組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

要約

このプロトコルは、マウス脂肪組織から間質血管画分(SVF)を半自動分離して、脂肪前駆細胞を取得し、 in vitroで脂肪細胞分化を達成することを説明しています。コラゲナーゼ消化に組織解離剤を使用すると、実験の変動が減少し、再現性が向上します。

要約

白色、褐色、ベージュ色の脂肪細胞分化の in vitro 研究により、脂肪細胞の細胞自律機能とそのメカニズムの研究が可能になります。不死化白色前駆脂肪細胞株は公に入手可能であり、広く使用されている。しかし、外部の合図に応答して白色脂肪組織にベージュ色の脂肪細胞が出現することは、公開されている白色脂肪細胞株を使用して完全に再現することは困難です。マウス脂肪組織からの間質血管画分(SVF)の単離は、初代前駆脂肪細胞を取得し、脂肪細胞分化を行うために一般的に実行されます。ただし、脂肪組織のミンチおよびコラゲナーゼ消化は、実験上のばらつきをもたらす可能性があり、汚染されやすくなります。ここでは、実験のばらつきを減らし、汚染を減らし、再現性を高めることを目的として、コラゲナーゼ消化に組織解離因子を利用してSVFの分離を容易にする修正された半自動プロトコルを紹介します。得られた前駆脂肪細胞および分化脂肪細胞は、機能的および機構的解析に使用することができる。

概要

脂肪組織生物学は、肥満と2型糖尿病の有病率が世界的に増加しているため、ますます注目を集めています¹。脂肪細胞は過剰なエネルギーを脂肪滴の形で蓄え、飢餓時に放出されます。さらに、脂肪組織は、内分泌器官として機能し、他の組織と通信することにより、全身エネルギー恒常性を維持する^2,3。興味深いことに、過剰な脂肪組織(肥満)と脂肪喪失(脂肪異栄養症)の両方がインスリン抵抗性と糖尿病に関連しています¹。脂肪細胞は、白、茶色、ベージュの3つのタイプに分けられます¹。白色脂肪細胞は主に脂質として過剰なエネルギーを蓄えますが、褐色脂肪細胞とベージュ脂肪細胞はミトコンドリア脱共役タンパク質-1(Ucp1)を介して熱の形でエネルギーを放散します^1,4。特に、ベージュ色の脂肪細胞(「誘導性」褐色脂肪細胞とも呼ばれる)は、冷または交感神経刺激に応答して白色脂肪組織に現れ、「古典的な」褐色脂肪細胞と重複するがそれとは異なる遺伝子発現パターンを示す⁵。近年、褐色やベージュ色の脂肪細胞は、「エネルギー摂取の抑制」ではなく「....

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての動物実験は、東京大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、東京大学の機関ガイドラインに従って実施されました。

1.酵素液および培地の調製

1. 7〜8週齢のマウスの鼠径部白色脂肪組織(右側と左側、約150 mg)の両側と2.5 mLの酵素溶液を解離器のチューブCに入れます。
2. 酵素Dをウシ胎児血清(FBS)または抗生物質を含まない3 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F12で、酵素RをFBSまたは抗生物質を含まない2.7 mLのDMEM/F12で、酵素Aを1 mLのバッファーAで再構成します。
3. チューブCに酵素D100 μL、酵素R50 μL、酵素A12.5 μL、DMEM/F12 2.35 mLを加え、チューブCを酵素溶液で氷上にセットし、酵素溶液を調製します。

2.脂肪組織の分離

1. 頸部脱臼により、7〜8週齢の雄C57BL / 6Jマウス(約20 g)を安楽死させます。.
2. クリーンベンチで、鼠径部の白い脂肪組織を分離するために、腹部と下肢に向かって鈍い/鋭いハサミで皮膚を切ります。鋭利な/鋭いはさみを使用して太ももの内側から脂肪組織を分離します。鼠径脂肪組織の片側は~75mg....

ディスカッション

ここでは、マウス脂肪組織からSVFを単離して脂肪前駆細胞を取得し、 in vitroで脂肪細胞分化を行うためのプロトコルについて説明する。コラゲナーゼ消化に組織解離剤を使用すると、実験のばらつきが減少し、汚染のリスクが減少し、再現性が向上しました。この手順は提示されたプロトコル内の重要なステップですが、プロセスは高度に自動化されており、最適化は必要ありません?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056