Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi

Özet

Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.

Özet

Tümör modelleri, yeni ve daha etkili tedavilerin araştırılması açısından beyin tümörlerinin klinik öncesi testleri için kritik öneme sahiptir. İmmünoterapiye büyük ilgi duyulduğundan, beyindeki tümör ve bağışıklık hücresi popülasyonlarını ve tedaviye yanıtlarını incelemek için tutarlı, klinik olarak uygun, immün yetmezliği olan bir fare modeline sahip olmak daha da kritiktir. Klinik öncesi modellerin çoğu, yerleşik tümör hücre hatlarının ortotopik transplantasyonunu kullanırken, burada sunulan modelleme sistemi, bölünen nöral öncü hücrelere (NPC'ler ) eklenen DNA yapılarından kademeli ancak etkili bir gelişimde hastaya özgü tümör mutasyonlarının "kişiselleştirilmiş" bir temsiline izin verir. DNA yapıları, sürücü mutasyonlarının tek kopyalı, somatik mutajenezine izin veren çift rekombinaz aracılı kaset değişimi (MADR) yöntemiyle mozaik analizine sahiptir. Doğum ile 3 günlük arasındaki yeni doğan fare yavruları kullanılarak, NPC'ler lateral ventrikülleri kaplayan bu bölünen hücrelerden yararlanılarak hedeflenir. DNA plazmitlerinin (örneğin, MADR türevi, transpozonlar, CRISPR'ye yönelik sgRNA) ventriküllere mikroenjeksiyonunu, başın rostral bölgesini çevreleyen kürekler kullanılarak elektroporasyon takip eder. Elektriksel stimülasyon üzerine DNA, genoma entegre olma potansiyeli ile bölünen hücrelere alınır. Bu yöntemin kullanımı, en yaygın malign beyin tümörü olan glioblastoma dahil olmak üzere hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörlerinin geliştirilmesinde başarıyla gösterilmiştir. Bu makale, genç fare yavrularının uyuşturulması, plazmit karışımının mikroenjeksiyonu ve ardından elektroporasyon dahil olmak üzere bu tekniği kullanarak bir beyin tümörü modeli geliştirmenin farklı adımlarını tartışmakta ve göstermektedir. Bu otokton, bağışıklığı yeterli fare modeli ile araştırmacılar, etkili kanser tedavisini iyileştirme ve inceleme çabalarında klinik öncesi modelleme yaklaşımlarını genişletme yeteneğine sahip olacaklar.

Giriş

Murin beyin tümörü modelleri, beyin tümörü oluşum ve tedavi mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Mevcut modeller tipik olarak, uygun immünoterapi çalışmalarını engelleyen immün yetmezliği olan fareler kullanılarak, sınırlı sayıda sürücü mutasyonuna veya hastadan türetilen ksenogreft modellerine dayalı olarak, yaygın olarak kullanılan tümör hücre hatlarının hızla üretilen deri altı veya ortotopik transplantasyonlarını içerir 1,2,3,4. Ek olarak, bu klinik öncesi sonuçlar yanlış pozitiflere yol açabilir, çünkü bu tür modeller tedaviye ya....

Protokol

Bu protokoldeki tüm prosedürler Cedars Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Homozigot mTmG fareleri, aşağıdaki protokolde kullanılmak üzere karışık cinsiyetli, heterozigot mTmG farelerinin yavrularını elde etmek için C57BL / 6J farelerle yetiştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Fare yavruları doğum sonrası 0. ve 3. günler arasında elektroporasyona tabi tutuldu (P0-P3).

1. Cerrahi kurulum

1. Ameliyat masasına kimyasal dezenfektan (örneğin Vimoba) püskürtün ve silin, ardından %70 etanol ekleyin ve tekr....

Tartışmalar

Plazmid DNA'nın elektroporasyona dayalı iletimi, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde kullanılana benzer, ancak viral transdüksiyonun hızı, lokalizasyonu ve verimliliği ile moleküler biyolojinin in vivo kullanımına izin verir 8,13,14. Bununla birlikte, ikincisi ile birlikte, güvenlik endişeleri ve bağışıklık tepkileri gelir. Plazmid DNA'nın EP iletimini kullanan modelleme sistemimizde, cam kıl.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH