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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Abstract

Lo studio in vitro della differenziazione degli adipociti bianchi, marroni e beige consente lo studio delle funzioni autonome cellulari degli adipociti e dei loro meccanismi. Le linee cellulari di preadipociti bianchi immortalizzati sono pubblicamente disponibili e ampiamente utilizzate. Tuttavia, l'emergere di adipociti beige nel tessuto adiposo bianco in risposta a segnali esterni è difficile da ricapitolare nella misura completa utilizzando linee cellulari di adipociti bianchi disponibili al pubblico. L'isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino viene comunemente eseguito per ottenere preadipociti primari ed eseguire la differenziazione degli adipociti. Tuttavia, la tritatura e la digestione della collagenasi del tessuto adiposo a mano possono provocare variazioni sperimentali ed è soggetta a contaminazione. Qui, presentiamo un protocollo semi-automatico modificato che utilizza un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi per ottenere un più facile isolamento della SVF, con l'obiettivo di ridurre la variazione sperimentale, ridurre la contaminazione e aumentare la riproducibilità. I adipociti ottenuti e gli adipociti differenziati possono essere utilizzati per analisi funzionali e meccanicistiche.

Introduzione

La biologia del tessuto adiposo ha attirato un'attenzione sempre maggiore a causa della crescente prevalenza dell'obesità e del diabete di tipo 2 a livello globale1. Gli adipociti immagazzinano l'energia in eccesso sotto forma di goccioline lipidiche, che vengono rilasciate per fame. Inoltre, il tessuto adiposo mantiene l'omeostasi energetica sistemica fungendo da organo endocrino e comunicando con altri tessuti 2,3. Curiosamente, sia l'eccesso di tessuto adiposo (obesità) che la perdita adiposa (lipodistrofia) sono legati all'insulino-resistenza e al diabete1. Gli adipociti sono divisi in tre tipi: bianco, marrone e beige1. Gli adipociti bianchi immagazzinano principalmente l'energia in eccesso come lipidi, mentre gli adipociti marroni e beige dissipano l'energia sotto forma di calore attraverso la proteina di disaccoppiamento mitocondriale-1 (Ucp1)1,4. In particolare, gli adipociti beige (chiamati anche adipociti bruni "inducibili") compaiono nel tessuto adiposo bianco in risposta alla stimolazione fredda o simpatica e mostrano modelli di espressione genica che si sovrappongono ma sono distinti da quelli degli adipociti bruni "classici"5. Recentemente, gli adipociti marroni e beige sono stati anticipati come potenziali bersagli di trattamenti anti-obesità e anti-diabete volti a "migliorare la dissipazione di energia" piuttosto che "sopprimere l'apporto energetico"4. Supportivamente, l'allele di rischio della variante dell'obesità FTO rs1421085 nell'uomo, che mostra la più forte associazione con un indice di massa corporea (BMI) più elevato tra le varianti comuni6,7 e mostra varie interazioni gene-ambiente 8,9, è riportato per regolare negativamente la differenziazione e la funzione degli adipociti beige10. Il recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi γ (PPARγ) è noto come regolatore trascrizionale principale dell'adipogenesi ed è necessario e sufficiente per la differenziazione degli adipociti11. I regolatori trascrizionali, come il dominio omologo PRD1-BF1-RIZ1 contenente 16 (PRDM16), il fattore precoce delle cellule b 2 (EBF2) e il fattore nucleare I-A (NFIA), sono cruciali per la differenziazione e la funzione degli adipociti marroni e beige 12,13,14,15,16,17,18. D'altra parte, la programmazione genica degli adipociti bianchi richiede regolatori trascrizionali, come la proteina enhancer transducina-simile 3 (TLE3) e la proteina delle dita di zinco 423 (ZFP423)19,20,21.

I sistemi modello in vitro consentono di eseguire studi molecolari che mirano a migliorare la comprensione dei meccanismi alla base delle funzioni e delle disfunzioni degli adipociti. Sebbene le linee cellulari di preadipociti pubblicamente disponibili e immortalate come 3T3-L1 e 3T3-F442A esistano22,23,24, la coltura di preadipociti primari e la differenziazione in adipociti sarebbe un modello più adatto per lo studio dell'adipogenesi in vivo. L'isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino è un metodo ben noto per ottenere i preadipociti primari25,26. Tuttavia, la digestione della collagenasi del tessuto adiposo, che viene comunemente eseguita utilizzando uno shaker batterico con una cremagliera tubiera, può provocare variazioni sperimentali ed è soggetta a contaminazione27,28. Qui, descriviamo un protocollo alternativo che utilizza un dissociatore tissutale MACS (Gentle magnetic-activated cell sorting) per la digestione della collagenasi per ottenere un più facile isolamento della SVF.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Tokyo ed eseguiti secondo le linee guida istituzionali dell'Università di Tokyo.

1. Preparazione della soluzione enzimatica e del mezzo

  1. Mettere entrambi i lati del tessuto adiposo bianco inguinale (lato destro e sinistro, circa 150 mg) da un topo di 7-8 settimane e 2,5 ml di soluzione enzimatica nel tubo C del dissociatore.
  2. Ricostituire l'enzima D con 3 ml di terreno di aquila modificato (DMEM)/F12 di Dulbecco senza siero fetale bovino (FBS) o antibiotici, l'enzima R con 2,7 ml di DMEM/F12 senza FBS o antibiotici e l'enzima A con 1 ml di tampone A.
  3. Preparare 2,5 ml di soluzione enzimatica aggiungendo 100 μL di enzima D, 50 μL di enzima R, 12,5 μL di enzima A e 2,35 ml di DMEM/F12 senza FBS o antibiotici nel tubo C. Impostare il tubo C con soluzione enzimatica su ghiaccio.

2. Isolamento del tessuto adiposo

  1. Eutanasia Topi maschi C57BL/6J di 7-8 settimane (circa 20 g) per lussazione cervicale.
  2. In una panca pulita, per isolare il tessuto adiposo bianco inguinale, tagliare la pelle con forbici smussate / affilate sull'addome e verso gli arti inferiori. Isolare il tessuto adiposo dall'interno delle cosce usando forbici affilate / affilate. Un lato del tessuto adiposo inguinale wieghs ~ 75 mg.
  3. Mettere il tessuto adiposo isolato nel tubo C con soluzione enzimatica su ghiaccio e mantenere il tubo all'interno del banco pulito per mantenere la sterilità.

3. Tritamento e digestione del tessuto adiposo

  1. Al banco pulito, aggiungere 2,5 ml di soluzione enzimatica alla provetta C.
  2. Tritare il tessuto adiposo in piccoli pezzi tagliando con forbici affilate / affilate 50 volte. Tagliare il tessuto adiposo in ~ 2 mm2 pezzi.
  3. Chiudere saldamente il cappuccio del tubo C, capovolgere il tubo e fissarlo al manicotto del dissociatore tissutale con il cappuccio. Quindi, digerire il campione per ~40 minuti a 37 °C.
    NOTA: Questo studio ha utilizzato gentleMACS Octo Dissociator with Heaters (Miltenyi Biotec 130-096-427) e il programma preinstallato "37C_mr_ATDK_1" è stato seguito.

4. Filtrazione della sospensione cellulare

  1. DMEM/F12 preriscaldato contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 °C.
  2. Staccare il tubo C dal dissociatore tissutale e interrompere la digestione aggiungendo 5 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e pipettando delicatamente quattro volte.
  3. Centrifugare a 700 x g per 10 minuti a 20 °C.
  4. Aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
  5. Risospendere il pellet aggiungendo 10 ml di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e pipettando delicatamente cinque volte.
  6. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare di 70 μm di diametro posizionato su un nuovo tubo da 50 ml.
  7. Centrifugare a 250 x g per 5 minuti e risospendere il pellet in 10 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).

5. Placcatura cellulare

  1. Centrifugare a 500 x g per 5 min.
  2. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo 10 ml di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e pipettaggio dieci volte.
  3. Placcare la sospensione cellulare su un piatto rivestito di collagene di 10 cm e porre i piatti in un incubatore di coltura cellulare (37 °C, 5% CO 2) per1-2 ore.
    NOTA: I piatti rivestiti di collagene non sono assolutamente necessari. Tuttavia, sulla base dell'esperienza, i piatti rivestiti di collagene aiutano l'aderenza dei preadipociti e quindi aumentano la sopravvivenza delle cellule.
  4. Aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 3 ml di PBS per lavaggio.
  5. Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e riportare i piatti nell'incubatore di coltura cellulare (37 °C, 5% CO2).

6. Passaggio dei preadipociti

  1. Il giorno successivo, aspirare il mezzo (le cellule saranno aderenti, e quindi il mezzo può essere aspirato), lavare le cellule due volte con 3 ml di PBS per lavaggio e aggiungere 10 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
  2. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza (di solito 4 giorni dopo l'isolamento SVF), dividere le cellule in quattro piatti rivestiti di collagene da 10 cm.
    1. In particolare, aspirare il mezzo, lavare le cellule con PBS (temperatura ambiente [RT]), aggiungere 1 ml di tripsina allo 0,05% preriscaldata e incubare per 5 minuti nell'incubatore di coltura cellulare.
    2. Aggiungere 10 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina per estinguere l'attività della tripsina. Dopo il pipettaggio, centrifugare a 440 x g per 5 min.
    3. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule aggiungendo 40 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e placcare le cellule in quattro piatti rivestiti di collagene da 10 cm.
  3. Far passare nuovamente le cellule quando raggiungono l'80% di confluenza.

7. Preparazione di retrovirus che esprimono l'antigene T SV40 per l'immortalizzazione dei preadipociti (opzionale)

  1. Almeno 3 giorni prima dell'immortalizzazione, placcare le celle di confezionamento Platinum-E (Plat-E)29 ad una densità di 3,0 x 105 cellule/ml in 2 ml di DMEM con il 10% di FBS senza antibiotici. Utilizzare un ematocitometro per contare le cellule.
  2. Il giorno successivo, trasfettare 4 μg di pBABE-neo largeTcDNA (aggiungere gene plasmide #1780) usando Lipofectamine 2000, secondo le istruzioni del produttore.
  3. Dopo 24 ore, aspirare il mezzo e aggiungere 2 ml di DMEM con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
  4. Il giorno dopo, raccogli il supernatante retrovirale. Il retrovirus può essere utilizzato per l'immortalizzazione immediatamente o conservato a -80 °C.

8. Immortalizzazione di preadipociti con antigene T grande SV40 (opzionale)

  1. Passaggio ed espansione dei preadipociti due volte dopo l'isolamento SVF.
  2. Placcare le cellule in piastre a 6 pozzetti ad una densità di 0,5-1,0 x 104 cellule / ml in 2 ml di DMEM / F12 con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina. Utilizzare un ematocitometro per contare le cellule.
  3. Il giorno successivo, preparare 250 μL di retrovirus fresco o scongelato che esprime l'antigene T grande SV40 per pozzetto delle piastre a 6 pozzetti. Centrifugare a 440 x g per 5 minuti e posizionare il surnatante in una nuova provetta.
  4. Aggiungere 750 μL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e 1 μL di polibrene per 250 μL di surnatante retrovirale per rendere il virus funzionante.
  5. Aspirare il terreno e aggiungere 1.000 μL del retrovirus funzionante a ciascun pozzetto contenente i preadipociti.
  6. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina 4 ore dopo.
  7. Il giorno successivo, separare i preadipociti infetti in un piatto da 10 cm e selezionare le cellule infette con DMEM / F12 contenenti il 10% di FBS, l'1% di penicillina-streptomicina e 500 μg / mL di neomicina. Per monitorare la selezione degli antibiotici, preparare un piatto di cellule non infette con neomicina.
  8. Continuare a far passare le cellule infette con neomicina fino a quando tutte le cellule non infette nel monitor sono morte.

9. Differenziazione degli adipociti

  1. Placcare le celle. Per piastre a 12 pozzetti, placcare le cellule ad una densità di 4,0 x 104 cellule / ml in 1 ml di DMEM / F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
  2. Quando i preadipociti diventano confluenti (48-72 ore dopo la placcatura), aspirare il mezzo e sostituirlo con il mezzo di differenziazione (vedere Tabella 1 per la composizione).
  3. Al giorno 2 della differenziazione (cioè 48 ore dopo aver indotto la differenziazione), sostituire il mezzo con il mezzo di mantenimento (vedere Tabella 1 per la composizione). Successivamente, cambiare il mezzo di manutenzione ogni 2 giorni. La differenziazione terminale si ottiene al giorno 7 della differenziazione.
  4. Rosso olio o colorazione
    1. Per la colorazione rosso olio, aspirare il mezzo e sciacquare le cellule con 1 ml di PBS per pozzetto. Fissare le cellule aggiungendo 1 ml di formaldeide al 4% per pozzetto e incubare le cellule per 15 minuti a RT.
    2. Durante l'incubazione, diluire la soluzione di brodo rosso olio allo 0,5% (in alcool isopropilico) allo 0,3% usando ddH2O e filtrare la soluzione di lavoro con carta da filtro.
    3. Dopo i 15 minuti di incubazione, rimuovere la formaldeide, sciacquare le cellule con alcool isopropilico al 60%, aggiungere 1 ml di olio filtrato rosso o soluzione di lavoro e incubare per 1 ora a RT.
    4. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con acqua corrente. Quindi, osservare gli adipociti carichi di lipidi al microscopio invertito (ingrandimento: obiettivo 20x e oculare 10x).
  5. Analisi dell'espressione dell'mRNA
    NOTA: Fare riferimento alla Tabella 2 per l'elenco dei primer utilizzati in questo studio.
    1. Aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL/pozzetto di trizolo al pozzetto.
    2. Incubare per 15 minuti a RT, staccare le cellule mediante pipettaggio e raccogliere i campioni in provette da 1,5 ml. I campioni possono essere conservati a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
    3. Scongelare il campione congelato a RT, aggiungere 200 μL di cloroformio al campione e agitare vigorosamente per 15 s.
    4. Incubare il campione a RT per 3 minuti e quindi centrifugare a 20.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
    5. Rimuovere con attenzione la fase acquosa (superiore, incolore) e trasferirla in nuovi tubi. Non trasferire mai la fase proteica (media, bianca) o la fase fenolo/cloroformio (in basso, rosa).
    6. Aggiungere lentamente un volume uguale di 70% di EtOH e mescolare delicatamente. Non vortice.
    7. Caricare il campione (fino a 700 μL) in una colonna di spin di RNA inserita in una provetta di raccolta. Assicurati di includere qualsiasi precipitato che potrebbe essersi formato.
    8. Ruotare a 9.000 x g per 30 s a 4 °C e quindi eliminare il flusso passante.
    9. Aggiungere 700 μL di tampone RW1, centrifugare a 9.000 x g per 30 s a 4 °C e quindi eliminare il flusso passante.
    10. Trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta e aggiungere 500 μL di RPE buffer.
    11. Ruotare a 9.000 x g per 30 s a 4 °C e quindi scartare il flusso in corso.
    12. Aggiungere 500 μL di RPE tampone, ruotare a 9.000 x g per 2 minuti a 4 °C, quindi eliminare il flusso in corso.
    13. Trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta e ruotare (colonne senza buffer) a 9.000 x g per 1-2 minuti a 4 °C.
    14. Trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 mL e aggiungere 30 μL di acqua priva di RNasi direttamente sulla membrana della colonna.
    15. Incubare il campione a RT per 1-2 minuti. Quindi, ruotare a 9.000 x g per 1 minuto a 4 °C per eluire l'RNA.
    16. Controllare la concentrazione di RNA utilizzando un fluorospettrometro.
      NOTA: Si raccomanda di allineare la concentrazione qui.
    17. Eseguire la trascrizione inversa utilizzando ~ 200 ng di modello di RNA. Utilizzare un kit commerciale quantitativo di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR-RT) e seguire il protocollo del produttore. Dopo la reazione, diluire il cDNA 20 volte a 200 μL.
    18. Aggiungere 2,0 μL di cDNA, 3,0 μL di Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL di primer forward qPCR da 100 μM, 0,018 μL di primer inverso qPCR da 100 μM e 0,96 μL di ddH2O a ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.
    19. Eseguire una qPCR (fase di attesa: 50°C per 2 min e 95°C per 2 min; Stadio PCR: 40 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 min; stadio della curva di fusione: 95 °C per 15 s, 60 °C per 1 min e 95 °C per 15 s). Utilizzare il metodo della curva standard per la quantificazione.

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Risultati

Questo protocollo produce adipociti completamente differenziati e carichi di lipidi 7 giorni dopo aver indotto la differenziazione degli adipociti. Il grado di differenziazione degli adipociti può essere valutato mediante la colorazione rosso olio di trigliceridi e lipidi (Figura 1A), o l'analisi dell'espressione dell'mRNA utilizzando qPCR-RT di geni adipocitari, come il regolatore principale dell'adipogenesi Pparg e il suo target Fabp4 (Figura 1B).

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Discussione

Qui, abbiamo descritto un protocollo per l'isolamento della SVF dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti ed eseguire la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi ha ridotto la variazione sperimentale, diminuito il rischio di contaminazione e aumentato la riproducibilità. Sebbene questa procedura sia un passaggio critico all'interno del protocollo presentato, il processo è altamente automatizzato e non è necessaria l'ottimizzaz...

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Divulgazioni

Nessuno degli autori ha un interesse finanziario concorrente relativo a questo lavoro.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare Takahito Wada e Saiko Yoshida (The University of Tokyo, Tokyo, Giappone) per la loro assistenza sperimentale. Questo lavoro è stato finanziato dalle seguenti sovvenzioni a Y.H.: borsa di ricerca dell'Università di Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, numero di sovvenzione 19K17976; sovvenzione per il Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) della Japan Foundation for Applied Enzymology, numero di sovvenzione 17F005; borsa di studio della Fondazione per la Ricerca Farmacologica; sovvenzione della Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; sovvenzione della MSD Life Science Foundation; sovvenzione della Daiwa Securities Health Foundation; sovvenzione della Tokyo Biochemical Research Foundation; Borsa di ricerca Life Science della Takeda Science Foundation; e sovvenzione della SENSHIN Medical Research Foundation.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm dishCorning430167
12 well plateCorning3513
60 mm dishIWAKI3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and ratMiltenyi Biotec130-105-808contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µmBD falcon#352350
Collagen coated dishes, 100 mmBD#356450
Collagen coated dishes, 60 mmBD#354401
Collagen I Coat Microplate 6 wellIWAKI4810-010
DexamethasoneWako041-18861
Dissecting ForcepsN/AN/Aautoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharpN/AN/Aautoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharpN/AN/Aautoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementGibco10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)N/AN/A
gentleMACS C TubesMilteny Biotec130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Humulin R Injection U-100Eli Lilly872492
IndomethacinSigmaI7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)Sigma17018-1G
Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019
Neomycin SulfateFujifilm146-08871 
Opti-MEMInvitrogen 31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)Add gene#1780
PBS tabletsTakaraT900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Linecell biolabRV-101
PolybreneNacalai Tesque12996-81
Power Sybr Green Master MixApplied Biosystems4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master MixTOYOBO#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
RosiglitazoneWako180-02653
T3SigmaT2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)Gibco25200-056

Riferimenti

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