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Resumen

La contractilidad de la actomiosina juega un papel importante en la morfogénesis celular y tisular. Sin embargo, es difícil manipular la contractilidad de la actomiosina in vivo de forma aguda. Este protocolo describe un sistema optogenético que inhibe rápidamente la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en embriones de Drosophila , revelando la pérdida inmediata de la tensión epitelial después de la inactivación de la actomiosina in vivo.

Resumen

Las fuerzas contráctiles generadas por la actina y la miosina II no muscular ("contractilidad de la actomiosina") son críticas para los cambios morfológicos de las células y los tejidos a múltiples escalas de longitud, como la división celular, la migración celular, el plegamiento epitelial y la morfogénesis ramificada. Una comprensión profunda del papel de la contractilidad de la actomiosina en la morfogénesis requiere enfoques que permitan la rápida inactivación de la actomiosina, lo cual es difícil de lograr utilizando enfoques genéticos o farmacológicos convencionales. El protocolo presentado demuestra el uso de un sistema de dimerización optogenética basado en CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, para inhibir la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con controles temporales y espaciales precisos. En este sistema, CRY2 se fusiona con la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN), mientras que CIBN se ancla a la membrana plasmática. La dimerización mediada por luz azul de CRY2 y CIBN da lugar a una rápida translocación de Rho1DN desde el citoplasma a la membrana plasmática, donde inactiva la actomiosina mediante la inhibición endógena de Rho1. Además, este artículo presenta un protocolo detallado para acoplar la inactivación mediada por Opto-Rho1DN de la actomiosina con la ablación con láser para investigar el papel de la actomiosina en la generación de tensión epitelial durante la formación del surco ventral de Drosophila . Este protocolo se puede aplicar a muchos otros procesos morfológicos que involucran la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con modificaciones mínimas. En general, esta herramienta optogenética es un enfoque poderoso para diseccionar la función de la contractilidad de la actomiosina en el control de la mecánica tisular durante la remodelación tisular dinámica.

Introducción

La contractilidad de la actomiosina, la fuerza contráctil ejercida por la miosina II no muscular (en adelante, «miosina») sobre la red de actina F, es una de las fuerzas más importantes en el cambio de la forma celular y en la morfogénesis a nivel tisular 1,2. Por ejemplo, la activación de la contractilidad de la actomiosina en el dominio apical de las células epiteliales da lugar a la constricción apical, lo que facilita una variedad de procesos morfogenéticos, incluido el plegamiento epitelial, la extrusión celular, la delaminación y la cicatrización de heridas 3,4,5,6,7 . La activación de la miosina requiere la fosforilación de su cadena ligera reguladora. Esta modificación alivia la conformación inhibitoria de las moléculas de miosina, permitiéndoles formar haces de filamentos de miosina bipolares con múltiples dominios de cabeza en ambos extremos. Los filamentos bipolares de miosina impulsan el movimiento antiparalelo de los filamentos de actina y dan lugar a la generación de fuerza contráctil 1,8,9.

La pequeña GTPasa RhoA (Rho1 en Drosophila), conservada evolutivamente, desempeña un papel central en la activación de la contractilidad de la actomiosina en diversos contextos celulares10,11. Rho1 funciona como un interruptor bimolecular al unirse a GTP (forma activa) o GDP (forma inactiva)12. El ciclo entre Rho1 unido a GTP o GDP está regulado por sus proteínas activadoras de GTPasa (GAPs) y factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs)13. La función de los FMAM es facilitar el intercambio del PIB por el PIB y activar así la actividad de Rho1. Los GAPs, por otro lado, mejoran la actividad GTPasa de Rho1 y, por lo tanto, desactivan Rho1. La Rho1 activada promueve la contractilidad de la actomiosina a través de la interacción y la activación de sus efectores posteriores, la quinasa asociada a Rho (Rok) y la diáfana14. Rok induce la activación de la miosina y la contractilidad de la actomiosina mediante la fosforilación de la cadena ligera reguladora de la miosina15. Además, Rok también inhibe la fosfatasa de cadena ligera reguladora de la miosina y, por lo tanto, promueve aún más el ensamblaje del filamento de miosina16. Rok también puede fosforilar las quinasas LIM, que, cuando se activan, evitan el desensamblaje de la actina al fosforilar e inhibir el factor de despolimerización de actina cofilina17,18. Diaphanous es un nucleador de actina de la familia de las forminas que promueve la polimerización de la actina, proporcionando una base para que la miosina interactúe con 19,20,21.

Si bien los mecanismos celulares que activan la contractilidad de la actomiosina han sido bien dilucidados, nuestra comprensión de su función en la regulación de la remodelación dinámica de los tejidos sigue siendo incompleta. Llenar este vacío de conocimiento requiere enfoques que puedan inactivar rápidamente la actomiosina en regiones específicas del tejido in vivo y registrar el impacto inmediato en el comportamiento y las propiedades de los tejidos. Este protocolo describe el uso de un enfoque optogenético para inhibir agudamente la contractilidad de la actomiosina durante la invaginación del mesodermo de Drosophila, seguida de la medición de la tensión epitelial mediante ablación láser. Durante la gastrulación de Drosophila, las células precursoras del mesodermo localizadas ventralmente sufren constricción apical y se invaginan desde la superficie del embrión formando un surco orientado antero-posterior22,23. La formación de surcos ventrales se ha utilizado durante mucho tiempo como modelo para estudiar el mecanismo de plegamiento epitelial. La formación del surco ventral es administrada por el sistema de patrones dorsal-ventral en Drosophila24,25,26,27. La expresión de dos factores de transcripción, Twist y Snail, localizados en el lado ventral del embrión, controla la formación del surco ventral y especifica el destino de las células mesodérmicas28. Twist y Snail activan el reclutamiento de Rho1 GEF RhoGEF2 al ápice de las células precursoras del mesodermo a través de una vía receptora acoplada a proteína G y una proteína adaptadora RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. A continuación, RhoGEF2 activa la miosina en toda la superficie apical del mesodermo potencial a través de la vía de la quinasa Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. La miosina activada forma una red supracelular de actomiosina a lo largo de la superficie apical del primordio del mesodermo, cuyas contracciones impulsan la constricción apical y dan lugar a un rápido aumento de la tensión del tejido apical 14,37,40.

La herramienta optogenética descrita en este protocolo, Opto-Rho1DN, inhibe la contractilidad de la actomiosina a través del reclutamiento en la membrana plasmática dependiente de la luz azul de una forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN)41. Una mutación T19N en Rho1DN elimina la capacidad de la proteína mutante para intercambiar GDP por GTP y, por lo tanto, hace que la proteína esté perpetuamente inactiva34. Una mutación posterior en Rho1DN, C189Y, elimina su señal de direccionamiento de membrana 42,43. Cuando Rho1DN se infunde en la membrana plasmática, se une a los GEF de Rho1 y los incauta, bloqueando así la activación de Rho1, así como la activación mediada por Rho1 de la miosina y la actina34,44. El reclutamiento de Rho1DN en la membrana plasmática se logra a través de un módulo de dimerización dependiente de la luz derivado del criptocromo 2 y su socio de unión CIB1. El criptocromo 2 es un fotorreceptor criptocromo activado por luz azul en Arabidopsis thaliana45. El criptocromo 2 se une a CIB1, una proteína básica de hélice-bucle-hélice, solo en su estado fotoexcitado45. Más tarde se descubrió que la región de homología de fotoliasa (PHR) N-terminal conservada del criptocromo 2 (CRY2PHR, en lo sucesivo denominado CRY2) y el dominio N-terminal (aa 1-170) de CIB1 (en adelante CIBN) son importantes para la dimerización inducida por la luz46. Opto-Rho1DN contiene dos componentes. El primer componente es la proteína CIBN fusionada con un anclaje CAAX, que localiza la proteína en la membrana plasmática47. El segundo componente es CRY2 marcado con mCherry fusionado con Rho1DN41. En ausencia de luz azul, CRY2-Rho1DN permanece en el citoplasma. Tras la estimulación con luz azul, CRY2-Rho1DN se dirige a la membrana plasmática a través de la interacción entre el CIBN anclado a la membrana y el CRY2 excitado. Opto-Rho1DN puede ser activado por luz ultravioleta A (UVA) y luz azul (400-500 nm, activación máxima a 450-488 nm), o por un láser pulsado de 830-980 nm cuando se realiza la estimulación de dos fotones41,46,47,48. Por lo tanto, Opto-Rho1DN es estimulado por las longitudes de onda normalmente utilizadas para excitar la GFP (488 nm para imágenes de fotón único y 920 nm para imágenes de dos fotones). Por el contrario, las longitudes de onda comúnmente utilizadas para excitar mCherry (561 nm para imágenes de fotón único y 1.040 nm para imágenes de dos fotones) no estimulan el módulo optogenético y, por lo tanto, se pueden usar para imágenes de preestimulación. El protocolo describe los enfoques utilizados para minimizar el riesgo de estimulación no deseada durante la manipulación de la muestra.

La ablación con láser se ha empleado ampliamente para detectar y medir la tensión en células y tejidos49. Estudios previos han demostrado que, cuando la intensidad del láser se controla adecuadamente, la ablación con láser de dos fotones que emplea un láser de infrarrojo cercano de femtosegundos puede dañar físicamente algunas estructuras subcelulares (por ejemplo, redes corticales de actomiosina) sin causar el éxtasis de la membrana plasmática50,51. Si el tejido está bajo tensión, la ablación con láser de una región de interés dentro del tejido da como resultado un retroceso inmediato hacia afuera de las células adyacentes a la región ablacionada. La velocidad de retroceso es una función de la magnitud de la tensión y la viscosidad del medio (citoplasma) que rodea las estructuras que sufren retroceso49. Debido a la profundidad de penetración superior de los láseres de infrarrojo cercano y la capacidad de lograr una ablación focal bien confinada, la ablación con láser de dos fotones es particularmente útil para detectar la tensión tisular in vivo. Como se demuestra en este protocolo, este método puede combinarse fácilmente con la inactivación mediada por Opto-Rho1DN de la contractilidad de la actomiosina para investigar el impacto directo de la contractilidad celular dependiente de Rho1 en la mecánica tisular durante la remodelación tisular dinámica.

Protocolo

1. Configurar el cruce genético y preparar la copa de recolección de óvulos

  1. Seleccionar moscas hembras (vírgenes) de la línea optogenética UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) en una almohadilla de CO2 bajo un microscopio estereoscópico y se estableció un cruce con moscas macho de la línea conductora materna GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherina-GFP.
    NOTA: El 67 y el 15 representan la tubulina-GAL4 materna insertada en el segundo (II) y tercer (III) cromosomas, respectivamente52. La línea GAL4 utilizada en este protocolo también expresa la cadena ligera reguladora de miosina marcada con mCherry Sqh (calabaza espagueti)37 y la E-cadherina53 marcada con GFP. Las moscas de la línea optogenética aún pueden contener cromosomas equilibradores FM7 y TM6. Las moscas de la línea conductora materna GAL4 aún pueden contener los cromosomas equilibradores CyO y TM3.
  2. Después de ~10 días, seleccione moscas hembras F1 que tengan el siguiente genotipo: UASp-CIBNpm/+; 67 m²Cereza/+; 15 E-cadherina-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Coloca una taza de recolección de huevos con las moscas macho.
    1. Asegúrese de que las moscas hembras con el genotipo correcto no contengan cromosomas de equilibrio (es decir, no deben contener alas rizadas [Cy], cerdas cortas [Sb], ojos en forma de barra o riñón [B], o cerdas humerales adicionales [Hu]), que son marcadores de los equilibradores CyO, TM3, FM7 y TM6 utilizados en la generación de las cepas, respectivamente. Cubra la taza con un plato de jugo de manzana con un toque de pasta de levadura fresca en la superficie.
      NOTA: En las hembras F1, los componentes optogenéticos se expresan por vía materna. Por lo tanto, las hembras F1 utilizadas para montar la copa no necesitan ser vírgenes. Se recomienda utilizar moscas macho de la misma población F1 para la copa por comodidad.
  3. Mantenga el vaso en una caja de cartón cubierta con papel de aluminio para evitar cualquier posible fuga de luz del ambiente. Cambie el plato de jugo de manzana todos los días para tazas mantenidas a temperatura ambiente (~21-23 °C), o cada dos días para tazas mantenidas a 18 °C.
    1. Inmediatamente antes de cambiar el plato, golpee la taza sobre una superficie plana (por ejemplo, una mesa de trabajo) para mantener las moscas en el fondo de la taza y evitar que se escapen. Cambie el plato de jugo de manzana en una habitación oscura y use una linterna frontal con luz roja para iluminarse (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Para aumentar la expresión de los constructos que están bajo el control de la tubulina-GAL4 materna y UASp, se recomienda mantener la copa a 18 °C durante un mínimo de 3 días antes de la recolección embrionaria. Este período de incubación también permite que las moscas se adapten a la taza y se alimenten bien de la pasta de levadura para lograr una producción óptima de huevos.

2. Recolección de embriones en la etapa deseada y preparación para la estimulación optogenética

NOTA: Todos los pasos de recolección y preparación de muestras deben realizarse en una habitación oscura, utilizando una "luz segura" (por ejemplo, luz roja) para la iluminación. Los componentes optogenéticos son inmensamente sensibles a la luz ambiental. Incluso la más mínima exposición a la luz ambiental conduce a la estimulación prematura de la muestra. Por lo general, las luces en el rango verde-rojo (>532 nm) no causan estimulación no deseada.

  1. Para la recolección de embriones en la embriogénesis temprana, coloque un nuevo plato de jugo de manzana en la taza de 8 a 16 h antes de la recolección de embriones (a 18 °C).
  2. En el momento de la recolección de embriones, cambie el plato de jugo de manzana. Etiquete la placa que se ha desprendido de la taza y cubra la superficie de la placa con una capa delgada de aceite de halocarbono 27 (consulte la tabla de materiales). Espere de 30 a 60 segundos para que la cáscara del huevo se vuelva transparente.
  3. Coloque un protector de plástico de color rojo anaranjado (consulte la Tabla de materiales) en la platina de un estereoscopio vertical. La colocación del escudo naranja-rojo evita la estimulación no deseada durante la iluminación de la muestra al bloquear las longitudes de onda azul-verde de la luz transmitida.
    NOTA: En este protocolo, se utiliza un estereoscopio vertical para la recolección de embriones (ver Tabla de Materiales).
  4. Coloque el plato de jugo de manzana encima del escudo rojo anaranjado. Encienda la luz transmitida del microscopio estereoscópico para iluminar la muestra. Recoja de 5 a 15 embriones en la etapa adecuada del plato de jugo de manzana con un par de pinzas. No apriete los embriones con las pinzas.
    NOTA: En este protocolo, el embrión apropiado debe estar en la etapa de celularización temprana-media. El embrión en esta etapa debe tener una yema oscura y opaca rodeada por una capa de periplasma clara y uniforme que contiene las células del blastodermo en formación. El borde delantero de los surcos de escisión ("frente de celularización"), que aparece como una línea continua paralela a la superficie del embrión, no debe pasar la mitad de la profundidad del periplasma.
  5. Seque suavemente los embriones en un trozo de toalla de papel (~ 1,5 cm × 1,5 cm) para eliminar el exceso de aceite de los embriones con las pinzas.
  6. Agregue varias gotas de lejía al 40% recién preparada (~3% de hipoclorito de sodio; consulte la Tabla de materiales) a un nuevo trozo cuadrado nuevo de toalla de papel (~ 1,5 cm × 1,5 cm) con una pipeta de transferencia de plástico para que la toalla de papel quede cubierta con una capa delgada de lejía. Transfiere el embrión de la toalla de papel seca a la toalla de papel empapada en lejía con las pinzas y asegúrate de que los embriones estén empapados en lejía. Espere de 2 a 4 minutos para que el embrión se descorione.
  7. Después de la descorionación, use las pinzas para secar la toalla de papel cuadrada en un trozo grande de papel de seda para eliminar el exceso de lejía. Asegúrese de que el lado con los embriones esté hacia arriba.
  8. Para enjuagar los embriones, usa las pinzas para empapar suavemente la toalla de papel cuadrada en una gota de agua desionizada y sécala rápidamente en un trozo grande de papel de seda. Repita este proceso ocho veces para asegurarse de eliminar cualquier residuo de lejía.
  9. Use una herramienta para pestañas para transferir el embrión de la toalla de papel a un plato con fondo de vidrio de 35 mm (consulte la tabla de materiales). Agregue agua desionizada al plato para cubrir los embriones por completo. Ajuste la posición y orientación de los embriones con la herramienta de pestañas.
    NOTA: Después de la descorionación, el embrión tiende a pegarse a la superficie del vidrio y queda inmóvil sin perturbación, por lo que no es necesario aplicar un tratamiento adicional (como pegamento) para inmovilizar al embrión en el plato con fondo de vidrio.
  10. Coloque la placa con fondo de vidrio de 35 mm con los embriones dentro de una caja negra resistente a la luz (ver Tabla de materiales) para proteger la muestra de la exposición a la luz durante el proceso de transferencia. Lleve la caja a la habitación con el microscopio multifotónico.

3. Estimulación optogenética, ablación láser e imágenes del embrión

NOTA: El sistema multifotónico utilizado en este experimento (ver Tabla de Materiales) es capaz de obtener imágenes simultáneas de doble longitud de onda. También contiene una unidad de fotoestimulación con un láser de 458 nm y un escáner galvanómetro separado, lo que permite la fotoactivación/estimulación dentro de una región de interés definida (ROI). Cabe destacar que el láser de 920 nm, que se utiliza para excitar proteínas fluorescentes verde-amarillas, estimulará Opto-Rho1DN, aunque más lentamente en comparación con la estimulación mediada por láser azul.

  1. Cubra el microscopio multifotónico con un paño negro resistente a la luz (consulte la Tabla de materiales) para evitar la estimulación no deseada de los embriones durante la configuración de la muestra y la obtención de imágenes.
    NOTA: El mismo enfoque se utiliza durante la obtención de imágenes multifotónicas regulares para proteger los detectores sensibles a la luz equipados en el microscopio.
  2. Apague la luz de la habitación y las pantallas de la computadora. Apague el controlador del panel táctil haciendo clic en APAGADO en ' Luz de fondo del controlador del panel táctil' en el software. Asegúrese de que no haya otra luz ambiental en la habitación.
    1. Abra la parte frontal de la cubierta de tela negra del microscopio. Tome el plato con fondo de vidrio de 35 mm de la caja negra y colóquelo en la platina del microscopio.
  3. Iluminar los embriones con una luz verde que normalmente se utiliza como luz de excitación para la epifluorescencia. Para hacer esto, encienda la unidad de iluminación de fluorescencia, seleccione Ocular en el panel 'Ocular' en el software y cambie la 'Torreta de cubo' a 4:TRITC. Utilice el ocular para identificar el embrión de interés y enfocarlo.
    NOTA: La visualización de la luz verde se logra permitiendo que una luz blanca generada por la unidad de iluminación de fluorescencia pase a través de un cubo de filtro TRITC estándar incorporado, que contiene un filtro de excitación de 528-553 nm, un divisor de haz de 565 nm y un filtro de emisión de 590-650 nm. Otras luces que no sean azules también deberían funcionar bien para la iluminación de muestras. No es necesario usar protección ocular en este paso, ya que la luz de excitación tiene una intensidad baja y no se dirigirá al ocular. El embrión aparecerá uniformemente rojo debido a la autofluorescencia.
  4. Cierre la cubierta de tela negra para que la muestra quede completamente protegida de la luz. Encienda la pantalla de la computadora para acceder al software que controla el microscopio. Cambie el 'Ocular' a LSM en el software para la adquisición de imágenes.
  5. Realice la ablación con láser en embriones de control no estimulados utilizando un objetivo de inmersión en agua de 25x.
    1. Haga clic en Bright Z, Sequence Manager y LSM Stimulation desde la 'Ventana de herramientas' en el software. Establezca el tipo de escáner como Galvano y el tamaño de escaneo como 512 × 512. Encienda CH1 y CH3 en el panel 'Configuración PMT' para permitir el uso del láser de 1.040 nm y haga clic en Live × 4 para visualizar el embrión.
    2. Gire el embrión utilizando la función de rotación en el software para que el eje antero-posterior del embrión esté orientado verticalmente. Establezca el zoom en 3. Dibuje una región de interés (ROI) usando la herramienta de forma en 'Configuración de escaneo' y establezca el tamaño del ROI en el panel 'Referencia'. Establezca el ROI en 512 píxeles de ancho y 100 píxeles de alto (171 × 33 μm2).
    3. Establezca los parámetros de adquisición para la pila Z previa a la ablación.
      1. Registre la superficie del embrión como 0 en la 'Sección Z'. Establezca el inicio en 0 y el final en 100 μm. Establezca el tamaño del paso en 2 μm. Active el modo de adquisición Z marcando Z en la pestaña 'Series'.
      2. Ajuste la intensidad del láser de 1.040 nm para aumentar linealmente del 3 % al 7 % utilizando la función Bright Z .
      3. Guarde la configuración de imágenes actual como la primera tarea de la canalización haciendo clic en LSM en 'Administrador de secuencias'.
        NOTA: La pila Z previa a la ablación se obtiene para confirmar el estadio del embrión. En este experimento, CRY2-Rho1DN-mCherry y Sqh-mCherry serán excitados por el láser de 1.040 nm. Durante la constricción apical, la señal de Sqh-mCherry se potencia en la región medioápica de las células mesodérmicas ventrales, mientras que CRY2-Rho1DN-mCherry es citosólica antes de la estimulación. La intensidad del láser empleada para la obtención de imágenes antes y después de la estimulación se decide empíricamente en función del equilibrio entre la relación señal-ruido óptima y la evitación del fotoblanqueo.
    4. Ajuste los parámetros de adquisición para la película previa a la ablación.
      1. Eliminar cualquier ROI existente para permitir la obtención de imágenes de toda la región de 512 × 512 píxeles (171 × 171 μm 2, zoom 3x) cerca de la superficie ventral del embrión, como se describe en el paso 3.5.2. Ajuste la intensidad del láser de 1.040 nm al 3%.
      2. Marque Hora y desmarque Z en el panel 'Serie'. Mantenga el 'Intervalo' como FreeRun en el panel 'Lapso de tiempo'. Establezca el ciclo en 10.
      3. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en 'Administrador de secuencias'.
        NOTA: El propósito de esta tarea es obtener una película de preablación de un solo plano Z de 10 fotogramas con un láser de 1.040 nm para la adquisición de imágenes. La velocidad de adquisición de la imagen es de aproximadamente 1 s por fotograma.
    5. Establezca los parámetros para la ablación con láser.
      1. Defina una región 3D desde inmediatamente debajo de la membrana vitelina hasta ~20 μm de profundidad para la ablación con láser (Figura 1A). Establezca el inicio de la pila Z como el plano que está inmediatamente debajo de la membrana vitelina y el extremo como 20 μm más profundo que el plano inicial. Establezca el tamaño del paso en 1,5 μm.
        NOTA: El ROI de la región ablacionada es de ~30 píxeles de ancho y ~10 píxeles de alto (~10 μm a lo largo del eje medial-lateral y ~3,3 μm a lo largo del eje A-P). El propósito de la ablación de la muestra en múltiples planos Z es asegurar que la superficie apical de las células ventrales esté ablacionada. Esto es especialmente importante para los embriones estimulados, ya que las células ventrales experimentan una rápida relajación apical después de la inhibición de Rho1.
      2. Encienda CH2 y CH4 en el panel 'Configuración PMT' para permitir el uso del láser de 920 nm. Ajuste la intensidad del láser de 920 nm al 30%. Configure la adquisición de imágenes con el láser de 920 nm para una sola pila Z dentro de la región 3D definida en el paso 3.5.5.1 para la ablación con láser.
        NOTA: La intensidad del láser elegida en este paso es suficiente para extirpar el tejido (como lo indica el retroceso del tejido inmediatamente después del tratamiento con láser) pero mientras tanto no daña obviamente la membrana plasmática (como lo indica la ausencia de marcas de quemaduras en la membrana celular) (Figura 1B, C).
      3. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en 'Administrador de secuencias'.
    6. Establezca los parámetros de adquisición para la película posterior a la ablación.
      1. Establezca la adquisición de imágenes para una película posterior a la ablación de un solo plano Z de 100 fotogramas utilizando los láseres de 1.040 nm y 920 nm. Ajuste la intensidad del láser de 1.040 nm y del láser de 920 nm al 3% y al 0,3%, respectivamente. La región especificada en el paso 3.5.4 se visualizará con una velocidad de adquisición de imagen idéntica.
      2. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en 'Administrador de secuencias'.
        NOTA: El propósito de almacenar los parámetros descritos en los pasos 3.5.3-3.5.6 como tareas secuenciales en 'Sequence Manager' antes de cualquier adquisición real es asegurar la captura de la respuesta tisular inmediata después de la ablación con láser.
    7. Seleccione Secuencia en 'Adquirir'. Cambie la ruta de acceso de almacenamiento de datos y el nombre del archivo según sea necesario. Haga clic en Listo y espere a que el software inicialice la canalización. A continuación, haga clic en Iniciar para ejecutar la canalización.
  6. Realizar la ablación láser en embriones estimulados.
    1. Establezca los parámetros de adquisición para la pila Z previa a la ablación, como se describe en los pasos 3.5.1-3.5.3. Guarde la configuración actual como la primera tarea de la canalización haciendo clic en LSM en 'Administrador de secuencia'.
    2. Establecer parámetros para la estimulación optogenética dentro de un ROI definido.
      1. Cambie el zoom a 1 y seleccione un ROI que cubra la superficie ventral del embrión (~512 × 300 μm2). Apague los detectores CH1-CH4 .
      2. Haga clic en Estimulación LSM. Desmarque Continuo dentro de la duración y escriba 12 s. Compruebe los 458 nm con una intensidad láser del 0,3%.
      3. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en Estimulación en 'Administrador de secuencias'.
        NOTA: Se puede lograr una estimulación más rápida aumentando la intensidad del láser de 458 nm. Sin embargo, cuando se utilizan intensidades láser más altas, la luz láser dispersa puede estimular la región adyacente al ROI, lo que no es ideal si se requiere una estimulación confinada espacialmente.
    3. Establezca un tiempo de espera de 3 minutos después de la estimulación para asegurar la inactivación total de la miosina y el desmontaje de la F-actina apical, y para lograr una morfología tisular estática antes de la ablación con láser. Esto se logra haciendo clic en Esperar /Pausa en 'Administrador de secuencias' y configurando el tiempo deseado para 'Esperar'.
      NOTA: El reclutamiento de CRY2-Rho1DN-mCherry a la membrana causado por una sola ronda de estimulación (láser de 458 nm al 0,3% durante 12 s) es claramente detectable 10-15 min después de la estimulación. Esto está en consonancia con el medio tiempo de disociación publicado de ~9 min47.
    4. Establezca los parámetros de adquisición para la película de preablación de un solo plano Z, como se describe en el paso 3.5.4, excepto que los láseres de 1.040 nm y 920 nm se utilizan para la adquisición de imágenes. Encienda los detectores CH1-CH4 . Ajuste la intensidad del láser de 1.040 nm y del láser de 920 nm al 3% y al 0,3%, respectivamente. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en 'Administrador de secuencias'.
    5. Establezca los parámetros para la ablación con láser, como se describe en el paso 3.5.5. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en 'Administrador de secuencias'.
    6. Establezca los parámetros de adquisición para la película posterior a la ablación de un solo plano Z, como se describe en el paso 3.5.6. Guarde la configuración actual como la siguiente tarea de la canalización haciendo clic en LSM en 'Administrador de secuencias'.
    7. Seleccione Secuencia en 'Adquirir'. Cambie la ruta de acceso de almacenamiento de datos y el nombre del archivo según sea necesario. Haga clic en Listo y espere a que el software inicialice la canalización. A continuación, haga clic en Iniciar para ejecutar la canalización.

4. Cuantificación de la tasa de retroceso tisular después de la ablación con láser

  1. Abra la película posterior a la ablación en ImageJ.
  2. Dibuje un pequeño ROI a lo largo de la línea media ventral que cubra la región ablacionada con la herramienta Selección de rectángulo . El ancho del ROI es de nueve píxeles. La altura del ROI se establece de tal manera que el ROI es lo suficientemente grande como para cubrir todo el rango de retroceso del tejido después de la ablación con láser.
    1. Haga clic en Duplicar en la pestaña 'Imagen'. En la ventana emergente, marque Duplicar pila y, a continuación, haga clic en Aceptar para duplicar la pila dentro del ROI seleccionado.
  3. Genere un montaje a partir de la pila duplicada a través de Pilas de > de imágenes > Hacer montaje. En la ventana emergente, establezca el número de fila en 1 y el número de columna en el número total de fotogramas de la pila (100 en este caso).
  4. Mida el ancho A-P de la región ablacionada a lo largo del tiempo a partir del montaje generado.
    1. Utilice la herramienta Multipunto de ImageJ para marcar los límites A-P de la región ablacionada para cada punto de tiempo del montaje.
    2. Guarde las coordenadas de los puntos marcados usando Archivo > Guardar como coordenadas XY >.
    3. Importe las coordenadas XY medidas en MATLAB. Calcule el ancho A-P de la región ablacionada para cada punto de tiempo restando la coordenada Y del límite superior de la coordenada Y del límite inferior.
  5. Determine la tasa de retroceso del tejido ajustando los primeros 20 s de la curva de "anchura a lo largo del tiempo" en una línea utilizando la función "polyfit" de MATLAB. Indique la pendiente de la línea ajustada como la tasa de retroceso del tejido.
  6. Realizar pruebas estadísticas para comparar la tasa de retroceso tisular entre las muestras estimuladas y no estimuladas.
    NOTA: Se recomienda obtener datos de al menos cinco embriones por condición. Tanto la prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral como la prueba t de Student bilateral se pueden utilizar para la comparación estadística.

Resultados

En los embriones no estimulados sometidos a constricción apical, Sqh-mCherry se enriqueció en la región medioapical de las células mesodérmicas ventrales, mientras que CRY2-Rho1DN-mCherry fue citosólico (Figura 1A). La ablación con láser dentro del dominio de constricción condujo a un rápido retroceso tisular a lo largo del eje A-P (Figura 1B, C). En los embriones estimulados, la señal CRY2-Rho1DN-mCherry se localizó en la membrana p...

Discusión

Este protocolo describe el uso combinado de la optogenética y la ablación con láser para sondear los cambios en la tensión tisular inmediatamente después de la inactivación de la contractilidad de la actomiosina. La herramienta optogenética descrita aquí aprovecha la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN) para inhibir agudamente la contractilidad endógena de Rho1 y actomiosina dependiente de Rho1. La caracterización previa de Opto-Rho1DN en el contexto de la formación del surco ventral de Drosophila

Divulgaciones

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Ann Lavanway por el apoyo a las imágenes. Los autores agradecen al laboratorio de Wieschaus y al laboratorio de De Renzis por compartir reactivos y al Bloomington Drosophila Stock Center por las poblaciones de moscas. Este estudio cuenta con el apoyo de NIGMS, ESI-MIRA R35GM128745 y la Subvención de Investigación Institucional de la Sociedad Americana Contra El Cáncer #IRG-82-003-33 a BH.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-10-CUsed for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lidFalcon351007Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscopeOnlineNAUsed to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)VWR10028-048Used for embryo dechorination
CO2 padGenesee Scientific59-114Used for cross set-up
ddH2ONANAUsed for sample preparation
Dumont Style 5 tweezersVWR102091-654Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)VWR22940-834Used for sample preparation
FluoView (Software)OlympusNAUsed for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27Sigma AldrichH8773-100MLUsed for embryo stage visualization
ImageJ/FIJINIHNAUsed for image analysis
MATLABMathWorksNAUsed for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscopeNikonNAUsed for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.OlympusNAUsed for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)VWR30621-392Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)BoliopticsFM14036151Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED LightsAmazonNAUsed to avoid unwanted light stimulation

Referencias

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