نمذجة أورام الدماغ في الجسم الحي باستخدام التوصيل القائم على التثقيب الكهربائي للحمض النووي البلازميد الذي يمثل توقيعات طفرة المريض

Summary

يعد استخدام نموذج الورم الأصلي المختص بالمناعة والمدفوع بطفرات المريض الشائعة للاختبار قبل السريري أمرا بالغ الأهمية لاختبارات العلاج المناعي. يصف هذا البروتوكول طريقة لتوليد نماذج فأر ورم في المخ باستخدام التوصيل القائم على التثقيب الكهربائي للحمض النووي البلازميد الذي يمثل طفرات المريض الشائعة ، وبالتالي توفير نموذج فأر دقيق وقابل للتكرار ومتسقة.

Abstract

تعد نماذج الأورام ضرورية للاختبار قبل السريري لأورام الدماغ من حيث استكشاف علاجات جديدة أكثر فعالية. مع الاهتمام الكبير بالعلاج المناعي ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك نموذج فأر متسق ووثيق الصلة سريريا ومختص بالمناعة لفحص الورم ومجموعات الخلايا المناعية في الدماغ واستجابتها للعلاج. في حين أن معظم النماذج قبل السريرية تستخدم زرع تقويم العظام لخطوط الخلايا السرطانية المنشأة ، فإن نظام النمذجة المقدم هنا يسمح بتمثيل "شخصي" لطفرات الورم الخاصة بالمريض في تطور تدريجي ولكنه فعال من تركيبات الحمض النووي التي يتم إدخالها في خلايا السلائف العصبية المنقسمة (NPCs) في الجسم الحي. تتميز تركيبات الحمض النووي بتحليل الفسيفساء باستخدام طريقة تبادل الكاسيت المزدوج بوساطة إعادة التركيب (MADR) ، مما يسمح بطفرات جسدية أحادية النسخة لطفرات المحرك. باستخدام صغار الفئران حديثي الولادة بين الولادة وعمر 3 أيام ، يتم استهداف الشخصيات غير القابلة للعب من خلال الاستفادة من هذه الخلايا المنقسمة التي تبطن البطينين الجانبيين. الحقن المجهري لبلازميدات الحمض النووي (على سبيل المثال ، مشتقة من MADR ، ترانسبوزونات ، sgRNA الموجهة لكريسبر) في البطينين يتبعها التثقيب الكهربائي باستخدام المجاذيف التي تحيط بمنطقة المنقار في الرأس. عند التحفيز الكهربائي ، يتم امتصاص الحمض النووي في الخلايا المنقسمة ، مع إمكانية الاندماج في الجينوم. تم إثبات استخدام هذه الطريقة بنجاح في تطوير كل من أورام الدماغ لدى الأطفال والبالغين ، بما في ذلك ورم الدماغ الخبيث الأكثر شيوعا ، الورم الأرومي الدبقي. تناقش هذه المقالة وتوضح الخطوات المختلفة لتطوير نموذج ورم في المخ باستخدام هذه التقنية ، بما في ذلك إجراء تخدير صغار الفئران ، إلى الحقن المجهري لمزيج البلازميد ، متبوعا بالتثقيب الكهربائي. مع هذا النموذج الأصلي للفأر المناعي ، سيكون لدى الباحثين القدرة على توسيع مناهج النمذجة قبل السريرية ، في محاولة لتحسين وفحص علاج السرطان الفعال.

Introduction

تعد نماذج أورام دماغ الفئران ضرورية لفهم آليات تكوين ورم الدماغ وعلاجه. تتضمن النماذج الحالية عادة عمليات زرع تحت الجلد أو تقويم العظام سريعة الإنتاج لخطوط الخلايا السرطانية شائعة الاستخدام ، بناء على عدد محدود من الطفرات الدافعة أو نماذج xenograft المشتقة من المريض ، باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة والتي تعيق دراسات العلاج المناعي المناسبة¹،²،^3،4. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي هذه النتائج قبل السريرية إلى إيجابيات كاذبة ، حيث يمكن أن تظهر هذه النماذج تأثيرات علاجية دراماتيكية في كثير من الأحيان استجابة للعلاج ، ولكن هذا لا يترج....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في مركز سيدارز سيناء الطبي (IACUC). تم تربية الفئران mTmG متماثلة الزيجوت مع الفئران C57BL / 6J للحصول على فضلات من الفئران mTmG مختلطة الجنس وغير متجانسة الزيجوت لاستخدامها في البروتوكول التالي. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم تكهرب الفئران بين أيام ما بعد الولادة 0 و 3 (P0-P3).

1. الإعداد الجراحي

1. رش الطاولة الجراحية بمطهر كيميائي (على سبيل المثال ، Vimoba) وامسحه ، متبوعا ب 70٪ من الإيثانول ، وامسحه مرة أخرى.
2. ضع الأدوات / المواد التالية على طاولة الجراحة: الماص....

النتائج

تم استخدام البروتوكول الموصوف أعلاه لتطوير نماذج فأر أورام الدماغ للأطفال والبالغين بنجاح ، مع نشر الأول بتفصيل واسع في Kim et ^al.8. مع التقنية المناسبة والتخطيط الدقيق لتصميم البلازميد ، يكون نجاح تطوير EP للأورام عادة 100٪. علم الأنسجة هو أسرع وأسهل طريقة للتحقق من نجاح إدخال بلاز.......

Discussion

يسمح توصيل الحمض النووي البلازميد القائم على التثقيب الكهربائي باستخدام البيولوجيا الجزيئية في الجسم الحي ، على غرار تلك المستخدمة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، ولكن مع سرعة وتوطين وكفاءة نقل الفيروس⁸،^13،14. ومع ذلك ، مع هذا الأخ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH