Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures(환자 돌연변이 시그니처를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용한 생체 내 뇌종양 모델링)

요약

전임상 테스트를 위해 일반적인 환자 돌연변이에 의해 유도되는 면역 능력이 있는 자가종양 모델을 활용하는 것은 면역 치료 테스트에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 일반적인 환자 돌연변이를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용하여 뇌종양 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명하므로 정확하고 재현 가능하며 일관된 마우스 모델을 제공합니다.

초록

종양 모델은 새롭고 더 효과적인 치료법을 탐색하는 측면에서 뇌종양의 전임상 테스트에 매우 중요합니다. 면역 요법에 대한 관심이 높아짐에 따라 뇌의 종양 및 면역 세포 집단과 치료에 대한 반응을 조사하기 위해 일관되고 임상적으로 적절하며 면역력이 있는 마우스 모델을 보유하는 것이 훨씬 더 중요합니다. 대부분의 전임상 모델은 확립된 종양 세포주의 정형외형 이식을 활용하지만, 여기에 제시된 모델링 시스템은 생체 내에서 분열 신경 전구 세포(NPC)에 삽입된 DNA 구조로부터 점진적이지만 효과적인 개발로 환자 특이적 종양 돌연변이의 "개인화된" 표현을 허용합니다. DNA 구조체는 MADR(dual-recombinase-mediated cassette exchange) 방법을 사용한 모자이크 분석을 특징으로 하며, 드라이버 돌연변이의 단일 복제, 체세포 돌연변이 유발을 허용합니다. 출생부터 생후 3일 사이의 갓 태어난 새끼 쥐를 사용하여 NPC는 측면 심실 내벽을 감싸고 있는 이러한 분열 세포를 이용하여 표적이 됩니다. DNA 플라스미드(예: MADR 유래, 트랜스포손, CRISPR 지향 sgRNA)를 심실에 미세주입한 후 머리의 로스트랄 영역을 둘러싸는 패들을 사용하여 전기천공법을 수행합니다. 전기 자극을 받으면 DNA가 분열하는 세포로 흡수되어 게놈에 통합될 가능성이 있습니다. 이 방법의 사용은 가장 흔한 악성 뇌종양인 교모세포종을 포함한 소아 및 성인 뇌종양 발병에서 성공적으로 입증되었습니다. 이 기사에서는 어린 쥐 새끼를 마취하는 절차부터 플라스미드 혼합물의 미세 주입 및 전기 천공법까지 포함하여 이 기술을 사용하여 뇌종양 모델을 개발하는 다양한 단계에 대해 논의하고 시연합니다. 이 자가적이고 면역력이 있는 마우스 모델을 통해 연구자들은 효과적인 암 치료를 개선하고 조사하기 위한 노력의 일환으로 전임상 모델링 접근 방식을 확장할 수 있습니다.

서문

쥐 뇌종양 모델은 뇌종양 형성 및 치료의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 현재 모델에는 일반적으로 적절한 면역요법 연구를 방해하는 면역결핍 마우스를 사용하여 제한된 수의 드라이버 돌연변이 또는 환자 유래 이종이식 모델을 기반으로 일반적으로 사용되는 종양 세포주의 신속하게 생산된 피하 또는 기립성 이식이 포함됩니다 1,2,3,4. 또한, 이러한 전임상 결과는 위양성(false positive)으로 이어질 수 있는데, 이는 이러한 모델이 치료에 대한 반응으로 극적이고 종종 치료 효과를 나타낼 수 있다는 점에서, 그러나 이는 임상에 적용되지 않는다 2,5,6,7. 환자의 돌연변이 시그니처를 더 잘 반영하는 유전자 조작 전임상 마우스 모델을 신속하게 생산할 수 있는 능력은 전임상 결과의 타당성을 개선하는 데 필수적입니다.

프로토콜

이 프로토콜의 모든 절차는 Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았습니다. 동형접합 mTmG 마우스를 C57BL/6J 마우스와 함께 사육하여 다음 프로토콜에 사용하기 위한 혼합 성별, 이형접합 mTmG 마우스의 새끼를 얻었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다(자료표 참조). 새끼 마우스는 출생 후 0일과 3일(P0-P3) 사이에 전기천공되었습니다.

1. 수술 설정

1. 수술대에 화학 소독제(예: Vimoba)를 뿌리고 닦아낸 다음 70% 에탄올을 묻혀 다시 닦아냅니다.
2. 당겨진 유리 모세관 피펫(피펫을 당기는 방법에 대한 참조¹⁰ 참조), 작은 가위, 작은 생물학적 위험 날카로운 물건 폐기물 용기, 마이크로리터 피펫터 및 피펫 팁, 파라핀 필름의 절단된 정사각형 조각 2개, 전극 겔, 전극, 미세인젝터용 홀더 및 DNA 플라스미드 혼합물( 재료 표 및 보충 파일 1 참조).
3. 표시된 경우 수....

토론

플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달은 유전자 조작 마우스 모델에 사용되는 것과 유사하지만 바이러스 형질도입의 속도, 국소화 및 효율성을 갖춘 분자 생물학의 생체 내 사용을 가능하게 합니다 8,13,14. 그러나 후자의 경우 면역 반응뿐만 아니라 안전 문제도 발생합니다. 플라스미드 DNA의 EP 전달을 이용한 모델링 시.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH