Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Resumen

La contractilidad de la actomiosina juega un papel importante en la morfogénesis celular y tisular. Sin embargo, es difícil manipular la contractilidad de la actomiosina in vivo de forma aguda. Este protocolo describe un sistema optogenético que inhibe rápidamente la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en embriones de Drosophila , revelando la pérdida inmediata de la tensión epitelial después de la inactivación de la actomiosina in vivo.

Resumen

Las fuerzas contráctiles generadas por la actina y la miosina II no muscular ("contractilidad de la actomiosina") son críticas para los cambios morfológicos de las células y los tejidos a múltiples escalas de longitud, como la división celular, la migración celular, el plegamiento epitelial y la morfogénesis ramificada. Una comprensión profunda del papel de la contractilidad de la actomiosina en la morfogénesis requiere enfoques que permitan la rápida inactivación de la actomiosina, lo cual es difícil de lograr utilizando enfoques genéticos o farmacológicos convencionales. El protocolo presentado demuestra el uso de un sistema de dimerización optogenética basado en CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, para inhibir la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con controles temporales y espaciales precisos. En este sistema, CRY2 se fusiona con la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN), mientras que CIBN se ancla a la membrana plasmática. La dimerización mediada por luz azul de CRY2 y CIBN da lugar a una rápida translocación de Rho1DN desde el citoplasma a la membrana plasmática, donde inactiva la actomiosina mediante la inhibición endógena de Rho1. Además, este artículo presenta un protocolo detallado para acoplar la inactivación mediada por Opto-Rho1DN de la actomiosina con la ablación con láser para investigar el papel de la actomiosina en la generación de tensión epitelial durante la formación del surco ventral de Drosophila . Este protocolo se puede aplicar a muchos otros procesos morfológicos que involucran la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con modificaciones mínimas. En general, esta herramienta optogenética es un enfoque poderoso para diseccionar la función de la contractilidad de la actomiosina en el control de la mecánica tisular durante la remodelación tisular dinámica.

Introducción

La contractilidad de la actomiosina, la fuerza contráctil ejercida por la miosina II no muscular (en adelante, «miosina») sobre la red de actina F, es una de las fuerzas más importantes en el cambio de la forma celular y en la morfogénesis a nivel tisular ^1,2. Por ejemplo, la activación de la contractilidad de la actomiosina en el dominio apical de las células epiteliales da lugar a la constricción apical, lo que facilita una variedad de procesos morfogenéticos, incluido el plegamiento epitelial, la extrusión celular, la delaminación y la cicatrización de heridas 3,4,5,6,7

Protocolo

1. Configurar el cruce genético y preparar la copa de recolección de óvulos

1. Seleccionar moscas hembras (vírgenes) de la línea optogenética UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) en una almohadilla de CO₂ bajo un microscopio estereoscópico y se estableció un cruce con moscas macho de la línea conductora materna GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherina-GFP.
   NOTA: El 67 y el 15 representan la tubulina-GAL4 materna insertada en el segundo (II) y tercer (III) cromosomas, respectivamente⁵². La línea GAL4 utilizada en este protocolo también expresa la cadena ligera reguladora de miosina marcada con mCherry ....

Discusión

Este protocolo describe el uso combinado de la optogenética y la ablación con láser para sondear los cambios en la tensión tisular inmediatamente después de la inactivación de la contractilidad de la actomiosina. La herramienta optogenética descrita aquí aprovecha la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN) para inhibir agudamente la contractilidad endógena de Rho1 y actomiosina dependiente de Rho1. La caracterización previa de Opto-Rho1DN en el contexto de la formación del surco ventral de Drosophila

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation