Modelado de tumores cerebrales in vivo mediante la administración basada en electroporación de ADN plasmídico que representa las firmas de mutación del paciente

Resumen

La utilización de un modelo tumoral autóctono inmunocompetente impulsado por mutaciones comunes de los pacientes para las pruebas preclínicas es fundamental para las pruebas inmunoterapéuticas. Este protocolo describe un método para generar modelos de ratón con tumores cerebrales utilizando la administración de ADN plasmídico basado en electroporación que representa mutaciones comunes de los pacientes, proporcionando así un modelo de ratón preciso, reproducible y consistente.

Resumen

Los modelos tumorales son fundamentales para las pruebas preclínicas de los tumores cerebrales en términos de explorar tratamientos nuevos y más eficaces. Con un interés significativo en la inmunoterapia, es aún más importante contar con un modelo de ratón consistente, clínicamente pertinente e inmunocompetente para examinar las poblaciones de tumores y células inmunitarias en el cerebro y su respuesta al tratamiento. Si bien la mayoría de los modelos preclínicos utilizan el trasplante ortotópico de líneas celulares tumorales establecidas, el sistema de modelado presentado aquí permite una representación "personalizada" de las mutaciones tumorales específicas del paciente en un desarrollo gradual pero efectivo a partir de construcciones de ADN insertadas en células precursoras neurales (NPC) en división in vivo. Las construcciones de ADN presentan el análisis en mosaico con el método de intercambio de casetes mediado por recombinasa dual (MADR), lo que permite la mutagénesis somática de una sola copia de las mutaciones conductoras. Utilizando crías de ratón recién nacidas entre el nacimiento y los 3 días de edad, los NPC son atacados aprovechando estas células en división que recubren los ventrículos laterales. La microinyección de plásmidos de ADN (p. ej., derivados de MADR, transposones, sgRNA dirigido por CRISPR) en los ventrículos es seguida de electroporación utilizando paletas que rodean la región rostral de la cabeza. Tras la estimulación eléctrica, el ADN es absorbido por las células en división, con el potencial de integrarse en el genoma. El uso de este método se ha demostrado con éxito en el desarrollo de tumores cerebrales pediátricos y adultos, incluido el tumor cerebral maligno más común, el glioblastoma. Este artículo discute y demuestra los diferentes pasos del desarrollo de un modelo de tumor cerebral utilizando esta técnica, incluyendo el procedimiento de anestesia de crías de ratón jóvenes, hasta la microinyección de la mezcla de plásmidos, seguida de electroporación. Con este modelo de ratón autóctono e inmunocompetente, los investigadores tendrán la capacidad de ampliar los enfoques de modelado preclínico, en un esfuerzo por mejorar y examinar el tratamiento eficaz del cáncer.

Introducción

Los modelos de tumores cerebrales murinos son cruciales para comprender los mecanismos de formación y tratamiento de tumores cerebrales. Los modelos actuales suelen incluir trasplantes subcutáneos u ortotópicos producidos rápidamente de líneas celulares tumorales de uso común, basados en un número limitado de mutaciones conductoras o modelos de xenoinjertos derivados de pacientes, utilizando ratones inmunodeficientes que dificultan los estudios de inmunoterapia adecuados 1,2,3,4. Además, estos resultados preclínicos pueden conducir a falsos positivos, en el sentido de que dichos modelos pueden exhibir efectos dramáticos, a menudo curativos, en respuesta a la terapia, pero esto no se traduce en la clínica 2,5,6,7. Tener la capacidad de producir rápidamente modelos de ratón preclínicos modificados genéticamente que reflejen mejor las firmas de mutación de los pacientes es imperativo para mejorar la validez de los resultados preclínicos.

La administración de plásmidos de ADN basada en la electroporación (EP) para inducir mutaciones tanto de pérdida de función (LOF) como de ganancia de función (GOF) permite la generación de dichos modelos. Desarrollamos un método para una representación aún más precisa de las mutaciones conductoras de GOF llamado análisis en mosaico con intercambio de casetes mediado por doble recombinasa, o MADR⁸. Este método permite la expresión de un gen (o genes) de interés de forma controlada y específica del locus en células somáticas⁸. En combinación con otras herramientas moleculares, como las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), se pueden combinar diferentes mutaciones de pacientes para desarrollar modelos de tumores cerebrales de ratón. Este método se ha utilizado para diferentes tumores cerebrales pediátricos, incluidos gliomas y ependimomas⁸, así como modelos de tumores cerebrales en adultos, como el glioblastoma (GBM).

Si bien el método EP de modelado tumoral no es tan común como un trasplante, lo siguiente demuestra hasta ahora la facilidad y la alta reproducibilidad de este sistema de modelado. Los ratones mTmG se utilizan para la inserción del ADN plasmídico MADR ^8,9. Este sistema permite la recombinación de los sitios diana loxP y Flp recombinasa (FRT) localizados en el locus Rosa26 para la posterior inserción del plásmido de ADN donante (es decir, el gen GOF de interés)^8,9. El siguiente protocolo demuestra la sencillez de este método después de una práctica diligente y la capacidad de desarrollar modelos de tumores cerebrales de ratón de una manera autóctona y consistente.

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Protocolo

Todos los procedimientos de este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Cedars Sinai. Los ratones mTmG homocigotos se cruzaron con ratones C57BL/6J para obtener camadas de ratones mTmG heterocigotos de sexo mixto para su uso en el siguiente protocolo. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Las crías de ratón fueron electroporadas entre los días postnatales 0 y 3 (P0-P3).

1. Configuración quirúrgica

1. Rocíe la mesa quirúrgica con desinfectante químico (por ejemplo, Vimoba) y limpie, seguido de etanol al 70 %, y vuelva a limpiar.
2. Coloque los siguientes instrumentos/materiales en la mesa quirúrgica: pipetas capilares de vidrio estirado (consulte la referencia¹⁰ sobre cómo extraer pipetas), tijeras pequeñas, contenedor pequeño de desechos de objetos punzantes de riesgo biológico, pipeta de microlitros y puntas de pipeta, 2 piezas cuadradas cortadas de película de parafina, gel de electrodos, electrodos, soporte para el microinyector y mezcla de plásmidos de ADN (consulte la Tabla de materiales y el archivo complementario 1).
3. Coloque los siguientes accesorios en el equipo en la mesa quirúrgica o en el piso cuando esté indicado: panel de control del microinyector, soporte y enchufe conectados a la máquina, soporte para sostener el soporte del microinyector a un lado (ayuda para soldar), pedal del microinyector (en el piso), electrodos conectados a la máquina y pedal del electrodo (en el piso) (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: El pedal del electrodo se colocó a la derecha del pedal del microinyector como recordatorio del orden de uso.
4. Encienda los paneles de control del microinyector y del electrodo.
   1. Compruebe que los ajustes del microinyector son correctos para el experimento: la presión debe estar entre 220 y 450 hPa, dependiendo de cómo se absorba la mezcla de plásmidos.
   2. Compruebe que los ajustes del panel de electrodos sean correctos para el experimento.
      NOTA: Para el experimento actual (y para la mayoría de nuestros modelos de tumores cerebrales), se utilizan cinco pulsos de 120 V (50 ms; separados por 950 ms).

2. Preparación prequirúrgica

1. Prepare la mezcla de plásmidos en el microinyector.
   1. Recupere una pipeta capilar de vidrio extraída e insértela en el soporte del microinyector. Asegúrese de que la punta esté atornillada para mantenerla en su lugar.
   2. Sostenga el soporte del microinyector en una mano y las tijeras pequeñas con la otra; Coloque la punta de la pipeta sobre un pequeño recipiente para objetos punzocortantes de riesgo biológico. Con las tijeras cerradas, presione ligeramente la pipeta capilar de vidrio alargada. Corte donde se ve la curva, aproximadamente a 2 mm de la abertura. Si el corte parece exitoso, colóquelo con cuidado a un lado.
   3. Coloque el tubo de mezcla de plásmidos disponible en el mercado plano sobre la mesa quirúrgica y ábralo. Coloque la caja de puntas de pipeta u otro elemento detrás de la parte inferior del tubo para mantenerlo estable mientras extrae la mezcla de plásmidos. Coloque la pipeta de vidrio que está unida a la línea del microinyector plana sobre la mesa e insértela suavemente en el tubo de la mezcla de plásmidos, asegurándose de que la punta esté bien en la mezcla cerca del fondo del tubo.
      NOTA: Debido a la succión natural por gravedad, la succión de la mezcla de plásmidos comenzará en la pipeta de vidrio antes de aspirar activamente.
   4. Con la punta de la pipeta de vidrio en la mezcla de plásmidos, utilice el panel del microinyector para aumentar la cantidad que se aspira. A partir de 0, gire la perilla derecha y dial en la dirección negativa hacia -60, esto llevará la mezcla de plásmidos a la pipeta de vidrio. Solo traiga ~ 1 pulgada de mezcla de plásmidos. Vuelva a colocar la perilla en 0 y, a continuación, retire la punta de la pipeta de la mezcla.
      NOTA: No retire la punta de la pipeta de la mezcla mientras esté en la dirección negativa, ya que esto disparará la mezcla hacia el microinyector y posiblemente hacia el tubo.
   5. Pruebe la cantidad de mezcla en una inyección inyectando la mezcla en una tira de película de parafina. Use el pedal y presione una vez para inyectar la mezcla en la película de parafina. Utilice la pipeta ajustada a 1 μL para absorber la mezcla en la película de parafina para ver si es exactamente 1 μL.
      NOTA: Si es ligeramente inferior a 1 μL, se puede aumentar la presión del microinyector. Si la presión se acerca a los 450 hPa y sigue siendo inferior a 1 μL, la abertura de la pipeta de vidrio es demasiado pequeña y será necesario recortarla más. Se sugiere volver a colocar la mezcla de plásmidos en el tubo antes de recortar. A pesar de esto, todavía habrá una mezcla residual en las tijeras, por lo que es imperativo limpiar a fondo las tijeras después con DNase para eliminar cualquier resto de mezcla. Si la inyección es superior a 1 μl, será necesario utilizar y recortar una pipeta de vidrio extraída nueva. Cuando la cantidad de prueba es exactamente de 1 μl, la punta de la pipeta de vidrio tiene el tamaño correcto.
   6. Repita el paso 2.1.4 para extraer una mezcla de plásmidos adicional para el procedimiento, o aproximadamente 2-3 pulgadas en la pipeta de vidrio extraída. Asegúrese de que la mezcla no penetre demasiado en el microinyector donde no se pueda ver el final.
      NOTA: Al dibujar la mezcla de plásmidos, es fundamental evitar las burbujas de aire. Si hay burbujas, es necesario volver a realizar este paso retirando la mezcla de plásmidos de la pipeta de vidrio extraída y comenzando de nuevo. Las burbujas de aire presentes serán perjudiciales para los siguientes pasos al inyectar en el ventrículo del cachorro.
   7. Con la mezcla de plásmidos lista en la pipeta de vidrio extraída, coloque la pipeta preparada a un lado en el soporte de ayuda para soldar y fuera del camino para no tocarla o golpearla accidentalmente.
2. Prepara a los animales para el experimento.
   1. Prepara una cubeta de hielo para anestesiar a los cachorros. Agregue agua a la cubeta de hielo para que se derrita y ayude a enfriar el soporte de anestesia (p. ej., la parte superior de la caja de pipetas).
   2. Coloque la parte superior de la caja sobre el hielo derretido para que se enfríe.
   3. Retire con cuidado a los cachorros de la jaula y colóquelos en la parte superior de la caja enfriada, que permanece en el hielo. Coloque otra parte superior sin apretar sobre la parte inferior para ayudar al proceso de enfriamiento.
   4. Después de 2-3 minutos, revisa a los cachorros. Separe a los cachorros entre sí mientras permanecen en posición prona.
      NOTA: Los cachorros se retorcerán, pero esto disminuirá a medida que la anestesia fría haga efecto. La parte superior de la caja se puede dejar fuera para facilitar la visualización de los cachorros.
   5. Para verificar si la anestesia es adecuada, pellizca la cola del cachorro y busca una reacción. Si hay una reacción, repita el paso 2.2.4. Si no se hace ningún chillido o poco movimiento, el cachorro está listo para el procedimiento.
      NOTA: Los ratones no deben mantenerse en hielo durante períodos prolongados de tiempo, ya que esto afectará su capacidad para recuperarse después del procedimiento. Solo el número de cachorros que pueden ser inyectados y electroporados mientras aún están bajo anestesia debe ponerse en hielo a la vez; Con la experiencia se pueden hacer números mayores.

3. Microinyección de mezcla de plásmidos de ADN en el ventrículo cerebral

1. Coloque un cachorro en la mesa en posición ventral.
2. Tire ligeramente hacia atrás de la parte posterior de la cabeza para visualizar las suturas del cráneo a través de la piel. Encuentra lambda en el cráneo. El ventrículo/sitio de inyección estará a medio camino entre lambda y el ojo.
   NOTA: Lambda es donde se cruzan las suturas sagital y lambdoides. Véase la referencia¹¹ para la identificación de lambda en el cráneo del ratón.
3. Perfore la piel con la punta de la pipeta de vidrio en un ángulo perpendicular (la pipeta está recta hacia el techo). Obsérvese una ligera hendidura cóncava al presionar sobre el cráneo y una resistencia inicial. Una vez perforada y la punta de la pipeta de vidrio asoma a través de la hendidura cóncava, se alcanza el nivel de inyección adecuado.
4. Mantenga la punta de la pipeta de vidrio en su lugar y presione el pedal del microinyector una vez para inyectar 1 μL de la mezcla de plásmidos.
   NOTA: Hay dos maneras de ver claramente que la inyección fue exitosa. Primero, pida a otro miembro del laboratorio que observe cómo la mezcla de plásmidos desciende en la pipeta de vidrio a medida que se inyecta. Además, si se usa verde rápido u otro tinte en la mezcla de plásmidos, el tinte se extenderá visiblemente en el ventrículo debajo de la piel una vez inyectado y es fácilmente visible cuando se sostiene frente a una lámpara quirúrgica.

4. Electroporación

1. Coloque un trozo de película de parafina (un cuadrado) sobre la mesa y exprima el gel del electrodo sobre la película. Cubra las paletas de electrodos con gel de electrodos cepillando una cantidad generosa en cada paleta. Cualquier exceso de gel que gotee se puede deslizar sobre una toalla de papel.
   NOTA: Después del primer EP, no permita que el gel de cada paleta toque el otro lado. Esto transferirá la carga y, cuando se aplique a la cabeza del cachorro, se puede escuchar un sonido chisporroteante. Esto también sucederá si el gel en la cabeza del cachorro de un electrodo entra en contacto con el gel de otro.
   PRECAUCIÓN: Se debe tener cuidado de mantener los dedos alejados de las paletas durante la electroporación.
2. Sostenga el cuerpo del cachorro con una mano (generalmente la mano no dominante), manteniendo los dedos bien detrás de la cabeza.
   NOTA: Si es diestro, es más fácil sostener al cachorro con la mano izquierda y los electrodos con la derecha. Si eres zurdo, haz lo contrario.
3. Acerque los electrodos a la cabeza del cachorro para asegurarse de que estén en la posición adecuada, con el electrodo positivo en la parte exterior de la cabeza donde se dirige el ventrículo (p. ej., si se dirige al ventrículo izquierdo, coloque el positivo en el lado izquierdo del cachorro y el negativo en el lado derecho del cachorro). Mientras coloca los electrodos, deslice suavemente un dedo (generalmente el pulgar) en el lado dorsal del cuerpo/cuello posterior a la cabeza para ayudar a levantar la cabeza a su posición.
4. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando la cola y proceda con la electroporación solo si el cachorro está en el plano apropiado de anestesia. Apriete ligeramente las paletas de electrodos en la parte rostral de la cabeza del ratón, colocándolas sobre los ojos. Presione el pedal del electrodo una vez para iniciar la electroporación. Este protocolo utiliza cinco pulsos de 120 V (50 ms, separados por 950 ms); Cada pulso será audible.
   1. Con cada pulso, gire las paletas de electrodos ligeramente en sentido contrario a las agujas del reloj para que la paleta positiva se mueva hacia la parte superior de la cabeza.
      NOTA: Con la electroporación adecuada, uno sentirá/verá que el cuerpo del cachorro de ratón se contrae con cada pulso.
5. Después del pulso final, retire las paletas y colóquelas a un lado. Mueva al cachorro a una toalla de papel limpia y pídale a otro miembro del laboratorio que limpie el gel de la cabeza del cachorro y colóquelo debajo de una lámpara de calor en un "bote" de toallas de papel.
   NOTA: Asegúrese de que la lámpara de calor no esté demasiado cerca de los cachorros. Asegúrate de que otro miembro del laboratorio te ayude con este paso y vigila constantemente a los cachorros. A menudo ayuda sostener a los cachorros en la mano debajo de la lámpara de calor para aumentar el calor para el cachorro. Masajear suavemente el abdomen del cachorro también puede ayudar con la recuperación.
6. Regrese a los cachorros a la jaula de la casa una vez que sus cuerpos tengan un color rosado saludable y tengan una respuesta chirriante a un ligero pellizco de la cola.
   NOTA: Antes de volver a colocarlos en la jaula, tome una pequeña cantidad del material de cama de la jaula doméstica y cepille ligeramente a los cachorros con él para obtener el olor de la jaula. Vuelva a colocar a los cachorros en la jaula debajo del material de cama y regrese a la sala de espera.

5. Pasos postquirúrgicos

1. Vuelva a colocar la mezcla de plásmidos no utilizada de la pipeta de vidrio del microinyector al tubo. Si queda suficiente mezcla, se puede utilizar en procedimientos futuros. Conservar a -20 °C.
2. Limpie el gel de las paletas de electrodos con toallas de papel.
3. Devuelva todas las piezas del equipo a su lugar original.
   NOTA: Si se utilizaron tijeras para cortar la punta de la pipeta de vidrio después de tomar la mezcla de plásmidos, deje las tijeras afuera para limpiar a fondo con la solución de DNasa.
4. Rocíe la mesa con un desinfectante químico, luego limpie, seguido de un rociado de etanol al 70%, luego limpie nuevamente.

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Resultados

El protocolo descrito anteriormente se ha utilizado para desarrollar con éxito modelos de ratones con tumores cerebrales pediátricos y adultos, y el primero se ha publicado con gran detalle en Kim et ^al.8. Con la técnica adecuada y una planificación cuidadosa del diseño de plásmidos, el éxito para el desarrollo de tumores EP suele ser del 100%. La histología es la forma más rápida y sencilla de comprobar el éxito de la inserción de plásmidos de ADN cuando se utiliza una proteína indi...

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Discusión

La administración de ADN plasmídico basada en la electroporación permite el uso in vivo de la biología molecular, similar a la utilizada en modelos de ratón modificados genéticamente, pero con la velocidad, localización y eficiencia de la transducción viral 8,13,14. Con esto último, sin embargo, vienen preocupaciones de seguridad, así como respuestas inmunitarias. Hemos demostrado en nuestro sistema de modelad...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH