조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

요약

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

초록

흰색, 갈색 및 베이지색 지방세포 분화에 대한 시험관 내 연구를 통해 지방세포의 세포 자율 기능과 그 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 불멸화 된 백색 지방 전구 세포 세포주는 공개적으로 이용 가능하며 널리 사용됩니다. 그러나 외부 신호에 대한 반응으로 백색 지방 조직에서 베이지색 지방세포의 출현은 공개적으로 이용 가능한 백색 지방세포 세포주를 사용하여 완전히 재현하기 어렵습니다. 쥐 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리는 일반적으로 1 차 지방 전구 세포를 얻고 지방 세포 분화를 수행하기 위해 실행됩니다. 그러나 손으로 지방 조직을 다듬고 콜라게나제를 분해하면 실험적 변형이 발생할 수 있으며 오염되기 쉽습니다. 여기에서 우리는 실험 변형을 줄이고 오염을 줄이며 재현성을 높이기 위해 SVF를 더 쉽게 분리하기 위해 콜라게나제 소화를 위한 조직 해리기를 활용하는 수정된 반자동 프로토콜을 제시합니다. 얻어진 지방전구세포와 분화된 지방세포는 기능적 및 기계론적 분석에 사용할 수 있습니다.

서문

지방 조직 생물학은 전 세계적으로 비만과 제2형 당뇨병의 유병률이 증가함에 따라 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다¹. 지방 세포는 기아 시 방출되는 지질 방울의 형태로 과도한 에너지를 저장합니다. 또한, 지방 조직은 내분비 기관으로 작용하고 다른 조직과 소통함으로써 전신 에너지 항상성을 유지한다 ^2,3. 흥미롭게도, 과도한 지방 조직(비만)과 지방 손실(지방이영양증)은 모두 인슐린 저항성 및 당뇨병과 관련이 있습니다¹. 지방세포는 흰색, 갈색, 베이지색의 세 가지 유형으로 나뉩니다¹. 백색 지방세포는 주로 과잉 에너지를 지질로 저장하는 반면, 갈색 및 베이지색 지방세포는 미토콘드리아 분리 단백질-1(Ucp1)을 통해 열의 형태로 에너지를 발산합니다.^1,4. 특히, 베이지색 지방세포("유도성" 갈색 지방세포라고도 함)는 차가운 자극 또는 교감신경 자극에 반응하여 백색 지방세포에 나타나며, "고전적인" 갈색 지방세포와 겹치지만 구별되는 유전자 ....

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 모든 동물 실험은 도쿄 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 도쿄 대학의 기관 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 효소액 및 배지의 제조

1. 7-8주령 마우스의 사타구니 백색 지방 조직 양쪽(좌우, 약 150mg)과 효소 용액 2.5mL를 해리기의 튜브 C에 넣습니다.
2. 소 태아 혈청(FBS) 또는 항생제가 없는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)/F12 3mL, FBS 또는 항생제가 없는 DMEM/F12 2.7mL의 효소 R, 완충액 A 1mL로 효소 A를 재구성합니다.
3. 효소 D 100μL, 효소 R 50μL, 효소 A 12.5μL, FBS 또는 항생제가 없는 DMEM/F12 2.35mL를 튜브 C에 넣어 효소액 2.5mL를 준비합니다.

2. 지방 조직의 분리

1. 7-8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(약 20g)를 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다.
2. 깨끗한 벤치에서 사타구니 백색 지방 조직을 분리하기 위해 복부와 하지를 향해 뭉툭하고 날카로운 가위로 피부를 ....

토론

여기에서 우리는 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 수행하기 위해 쥐 지방 조직으로부터 SVF를 분리하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 콜라게나제 분해를 위한 조직 해리제의 사용은 실험 변형을 감소시키고 오염 위험을 줄이며 재현성을 증가시켰습니다. 이 절차는 제시된 프로토콜 내에서 중요한 단계이지만 프로세스는 고도로 자동화되어 있으며 최적화가 필요하지.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056