Моделирование опухолей головного мозга in vivo с использованием электропорационной доставки плазмидной ДНК, представляющей мутационные сигнатуры пациента

Резюме

Использование иммунокомпетентной, аутохтонной модели опухоли, основанной на распространенных мутациях пациента, для доклинических испытаний имеет решающее значение для иммунотерапевтического тестирования. Этот протокол описывает метод создания мышиных моделей опухолей головного мозга с использованием электропорационной доставки плазмидной ДНК, которая представляет распространенные мутации пациента, что обеспечивает точную, воспроизводимую и согласованную модель мыши.

Аннотация

Модели опухолей имеют решающее значение для доклинических испытаний опухолей головного мозга с точки зрения изучения новых, более эффективных методов лечения. При значительном интересе к иммунотерапии еще более важно иметь последовательную, клинически значимую, иммунокомпетентную мышиную модель для изучения популяций опухолевых и иммунных клеток в головном мозге и их реакции на лечение. В то время как большинство доклинических моделей используют ортотопическую трансплантацию установленных линий опухолевых клеток, представленная здесь система моделирования позволяет «персонализировать» представление специфических для пациента опухолевых мутаций в постепенном, но эффективном развитии из конструкций ДНК, вставленных в делящиеся нейральные клетки-предшественники (NPC) in vivo. Мозаичный анализ ДНК-конструкций осуществляется с помощью метода двойного рекомбиназно-опосредованного кассетного обмена (MADR), что позволяет осуществлять однокопийный соматический мутагенез драйверных мутаций. Используя новорожденных детенышей мышей в возрасте от рождения до 3 дней, NPC становятся мишенью, используя эти делящиеся клетки, выстилающие боковые желудочки. Микроинъекция плазмид ДНК (например, полученных из MADR, транспозонов, CRISPR-направленной sgRNA) в желудочки сопровождается электропорацией с помощью лопастей, которые окружают ростральную область головы. При электрической стимуляции ДНК поглощается делящимися клетками с возможностью интеграции в геном. Применение этого метода успешно продемонстрировано при развитии опухолей головного мозга как у детей, так и у взрослых, в том числе наиболее распространенной злокачественной опухоли головного мозга – глиобластомы. В данной статье обсуждаются и демонстрируются различные этапы разработки модели опухоли головного мозга с использованием этой методики, включая процедуру обезболивания молодых детенышей мышей до микроинъекции плазмидной смеси с последующей электропорацией. С помощью этой автохтонной, иммунокомпетентной мышиной модели исследователи получат возможность расширить подходы к доклиническому моделированию в усилиях по улучшению и изучению эффективного лечения рака.

Введение

Модели опухолей головного мозга мышей имеют решающее значение для понимания механизмов образования и лечения опухолей головного мозга. Современные модели, как правило, включают в себя быструю подкожную или ортотопическую трансплантацию широко используемых линий опухолевых клеток, основанных на ограниченном числе драйверных мутаций или моделях ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, с использованием мышей с иммунодефицитом, которые препятствуют надлежащим исследованиям иммунотерапии 1,2,3,4. Кроме того, эти доклинические результаты могу....

протокол

Все процедуры, предусмотренные этим протоколом, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского центра Cedars Sinai. Гомозиготных мышей mTmG скрещивали с мышами C57BL/6J для получения пометов разнополых гетерозиготных мышей mTmG для использования в следующем протоколе. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Детеныши мышей подвергались электропорации между 0 и 3 днями построждения (P0-P3).

1. Хирургическая подготовка

1. Распылите на операционный стол химическое дезинфицирующее средство (например, Vimoba) и про....

Результаты

Протокол, описанный выше, был использован для успешной разработки как детских, так и взрослых моделей мышей с опухолями головного мозга, причем первая из них была подробно опубликована в Kim et ^al.8. При правильной технике и тщательном планировании плазмидного дизайна успех ра?.......

Обсуждение

Доставка плазмидной ДНК с помощью электропорации позволяет in vivo использовать молекулярную биологию, аналогичную той, которая используется в генетически модифицированных моделях мышей, но со скоростью, локализацией и эффективностью вирусной трансдукции 8,13,14.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH