使用基于电穿孔的质粒DNA递送对 体内 脑肿瘤进行建模，以代表患者突变特征

摘要

利用由常见患者突变驱动的免疫功能正常的本土肿瘤模型进行临床前测试对于免疫治疗测试至关重要。该协议描述了一种使用基于电穿孔的质粒DNA递送生成脑肿瘤小鼠模型的方法，这些质粒DNA代表常见的患者突变，从而提供准确，可重复和一致的小鼠模型。

摘要

肿瘤模型对于脑肿瘤的临床前测试至关重要，因为它可以探索新的、更有效的治疗方法。随着人们对免疫疗法的浓厚兴趣，拥有一致的、临床相关的、免疫功能正常的小鼠模型来检查大脑中的肿瘤和免疫细胞群及其对治疗的反应就显得尤为重要。虽然大多数临床前模型利用已建立的肿瘤细胞系的原位移植，但这里介绍的建模系统允许从 插入体内分裂神经前体细胞 （NPC） 的 DNA 构建体中逐步而有效地开发患者特异性肿瘤突变的“个性化”表示。DNA 构建体采用双重组酶介导的盒式交换 （MADR） 方法进行嵌合分析，可实现驱动突变的单拷贝体细胞诱变。使用出生至3天大的新生小鼠幼崽，通过利用侧脑室内衬的这些分裂细胞来靶向NPC。将 DNA 质粒（例如，MADR 衍生的转座子、CRISPR 定向的 sgRNA）显微注射到心室中，然后使用围绕头部喙部区域的桨进行电穿孔。在电刺激下，DNA被吸收到分裂细胞中，并有可能整合到基因组中。这种方法的使用已成功用于发展儿童和成人脑肿瘤，包括最常见的恶性脑肿瘤胶质母细胞瘤。本文讨论并演示了使用该技术开发脑肿瘤模型的不同步骤，包括麻醉年轻小鼠幼崽的过程，到质粒混合物的显微注射，然后进行电穿孔。有了这种自主的、免疫功能正常的小鼠模型，研究人员将有能力扩展临床前建模方法，以努力改进和检查有效的癌症治疗。

引言

小鼠脑肿瘤模型对于理解脑肿瘤形成和治疗的机制至关重要。目前的模型通常包括基于有限数量的驱动突变或患者来源的异种移植模型，使用阻碍适当免疫治疗研究的免疫缺陷小鼠对常用肿瘤细胞系进行快速产生的皮下或原位移植 1,2,3,4。此外，这些临床前结果可能导致假阳性，因为此类模型可以表现出对治疗反应的戏剧性，通常是治愈效果，但这并不能转化为临床 2,5,6,7。能够快速生成更能反映患者突变特征的基因工程临床前小鼠模型对于提高临床前结果的有效性至关重要。

基于电穿孔 （EP） 的 DNA 质粒递送可诱导功能丧失 （LOF） 和功能获得 （GOF） 突变，从而可以生成此类模型。我们开发了一种更精确地表示 GOF 驱动突变的方法，称为双重组酶介导的盒交换或 MADR⁸ 的镶嵌分析。该方法允许在体细胞中以受控的、位点特异性的方式表达感兴趣的基....

研究方案

该协议中的所有程序均已获得 Cedars Sinai 医疗中心机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。纯合 子mTmG 小鼠与C57BL / 6J小鼠一起繁殖，以获得混合性别，杂合 子mTmG 小鼠的窝，用于以下方案。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。在出生后第 0 天和第 3 天 （P0-P3） 之间对小鼠幼崽进行电穿孔。

1. 手术设置

1. 用化学消毒剂（例如 Vimoba）喷洒手术台并擦拭，然后用 70% 乙醇擦拭，然后再次擦拭。
2. 将以下器械/材料放在手术台上：拉动的玻璃毛细管移液器（有关如何拉动移液器的信息见参考文献¹⁰ ）、小剪刀、小型生物危害锐器废物容器、微升移液器和移液器吸头、2 块切开的方形石蜡膜、电极凝胶、电极、显微注射器支架和 DNA 质粒混合物（参见 材料表 和 补充文件 1）。
3. 指示时将以下附件放置在手术台上或地板上的设备上：显微注射器控制面板、支架和连接到机器的插头、用于将显微注射器支架固定在侧面的支架（助焊器）、显微注射器脚踏板（在地板上）、连接到机器的电极和电极脚踏板（在地板上）（参见 材料表）。
   注意： 电极脚踏板放....

讨论

基于电穿孔的质粒DNA递送允许在体内使用分子生物学，类似于基因工程小鼠模型中使用的分子生物学，但具有病毒转导的速度、定位和效率8,13,14。然而，后者带来了安全问题和免疫反应。我们在使用质粒 DNA 的 EP 递送的建模系统中表明，由于最初将玻璃毛细管移液管插入脑室⁸，因此发生了最小的免疫?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH