6. Filtrar a suspensão celular através de um filtro celular de 70 μm de diâmetro colocado em um novo tubo de 50 mL.
7. Centrifugar a 250 x g por 5 min e ressuspender o pellet em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).

5. Revestimento celular

1. Centrifugar a 500 x g por 5 min.
2. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet adicionando 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% e pipetando dez vezes.
3. Colocar a suspensão celular em uma placa revestida com colágeno de 10 cm e colocar as placas em uma incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO 2) por_1-2 h.
   NOTA: Pratos revestidos de colágeno não são absolutamente necessários. No entanto, com base na experiência, as placas revestidas de colágeno ajudam na aderência dos pré-adipócitos e, assim, aumentam a sobrevivência das células.
4. Aspirar o meio e lavar as células duas vezes com 3 mL de PBS por lavagem.
5. Adicionar 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% e retornar os pratos à incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO₂).

6. Passagem de pré-adipócitos

1. No dia seguinte, aspirar o meio (as células estarão aderentes e, portanto, o meio poderá ser aspirado), lavar as células duas vezes com 3 mL de PBS por lavagem e adicionar 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1%.
2. Quando as células atingem 80% de confluência (geralmente 4 dias após o isolamento da FVS), dividem-se as células em quatro placas revestidas de colágeno de 10 cm.
   1. Especificamente, aspirar o meio, lavar as células com PBS (temperatura ambiente [TR]), adicionar 1 mL de tripsina 0,05% pré-aquecida e incubar por 5 min na incubadora de cultura celular.
   2. Adicionar 10 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% para apagar a atividade da tripsina. Após a pipetagem, centrifugar a 440 x g por 5 min.
   3. Aspirar o sobrenadante, ressuspender as células adicionando 40 mL de DMEM/F12 contendo FBS a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% e plaquear as células em quatro placas revestidas com colágeno de 10 cm.
3. Passar as células novamente quando elas atingirem 80% de confluência.

7. Preparação do retrovírus expressando o antígeno T SV40 grande para imortalização de pré-adipócitos (opcional)

1. Pelo menos 3 dias antes da imortalização, a placa Platinum-E (Plat-E) embala as células²⁹ a uma densidade de 3,0 x 10⁵ células/mL em 2 mL de DMEM com SFB a 10% sem antibióticos. Use um hemacitômetro para contar as células.
2. No dia seguinte, transfect 4 μg de pBABE-neo largeTcDNA (adicionar gene plasmid #1780) usando Lipofectamine 2000, de acordo com as instruções do fabricante.
3. Após 24 h, aspirar o meio e adicionar 2 mL de DMEM com SFB a 10% e penicilina-estreptomicina a 1%.
4. No dia seguinte, colher o sobrenadante retroviral. O retrovírus pode ser usado para imortalização imediatamente ou armazenado a -80 °C.

8. Imortalização de pré-adipócitos com antígeno T SV40 grande (opcional)

1. Passar e expandir os pré-adipócitos duas vezes após o isolamento da FVS.
2. Plaquear as células em placas de 6 poços a uma densidade de 0,5-1,0 x 10⁴ células/mL em 2 mL de DMEM/F12 com SFB a 10% e penicilina-estreptomicina a 1%. Use um hemacitômetro para contar as células.
3. No dia seguinte, preparar 250 μL de retrovírus fresco ou descongelado expressando o antígeno T SV40 grande por poço das placas de 6 poços. Centrifugar a 440 x g por 5 min e colocar o sobrenadante em um tubo novo.
4. Adicionar 750 μL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina e 1 μL de polibreno por 250 μL de sobrenadante retroviral para tornar o vírus funcional.
5. Aspirar o meio e adicionar 1.000 μL do retrovírus de trabalho a cada poço contendo pré-adipócitos.
6. Adicionar 1 mL de DMEM/F12 com SFB a 10% e penicilina-estreptomicina a 1% 4 h depois.
7. No dia seguinte, separar os pré-adipócitos infectados em uma placa de 10 cm e selecionar as células infectadas com DMEM/F12 contendo SFB a 10%, penicilina-estreptomicina a 1% e neomicina a 500 μg/mL. Para monitorar a seleção de antibióticos, prepare um prato de células não infectadas com neomicina.
8. Continue a passar as células infectadas com neomicina até que todas as células não infectadas na placa de monitoramento estejam mortas.

9. Diferenciação dos adipócitos

1. Plaquear as células. Para placas de 12 poços, plaquear as células a uma densidade de 4,0 x 10⁴ células/mL em 1 mL de DMEM/F12 contendo 10% de SFB e 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Quando os pré-adipócitos se tornarem confluentes (48-72 h após o plaqueamento), aspirar o meio e substituí-lo por meio de diferenciação (ver Tabela 1 para composição).
3. No dia 2 de diferenciação (ou seja, 48 h após a indução da diferenciação), substitua o meio pelo meio de manutenção (ver Tabela 1 para composição). Depois, troque o meio de manutenção a cada 2 dias. A diferenciação terminal é alcançada no dia 7 da diferenciação.
4. Coloração vermelha do óleo
   1. Para coloração de óleo vermelho, aspirar o meio e enxaguar as células com 1 mL de PBS por poço. Fixar as células adicionando 1 mL de formaldeído a 4% por poço e incubar as células por 15 min na RT.
   2. Durante a incubação, diluir a solução estoque de 0,5% de óleo vermelho o (em álcool isopropílico) para 0,3% usando ddH₂O e filtrar a solução de trabalho usando um papel de filtro.
   3. Após os 15 min de incubação, retirar o formaldeído, enxaguar as células com álcool isopropílico a 60%, adicionar 1 mL de óleo filtrado vermelho o solução de trabalho e incubar por 1 h em TR.
   4. Após a incubação, lave as células com água corrente. Em seguida, observar adipócitos carregados de lipídios em microscópio invertido (aumento: objetiva de 20x e ocular de 10x).
5. Análise da expressão de RNAm
   NOTA: Consulte a Tabela 2 para obter a lista de primers utilizados neste estudo.
   1. Aspirar o meio e adicionar 1 mL/poço de trizol ao poço.
   2. Incubar por 15 min em TR, separar as células por pipetagem e coletar as amostras em tubos de 1,5 mL. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C até a extração do RNA.
   3. Descongelar a amostra congelada para RT, adicionar 200 μL de clorofórmio à amostra e agitar vigorosamente durante 15 s.
   4. Incubar a amostra em TR durante 3 min e, em seguida, girar a 20.000 x g durante 15 min a 4 °C.
   5. Retire cuidadosamente a fase aquosa (superior, incolor) e transfira para novos tubos. Nunca transfira a fase proteica (média, branca) ou a fase fenol/clorofórmio (fundo, rosa).
   6. Adicione lentamente um volume igual de 70% de EtOH e misture delicadamente. Não vórtice.
   7. Coloque a amostra (até 700 μL) em uma coluna de spin de RNA assentada em um tubo de coleta. Certifique-se de incluir qualquer precipitado que possa ter se formado.
   8. Gire a 9.000 x g por 30 s a 4 °C e, em seguida, descarte o fluxo.
   9. Adicionar 700 μL de tampão RW1, girar a 9.000 x g durante 30 s a 4 °C e, em seguida, eliminar o fluxo.
   10. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta e adicione 500 μL de PSE tampão.
   11. Gire a 9.000 x g por 30 s a 4 °C e, em seguida, descarte o fluxo.
   12. Adicionar 500 μL de PSE tampão, girar a 9.000 x g durante 2 minutos a 4 °C e, em seguida, eliminar o fluxo.
   13. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta e gire (colunas sem tampão) a 9.000 x g por 1-2 min a 4 °C.
   14. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 1,5 mL e adicione 30 μL de água livre de RNase diretamente na membrana da coluna.
   15. Incubar a amostra em TR por 1-2 min. Em seguida, gire a 9.000 x g por 1 min a 4 °C para eluir o RNA.
   16. Verifique a concentração de RNA usando um fluoroespectrômetro.
       NOTA: Recomenda-se alinhar a concentração aqui.
   17. Execute a transcrição reversa usando ~200 ng de modelo de RNA. Use um kit comercial quantitativo de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR-RT) e siga o protocolo do fabricante. Após a reação, diluir o cDNA 20 vezes para 200 μL.
   18. Adicionar 2,0 μL de cDNA, 3,0 μL de Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL de 100 μM de primer direto qPCR, 0,018 μL de primer reverso qPCR 100 μM e 0,96 μL de ddH2O a cada poço de uma placa de 384 poços.
   19. Execute um qPCR (segure o estágio: 50°C por 2 min e 95 °C por 2 min; Estágio de PCR: 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min; estágio da curva de fusão: 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min e 95 °C por 15 s). Use o método de curva padrão para quantificação.

Resultados

Este protocolo produz adipócitos totalmente diferenciados e carregados de lipídios 7 dias após a indução da diferenciação dos adipócitos. O grau de diferenciação dos adipócitos pode ser avaliado pela coloração vermelho óleo de triglicérides e lipídios (Figura 1A), ou análise da expressão de RNAm por meio de qPCR-RT de genes de adipócitos, como o regulador mestre da adipogênese Pparg e seu alvo Fabp4 (Figura 1B). Para induzir...

Discussão

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de isolamento da FVS do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de dissociador tecidual para digestão da colagenase diminuiu a variação experimental, diminuiu o risco de contaminação e aumentou a reprodutibilidade. Embora esse procedimento seja uma etapa crítica dentro do protocolo apresentado, o processo é altamente automatizado e a otimização não é necessária. No entanto, dependendo da idade ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056