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* これらの著者は同等に貢献しました
免疫療法試験には、一般的な患者の変異によって駆動される免疫能のある自家腫瘍モデルを前臨床試験に利用することが不可欠です。従ってこのプロトコルは共通の忍耐強い突然変異を表すプラスミッドDNAのelectroporationベースの配達を使用して脳腫瘍マウス モデルを発生させる方法を記述し、正確で、再生可能で、一貫したマウス モデルを提供する。
腫瘍モデルは、より効果的な新しい治療法を探索するという点で、脳腫瘍の前臨床試験に不可欠です。免疫療法への関心が高まる中、脳内の腫瘍と免疫細胞の集団、およびそれらの治療に対する反応を調べるために、一貫性のある臨床的に適切な免疫適格なマウスモデルを持つことがさらに重要です。ほとんどの前臨床モデルでは、確立された腫瘍細胞株の同所性移植を利用していますが、ここで紹介するモデリングシステムでは、 in vivoで分裂する神経前駆細胞(NPC)に挿入されたDNAコンストラクトから、段階的かつ効果的に、患者固有の腫瘍変異を「個別化」して表現することができます。DNAコンストラクトは、デュアルリコンビナーゼ媒介カセット交換(MADR)法によるモザイク解析を特徴としており、ドライバー変異のシングルコピーの体細胞突然変異誘発を可能にします。生まれてから生後3日の間に生まれたばかりの仔マウスを用いて、側脳室を覆うこれらの分裂細胞を利用してNPCを標的にします。DNAプラスミド(MADR由来、トランスポゾン、CRISPR指向sgRNAなど)を脳室にマイクロインジェクションした後、頭部の吻側領域を囲むパドルを使用してエレクトロポレーションを行います。電気刺激を受けると、DNAは分裂細胞に取り込まれ、ゲノムに組み込まれる可能性があります。この方法の使用は、最も一般的な悪性脳腫瘍である神経膠芽腫を含む、小児および成人の両方の脳腫瘍の発症に成功しています。本稿では、若い仔マウスに麻酔をかける手順から、プラスミドミックスのマイクロインジェクション、それに続くエレクトロポレーションまで、この技術を用いて脳腫瘍モデルを開発するためのさまざまなステップについて説明し、実演します。この自生免疫正常マウスモデルにより、研究者は前臨床モデリングアプローチを拡張し、有効ながん治療の改善と検討に取り組むことができます。
マウス脳腫瘍モデルは、脳腫瘍の形成と治療のメカニズムを理解する上で非常に重要です。現在のモデルには、通常、適切な免疫療法研究を妨げる免疫不全マウスを使用した、限られた数のドライバー変異または患者由来の異種移植モデルに基づいて、一般的に使用される腫瘍細胞株の皮下移植または同所性移植が含まれます1,2,3,4。さらに、これらの前臨床結果は、そのようなモデルが治療に反応して劇的でしばしば治癒効果を示す可能性があるという点で、偽陽性につながる可能性がありますが、これはクリニックには変換されません2,5,6,7。前臨床結果の妥当性を向上させるためには、患者の変異シグネチャーをより反映した遺伝子改変前臨床マウスモデルを迅速に作製する能力が不可欠です。
機能喪失(LOF)と機能獲得(GOF)の両方の変異を誘導するDNAプラスミドのエレクトロポレーション(EP)ベースの送達により、この....
このプロトコルのすべての手順は、Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) によって承認されました。ホモ接合体mTmGマウスをC57BL/6Jマウスと交配し、以下のプロトコルで使用するために、混合性ヘテロ接合体mTmGマウスの同腹仔を得た。動物は市販の供給源から入手した(資料表参照)。マウスの仔は、出生後0日目から3日目(P0-P3)の間にエレクトロポレーションされました。
1.手術のセットアップ
上記のプロトコルは、小児および成人の脳腫瘍マウスモデルの開発に成功裏に使用されており、前者はKim et al.8で詳細に発表されています。適切な技術とプラスミド設計の慎重な計画により、腫瘍のEP発生の成功は通常100%です。組織学は、レポータータンパク質を使用した場合にDNAプラスミドの挿入が成功したかどうかを確認するための最も迅速で簡単な方法です。このプ?.......
プラスミドDNAのエレクトロポレーションベースの送達は、遺伝子改変マウスモデルで使用されるものと同様の分子生物学のin vivo使用を可能にしますが、ウイルス形質導入の速度、局在化、および効率を備えています8,13,14。しかし、後者には、免疫反応だけでなく、安全性の懸念も伴います。プラスミドDNAのEP送達?.......
著者は何も開示していません。
Gi Bum Kim氏の免疫蛍光染色と画像に感謝します。また、Emily Hatanaka氏、Naomi Kobritz氏、Paul Linesch氏には、プロトコルに関する有益なアドバイスをいただいたことにも感謝します。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
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