Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Özet

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Özet

Beyaz, kahverengi ve bej adiposit farklılaşmasının in vitro çalışması, adipositlerin hücre-otonom fonksiyonlarının ve mekanizmalarının araştırılmasını sağlar. Ölümsüzleştirilmiş beyaz preadiposit hücre hatları halka açıktır ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, dış ipuçlarına yanıt olarak beyaz yağ dokusunda bej adipositlerin ortaya çıkmasının, halka açık beyaz adiposit hücre hatlarını kullanarak tam olarak özetlenmesi zordur. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan izolasyonu genellikle primer preadipositleri elde etmek ve adiposit diferansiyasyonunu gerçekleştirmek için uygulanır. Bununla birlikte, yağ dokusunun elle kıyılması ve kollajenaz sindirimi deneysel varyasyonlara neden olabilir ve kontaminasyona eğilimlidir. Burada, deneysel çeşitliliği azaltmak, kontaminasyonu azaltmak ve tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla SVF'nin daha kolay izolasyonunu sağlamak için kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanan modifiye yarı otomatik bir protokol sunuyoruz. Elde edilen preadipositler ve farklılaşmış adipositler fonksiyonel ve mekanik analizler için kullanılabilir.

Giriş

Yağ dokusu biyolojisi, obezite ve tip 2 diyabet prevalansının küresel olarak artması nedeniyle giderek artan bir ilgi çekmektedir¹. Adipositler, fazla enerjiyi, açlıktan sonra salınan lipit damlacıkları şeklinde depolar. Ayrıca, yağ dokusu endokrin bir organ görevi görerek ve diğer dokularla iletişim kurarak sistemik enerji homeostazını korur ^2,3. İlginçtir ki, hem aşırı yağ dokusu (obezite) hem de yağ kaybı (lipodistrofi) insülin direnci ve diyabet¹ ile bağlantılıdır. Adipositler üç türe ayrılır: beyaz, kahverengi ve bej¹. Beyaz adipositl....

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm hayvan deneyleri, Tokyo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Tokyo Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir.

1. Enzim çözeltisinin ve ortamının hazırlanması

1. Kasık beyaz yağ dokusunun her iki tarafını (sağ ve sol taraf, yaklaşık 150 mg) 7-8 haftalık bir fareden ve 2.5 mL enzim çözeltisini dissosiyatörün tüp C'sine koyun.
2. Fetal sığır serumu (FBS) veya antibiyotik olmadan 3 mL Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM)/F12 ile D enzimini, FBS veya antibiyotik olmadan 2,7 mL DMEM/F12 ile Enzim R'yi ve....

Tartışmalar

Burada, preadipositler elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu gerçekleştirmek için SVF'nin murin yağ dokusundan izole edilmesi için bir protokol tanımlandı. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısının kullanılması, deneysel çeşitliliği azalttı, kontaminasyon riskini azalttı ve tekrarlanabilirliği arttırdı. Bu prosedür sunulan protokol içinde kritik bir adım olsa da, süreç son derece otomatiktir ve optimizasyona gerek yoktur. Bununla birlikte, fare yaşına ve ya?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056