تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

Summary

يلعب انقباض Actomyosin دورا مهما في تكوين الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، من الصعب التلاعب بانقباض الأكتوميوسين في الجسم الحي بشكل حاد. يصف هذا البروتوكول نظاما بصريا وراثيا يثبط بسرعة انقباض الأكتوميوسين بوساطة Rho1 في أجنة ذبابة الفاكهة ، مما يكشف عن الفقدان الفوري للتوتر الظهاري بعد تعطيل الأكتوميوسين في الجسم الحي.

Abstract

تعتبر القوى المقلصة الناتجة عن الأكتين والميوسين الثاني غير العضلي ("انقباض الأكتوميوسين") ضرورية للتغيرات المورفولوجية للخلايا والأنسجة على مقاييس طول متعددة ، مثل انقسام الخلايا ، وهجرة الخلايا ، والطي الظهاري ، والتشكل المتفرع. يتطلب الفهم المتعمق لدور انقباض الأكتوميوسين في التشكل مناهج تسمح بالتعطيل السريع للأكتوميوسين ، وهو أمر يصعب تحقيقه باستخدام الأساليب الجينية أو الدوائية التقليدية. يوضح البروتوكول المقدم استخدام نظام dimerization البصري الوراثي القائم على CRY2-CIBN ، Opto-Rho1DN ، لمنع انقباض الأكتوميوسين في أجنة ذبابة الفاكهة مع ضوابط زمنية ومكانية دقيقة. في هذا النظام ، يتم دمج CRY2 في الشكل السلبي السائد ل Rho1 (Rho1DN) ، بينما يتم تثبيت CIBN على غشاء البلازما. يؤدي التثبيط بوساطة الضوء الأزرق ل CRY2 و CIBN إلى الانتقال السريع ل Rho1DN من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما ، حيث يثبط نشاط الأكتوميوسين عن طريق تثبيط Rho1 الداخلي. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لاقتران تعطيل الأكتوميوسين بوساطة Opto-Rho1DN مع الاستئصال بالليزر للتحقيق في دور الأكتوميوسين في توليد التوتر الظهاري أثناء تكوين ثلم ذبابة الفاكهة البطني. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على العديد من العمليات المورفولوجية الأخرى التي تنطوي على انقباض الأكتوميوسين في أجنة ذبابة الفاكهة مع الحد الأدنى من التعديلات. بشكل عام ، تعد هذه الأداة البصرية الجينية نهجا قويا لتشريح وظيفة انقباض الأكتوميوسين في التحكم في ميكانيكا الأنسجة أثناء إعادة تشكيل الأنسجة الديناميكية.

Introduction

انقباض Actomyosin ، قوة الانقباض التي يمارسها الميوسين II غير العضلي (المشار إليه فيما يلي باسم "الميوسين") على شبكة F-actin ، هي واحدة من أهم القوى في تغيير شكل الخلية ودفع التشكل على مستوى الأنسجة ^1,2. على سبيل المثال ، يؤدي تنشيط انقباض الأكتوميوسين في المجال القمي للخلايا الظهارية إلى انقباض قمي ، مما يسهل مجموعة متنوعة من العمليات المورفولوجية ، بما في ذلك الطي الظهاري ، وقذف الخلايا ، والتفريغ ، والتئام الجروح³،⁴،⁵،^6،7. يتطلب تنشيط الميوسين فس....

Protocol

1. إعداد الصليب الجيني وإعداد كوب جمع البويضات

1. حدد الذباب الأنثوي (العذراء) من الخط البصري الوراثي UASp-CIBNpm (I) ؛ UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) على وسادة CO₂ تحت المجهر المجسم وإعداد صليب مع الذباب الذكور من خط سائق الأم GAL4 67 Sqh-mCherry ؛ 15 E-cadherin-GFP.
   ملاحظة: يرمز 67 و 15 إلى الأم توبولين GAL4 الذي تم إدخاله في الكروموسومات الثانية (II) والثالثة (III) ، على التوالي⁵². يعبر خط GAL4 المستخدم في هذا البروتوكول أيضا عن سلسلة الضوء التنظيمية للميوسين الموسومة ب mCherry Sqh (اسباجيتي الاسكواش) ³⁷ و E-cadherin⁵³ الموسوم ب GFP. قد لا يزال الذباب من ال....

النتائج

في الأجنة غير المحفزة التي تخضع للانقباض القمي ، أصبح Sqh-mCherry غنيا في المنطقة القمية المتوسطة لخلايا الأديم المتوسط البطني ، بينما كان CRY2-Rho1DN-mCherry خلويا (الشكل 1 أ). أدى الاجتثاث بالليزر داخل مجال الانقباض إلى ارتداد سريع للأنسجة على طول محور A-P (الشكل 1B ، C.......

Discussion

وصف هذا البروتوكول الاستخدام المشترك لعلم البصريات الوراثي والاستئصال بالليزر لاستكشاف التغيرات في توتر الأنسجة مباشرة بعد تعطيل انقباض الأكتوميوسين. تستفيد الأداة البصرية الوراثية الموصوفة هنا من الشكل السلبي السائد ل Rho1 (Rho1DN) لتثبيط انقباض الأكتوميوسين الداخلي المنشأ Rho1 و Rho1 بشكل حا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation