Modelando Tumores Cerebrais In Vivo Usando a Liberação Eletroporada de DNA Plasmidial Representando Assinaturas de Mutação de Pacientes

Resumo

A utilização de um modelo de tumor autóctone imunocompetente conduzido por mutações comuns de pacientes para testes pré-clínicos é fundamental para testes imunoterapêuticos. Este protocolo descreve um método para gerar modelos de tumor cerebral em camundongos usando a entrega baseada em eletroporação de DNA plasmidial que representa mutações comuns em pacientes, fornecendo assim um modelo de camundongo preciso, reprodutível e consistente.

Resumo

Os modelos tumorais são fundamentais para o teste pré-clínico de tumores cerebrais em termos de exploração de novos tratamentos mais eficazes. Com interesse significativo em imunoterapia, é ainda mais crítico ter um modelo de camundongo consistente, clinicamente pertinente e imunocompetente para examinar as populações de células tumorais e imunes no cérebro e sua resposta ao tratamento. Enquanto a maioria dos modelos pré-clínicos utiliza o transplante ortotópico de linhagens de células tumorais estabelecidas, o sistema de modelagem apresentado aqui permite uma representação "personalizada" de mutações tumorais específicas do paciente em um desenvolvimento gradual, mas eficaz, a partir de construções de DNA inseridas em células precursoras neurais (NPCs) em divisão in vivo. As construções de DNA apresentam a análise em mosaico com o método de troca de mediado por dupla recombinase (MADR), permitindo mutagênese somática de cópia única de mutações condutoras. Usando filhotes de camundongos recém-nascidos entre o nascimento e 3 dias de idade, os NPCs são visados aproveitando essas células em divisão que revestem os ventrículos laterais. A microinjeção de plasmídeos de DNA (por exemplo, derivados de MADR, transposons, sgRNA direcionado por CRISPR) nos ventrículos é seguida por eletroporação usando pás que circundam a região rostral da cabeça. Após a estimulação elétrica, o DNA é levado para dentro das células em divisão, com potencial de integração ao genoma. O uso deste método tem sido demonstrado com sucesso no desenvolvimento de tumores cerebrais pediátricos e adultos, incluindo o tumor cerebral maligno mais comum, o glioblastoma. Este artigo discute e demonstra as diferentes etapas do desenvolvimento de um modelo de tumor cerebral utilizando esta técnica, incluindo o procedimento de anestesia de filhotes jovens de camundongos, para microinjeção da mistura de plasmídeos, seguida de eletroporação. Com este modelo autóctone e imunocompetente do rato, os pesquisadores terão a capacidade de expandir as abordagens da modelagem pré-clínica, nos esforços para melhorar e examinar o tratamento eficaz do cancro.

Introdução

Modelos de tumores cerebrais murinos são cruciais para a compreensão dos mecanismos de formação e tratamento de tumores cerebrais. Os modelos atuais tipicamente incluem transplantes subcutâneos ou ortotópicos de linhagens de células tumorais comumente usadas, baseados em um número limitado de mutações condutoras ou modelos de xenoenxertos derivados do paciente, usando camundongos imunodeficientes que dificultam estudos adequados de imunoterapia 1,2,3,4. Além disso, esses resultados pré-clínicos podem levar a falsos positivos, na medida em qu....

Protocolo

Todos os procedimentos deste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Cedars Sinai Medical Center (IACUC). Camundongos homozigotos mTmG foram criados com camundongos C57BL/6J para obter ninhadas de camundongos mTmG heterozigotos de sexo misto para uso no protocolo a seguir. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Os filhotes de camundongos foram eletroporados entre os dias 0 e 3 pós-natais (P0-P3).

1. Arranjo cirúrgico

1. Borrife a mesa cirúrgica com desinfetante químico (por exemplo, Vimoba) e limpe, seguido ....

Discussão

A liberação de DNA plasmidial baseada em eletroporação permite o uso in vivo de biologia molecular, semelhante àquela usada em modelos de camundongos geneticamente modificados, mas com a velocidade, localização e eficiência da transdução viral 8,13,14. Com este último, no entanto, vêm preocupações de segurança, bem como respostas imunológicas. Demonstramos em nosso sistema de modelagem usando EP-liberaç.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH