Modélisation de tumeurs cérébrales in vivo à l’aide de l’administration par électroporation d’ADN plasmidique représentant les signatures de mutation des patients

Résumé

L’utilisation d’un modèle de tumeur autochtone immunocompétent piloté par des mutations courantes de patients pour les tests précliniques est essentielle pour les tests immunothérapeutiques. Ce protocole décrit une méthode pour générer des modèles murins de tumeurs cérébrales en utilisant l’administration d’ADN plasmidique basée sur l’électroporation qui représentent les mutations courantes des patients, fournissant ainsi un modèle murin précis, reproductible et cohérent.

Résumé

Les modèles tumoraux sont essentiels pour les tests précliniques des tumeurs cérébrales en termes d’exploration de nouveaux traitements plus efficaces. Avec un intérêt significatif pour l’immunothérapie, il est encore plus essentiel de disposer d’un modèle murin immunocompétent cohérent et cliniquement pertinent pour examiner les populations de cellules tumorales et immunitaires dans le cerveau et leur réponse au traitement. Alors que la plupart des modèles précliniques utilisent la transplantation orthotopique de lignées cellulaires tumorales établies, le système de modélisation présenté ici permet une représentation « personnalisée » des mutations tumorales spécifiques au patient dans un développement progressif mais efficace à partir de constructions d’ADN insérées dans des cellules précurseurs neurales (NPC) en division in vivo. Les constructions d’ADN comportent l’analyse en mosaïque avec la méthode d’échange de cassettes médiée par la double recombinase (MADR), ce qui permet une mutagenèse somatique en une seule copie des mutations du moteur. En utilisant des souriceaux nouveau-nés entre la naissance et l’âge de 3 jours, les PNJ sont ciblés en tirant parti de ces cellules en division qui tapissent les ventricules latéraux. La micro-injection de plasmides d’ADN (p. ex., dérivés de MADR, transposons, ARNsg dirigé par CRISPR) dans les ventricules est suivie d’une électroporation à l’aide de palettes qui entourent la région rostrale de la tête. Lors de la stimulation électrique, l’ADN est absorbé dans les cellules en division, avec le potentiel de s’intégrer dans le génome. L’utilisation de cette méthode a été démontrée avec succès dans le développement de tumeurs cérébrales pédiatriques et adultes, y compris la tumeur cérébrale maligne la plus courante, le glioblastome. Cet article discute et démontre les différentes étapes du développement d’un modèle de tumeur cérébrale à l’aide de cette technique, y compris la procédure d’anesthésie des jeunes souriceaux, à la micro-injection du mélange plasmidique, suivie de l’électroporation. Grâce à ce modèle murin autochtone et immunocompétent, les chercheurs auront la possibilité d’élargir les approches de modélisation préclinique, dans le but d’améliorer et d’examiner un traitement efficace du cancer.

Introduction

Les modèles murins de tumeurs cérébrales sont cruciaux pour comprendre les mécanismes de formation et de traitement des tumeurs cérébrales. Les modèles actuels comprennent généralement des transplantations sous-cutanées ou orthotopiques rapidement produites de lignées cellulaires tumorales couramment utilisées, basées sur un nombre limité de mutations pilotes ou de modèles de xénogreffes dérivés de patients, en utilisant des souris immunodéficientes qui entravent les études d’immunothérapie appropriées 1,2,3,4. De plus, ces résultats préclin....

Protocole

Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Cedars Sinai Medical Center (IACUC). Des souris mTmG homozygotes ont été accouplées avec des souris C57BL/6J afin d’obtenir des portées de souris mTmG hétérozygotes de sexe mixte à utiliser dans le protocole suivant. Les animaux ont été obtenus auprès d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Les souriceaux ont été électroporés entre les jours 0 et 3 postnatals (P0-P3).

1. Configuration chirurgicale

1. Vaporisez la table d’opération avec un d....

Discussion

L’administration d’ADN plasmidique basée sur l’électroporation permet l’utilisation in vivo de la biologie moléculaire, similaire à celle utilisée dans les modèles murins génétiquement modifiés, mais avec la vitesse, la localisation et l’efficacité de la transduction virale 8,13,14. Ce dernier s’accompagne toutefois de problèmes de sécurité ainsi que de réponses immunitaires. Nous avons montré.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH