Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Использование иммунокомпетентной, аутохтонной модели опухоли, основанной на распространенных мутациях пациента, для доклинических испытаний имеет решающее значение для иммунотерапевтического тестирования. Этот протокол описывает метод создания мышиных моделей опухолей головного мозга с использованием электропорационной доставки плазмидной ДНК, которая представляет распространенные мутации пациента, что обеспечивает точную, воспроизводимую и согласованную модель мыши.

Аннотация

Модели опухолей имеют решающее значение для доклинических испытаний опухолей головного мозга с точки зрения изучения новых, более эффективных методов лечения. При значительном интересе к иммунотерапии еще более важно иметь последовательную, клинически значимую, иммунокомпетентную мышиную модель для изучения популяций опухолевых и иммунных клеток в головном мозге и их реакции на лечение. В то время как большинство доклинических моделей используют ортотопическую трансплантацию установленных линий опухолевых клеток, представленная здесь система моделирования позволяет «персонализировать» представление специфических для пациента опухолевых мутаций в постепенном, но эффективном развитии из конструкций ДНК, вставленных в делящиеся нейральные клетки-предшественники (NPC) in vivo. Мозаичный анализ ДНК-конструкций осуществляется с помощью метода двойного рекомбиназно-опосредованного кассетного обмена (MADR), что позволяет осуществлять однокопийный соматический мутагенез драйверных мутаций. Используя новорожденных детенышей мышей в возрасте от рождения до 3 дней, NPC становятся мишенью, используя эти делящиеся клетки, выстилающие боковые желудочки. Микроинъекция плазмид ДНК (например, полученных из MADR, транспозонов, CRISPR-направленной sgRNA) в желудочки сопровождается электропорацией с помощью лопастей, которые окружают ростральную область головы. При электрической стимуляции ДНК поглощается делящимися клетками с возможностью интеграции в геном. Применение этого метода успешно продемонстрировано при развитии опухолей головного мозга как у детей, так и у взрослых, в том числе наиболее распространенной злокачественной опухоли головного мозга – глиобластомы. В данной статье обсуждаются и демонстрируются различные этапы разработки модели опухоли головного мозга с использованием этой методики, включая процедуру обезболивания молодых детенышей мышей до микроинъекции плазмидной смеси с последующей электропорацией. С помощью этой автохтонной, иммунокомпетентной мышиной модели исследователи получат возможность расширить подходы к доклиническому моделированию в усилиях по улучшению и изучению эффективного лечения рака.

Введение

Модели опухолей головного мозга мышей имеют решающее значение для понимания механизмов образования и лечения опухолей головного мозга. Современные модели, как правило, включают в себя быструю подкожную или ортотопическую трансплантацию широко используемых линий опухолевых клеток, основанных на ограниченном числе драйверных мутаций или моделях ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, с использованием мышей с иммунодефицитом, которые препятствуют надлежащим исследованиям иммунотерапии 1,2,3,4. Кроме того, эти доклинические результаты могу....

протокол

Все процедуры, предусмотренные этим протоколом, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского центра Cedars Sinai. Гомозиготных мышей mTmG скрещивали с мышами C57BL/6J для получения пометов разнополых гетерозиготных мышей mTmG для использования в следующем протоколе. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Детеныши мышей подвергались электропорации между 0 и 3 днями построждения (P0-P3).

1. Хирургическая подготовка

  1. Распылите на операционный стол химическое дезинфицирующее средство (например, Vimoba) и про....

Результаты

Протокол, описанный выше, был использован для успешной разработки как детских, так и взрослых моделей мышей с опухолями головного мозга, причем первая из них была подробно опубликована в Kim et al.8. При правильной технике и тщательном планировании плазмидного дизайна успех ра?.......

Обсуждение

Доставка плазмидной ДНК с помощью электропорации позволяет in vivo использовать молекулярную биологию, аналогичную той, которая используется в генетически модифицированных моделях мышей, но со скоростью, локализацией и эффективностью вирусной трансдукции 8,13,14.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Благодарим Ги Бум Кима за иммунофлуоресцентное окрашивание и изображения. Мы также благодарим Эмили Хатанаку, Наоми Кобриц и Пола Линеша за полезные советы по протоколу.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-2.5 µL 1-channel pipetteEppendorf3123000012
2 µL pipette tipsFisher Scientific02-707-442
20 µL pipette tipsFisher Scientific02-707-432
2-20 µL 1-channel pipetteEppendorf3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation SolutionsFisher ScientificAM9890
ECM 830 Square Porator ElectroporatorBTX45-0662
Electrode GelParker LabsPLI152CSZ
Fast Green DyeSigma-AldrichF7258-25G
Helping Hands Soldering AidPro'sKit900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight SharpRobozRS-5916
Mouse Strain: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryJAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JThe Jackson Laboratory JAX: 007676
ParafilmGrainger16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV Addgene129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm DiameterBTX45-0488
Sharps container, 1-quartUlineS-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm IDWorld Precision Instruments1B100F-4Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. 
Vertical Micropipette PullerSutter InstrumentsP-30Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. 
Vimoba Tablet SolutionQuip LaboratoriesVIMTAB
XenoWorks Digital MicroinjectorSutter InstrumentsBRE
XenoWorks Micropipette HolderSutter InstrumentsBR-MH

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vivoNPCMADRCRISPR SgRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены