Modelado de tumores cerebrales in vivo mediante la administración basada en electroporación de ADN plasmídico que representa las firmas de mutación del paciente

Resumen

La utilización de un modelo tumoral autóctono inmunocompetente impulsado por mutaciones comunes de los pacientes para las pruebas preclínicas es fundamental para las pruebas inmunoterapéuticas. Este protocolo describe un método para generar modelos de ratón con tumores cerebrales utilizando la administración de ADN plasmídico basado en electroporación que representa mutaciones comunes de los pacientes, proporcionando así un modelo de ratón preciso, reproducible y consistente.

Resumen

Los modelos tumorales son fundamentales para las pruebas preclínicas de los tumores cerebrales en términos de explorar tratamientos nuevos y más eficaces. Con un interés significativo en la inmunoterapia, es aún más importante contar con un modelo de ratón consistente, clínicamente pertinente e inmunocompetente para examinar las poblaciones de tumores y células inmunitarias en el cerebro y su respuesta al tratamiento. Si bien la mayoría de los modelos preclínicos utilizan el trasplante ortotópico de líneas celulares tumorales establecidas, el sistema de modelado presentado aquí permite una representación "personalizada" de las mutaciones tumorales específicas del paciente en un desarrollo gradual pero efectivo a partir de construcciones de ADN insertadas en células precursoras neurales (NPC) en división in vivo. Las construcciones de ADN presentan el análisis en mosaico con el método de intercambio de casetes mediado por recombinasa dual (MADR), lo que permite la mutagénesis somática de una sola copia de las mutaciones conductoras. Utilizando crías de ratón recién nacidas entre el nacimiento y los 3 días de edad, los NPC son atacados aprovechando estas células en división que recubren los ventrículos laterales. La microinyección de plásmidos de ADN (p. ej., derivados de MADR, transposones, sgRNA dirigido por CRISPR) en los ventrículos es seguida de electroporación utilizando paletas que rodean la región rostral de la cabeza. Tras la estimulación eléctrica, el ADN es absorbido por las células en división, con el potencial de integrarse en el genoma. El uso de este método se ha demostrado con éxito en el desarrollo de tumores cerebrales pediátricos y adultos, incluido el tumor cerebral maligno más común, el glioblastoma. Este artículo discute y demuestra los diferentes pasos del desarrollo de un modelo de tumor cerebral utilizando esta técnica, incluyendo el procedimiento de anestesia de crías de ratón jóvenes, hasta la microinyección de la mezcla de plásmidos, seguida de electroporación. Con este modelo de ratón autóctono e inmunocompetente, los investigadores tendrán la capacidad de ampliar los enfoques de modelado preclínico, en un esfuerzo por mejorar y examinar el tratamiento eficaz del cáncer.

Introducción

Los modelos de tumores cerebrales murinos son cruciales para comprender los mecanismos de formación y tratamiento de tumores cerebrales. Los modelos actuales suelen incluir trasplantes subcutáneos u ortotópicos producidos rápidamente de líneas celulares tumorales de uso común, basados en un número limitado de mutaciones conductoras o modelos de xenoinjertos derivados de pacientes, utilizando ratones inmunodeficientes que dificultan los estudios de inmunoterapia adecuados 1,2,3,4. Además, estos resultados preclínicos pueden conducir a falsos ....

Protocolo

Todos los procedimientos de este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Cedars Sinai. Los ratones mTmG homocigotos se cruzaron con ratones C57BL/6J para obtener camadas de ratones mTmG heterocigotos de sexo mixto para su uso en el siguiente protocolo. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Las crías de ratón fueron electroporadas entre los días postnatales 0 y 3 (P0-P3).

1. Configuración quirúrgica

1. Rocíe la mesa quirúrgica con desinfectante quími....

Discusión

La administración de ADN plasmídico basada en la electroporación permite el uso in vivo de la biología molecular, similar a la utilizada en modelos de ratón modificados genéticamente, pero con la velocidad, localización y eficiencia de la transducción viral 8,13,14. Con esto último, sin embargo, vienen preocupaciones de seguridad, así como respuestas inmunitarias. Hemos demostrado en nuestro sistema de modelad.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH