Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Riepilogo

La contrattilità dell'actomiosina svolge un ruolo importante nella morfogenesi cellulare e tissutale. Tuttavia, è difficile manipolare la contrattilità dell'actomiosina in vivo in modo acuto. Questo protocollo descrive un sistema optogenetico che inibisce rapidamente la contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 negli embrioni di Drosophila , rivelando l'immediata perdita di tensione epiteliale dopo l'inattivazione dell'actomiosina in vivo.

Abstract

Le forze contrattili generate dall'actina e dalla miosina II non muscolare ("contrattilità dell'actomiosina") sono fondamentali per i cambiamenti morfologici di cellule e tessuti su più scale di lunghezza, come la divisione cellulare, la migrazione cellulare, il ripiegamento epiteliale e la morfogenesi ramificata. Una comprensione approfondita del ruolo della contrattilità dell'actomiosina nella morfogenesi richiede approcci che consentano la rapida inattivazione dell'actomiosina, che è difficile da ottenere utilizzando approcci genetici o farmacologici convenzionali. Il protocollo presentato dimostra l'uso di un sistema di dimerizzazione optogenetica basato su CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, per inibire la contrattilità dell'actomiosina negli embrioni di Drosophila con precisi controlli temporali e spaziali. In questo sistema, CRY2 è fuso con la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN), mentre CIBN è ancorato alla membrana plasmatica. La dimerizzazione mediata dalla luce blu di CRY2 e CIBN provoca una rapida traslocazione di Rho1DN dal citoplasma alla membrana plasmatica, dove inattiva l'actomiosina inibendo Rho1 endogeno. Inoltre, questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'accoppiamento dell'inattivazione dell'actomiosina mediata da Opto-Rho1DN con l'ablazione laser per studiare il ruolo dell'actomiosina nella generazione di tensione epiteliale durante la formazione del solco ventrale di Drosophila . Questo protocollo può essere applicato a molti altri processi morfologici che coinvolgono la contrattilità dell'actomiosina negli embrioni di Drosophila con modifiche minime. Nel complesso, questo strumento optogenetico è un potente approccio per analizzare la funzione della contrattilità dell'actomiosina nel controllo della meccanica tissutale durante il rimodellamento dinamico dei tessuti.

Introduzione

La contrattilità dell'actomiosina, la forza contrattile esercitata dalla miosina II non muscolare (di seguito «miosina») sulla rete di F-actina, è una delle forze più importanti nel modificare la forma delle cellule e nel guidare la morfogenesi a livello tissutale ^1,2. Ad esempio, l'attivazione della contrattilità dell'actomiosina nel dominio apicale delle cellule epiteliali provoca una costrizione apicale, che facilita una varietà di processi morfogenetici, tra cui il ripiegamento epiteliale, l'estrusione cellulare, la delaminazione e la guarigione delle ferite 3,4,5,6,7

Protocollo

1. Impostazione dell'incrocio genetico e preparazione del bicchiere per la raccolta degli ovuli

1. Selezionare le femmine (vergini) della linea optogenetica UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) su un pad di CO₂ sotto stereomicroscopio e allestito un incrocio con mosche maschi della linea driver GAL4 materna 67 Sqh-mCherry; 15 E-caderina-GFP.
   NOTA: Il 67 e il 15 stanno per Tubulina-GAL4 materna inserita rispettivamente nel secondo (II) e nel terzo (III) cromosomi⁵². La linea GAL4 utilizzata in questo protocollo esprime anche la catena leggera regolatrice della miosina marcata con mCherry Sqh (Spag....

Discussione

Questo protocollo descriveva l'uso combinato dell'optogenetica e dell'ablazione laser per sondare i cambiamenti nella tensione tissutale immediatamente dopo l'inattivazione della contrattilità dell'actomiosina. Lo strumento optogenetico qui descritto sfrutta la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN) per inibire in modo acuto la contrattilità endogena dell'actomiosina Rho1 e Rho1-dipendente. Una precedente caratterizzazione di Opto-Rho1DN nel contesto della formazione di solchi ventrali di Drosophila ha dimo.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation