Drosophila Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Özet

Aktomiyosin kontraktilitesi hücre ve doku morfogenezinde önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, aktomiyosin kontraktilitesini in vivo akut olarak manipüle etmek zordur. Bu protokol, Drosophila embriyolarında Rho1 aracılı aktomiyosin kontraktilitesini hızla inhibe eden ve aktomiyozinin in vivo inaktivasyonundan sonra epitel gerginliğinin ani kaybını ortaya çıkaran bir optogenetik sistemi tanımlar.

Özet

Aktin ve kas dışı miyozin II ("aktomiyosin kontraktilitesi") tarafından üretilen kasılma kuvvetleri, hücre bölünmesi, hücre göçü, epitelyal katlanma ve dallanma morfogenezi gibi çoklu uzunluk ölçeklerinde hücrelerin ve dokuların morfolojik değişiklikleri için kritik öneme sahiptir. Aktomiyosin kontraktilitesinin morfogenezdeki rolünün derinlemesine anlaşılması, geleneksel genetik veya farmakolojik yaklaşımlar kullanılarak elde edilmesi zor olan aktomiyosinin hızlı inaktivasyonuna izin veren yaklaşımlar gerektirir. Sunulan protokol, hassas zamansal ve uzamsal kontrollerle Drosophila embriyolarında aktomiyosin kontraktilitesini inhibe etmek için CRY2-CIBN tabanlı bir optogenetik dimerizasyon sistemi olan Opto-Rho1DN'nin kullanımını göstermektedir. Bu sistemde, CRY2, baskın negatif Rho1 formuna (Rho1DN) kaynaştırılırken, CIBN plazma zarına bağlanır. CRY2 ve CIBN'nin mavi ışık aracılı dimerizasyonu, Rho1DN'nin sitoplazmadan plazma membranına hızlı bir şekilde translokasyonuna neden olur ve burada endojen Rho1'i inhibe ederek aktomiyosini inaktive eder. Ek olarak, bu makale, Drosophila ventral karık oluşumu sırasında aktomiyosinin epitelyal gerginlik oluşturmadaki rolünü araştırmak için Opto-Rho1DN aracılı aktomiyosin inaktivasyonunu lazer ablasyonu ile birleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, Drosophila embriyolarında aktomiyozin kontraktilitesini içeren diğer birçok morfolojik sürece minimal modifikasyonlarla uygulanabilir. Genel olarak, bu optogenetik araç, dinamik doku yeniden şekillenmesi sırasında doku mekaniğini kontrol etmede aktomiyosin kontraktilitesinin işlevini incelemek için güçlü bir yaklaşımdır.

Giriş

Kassız miyozin II'nin (bundan böyle 'miyozin' olarak anılacaktır) F-aktin ağına uyguladığı kasılma kuvveti olan aktomiyosin kontraktilitesi, hücre şeklini değiştirmede ve doku düzeyinde morfogenezi^{yönlendirmede en} önemli kuvvetlerden biridir ^1,2. Örneğin, epitel hücrelerinin apikal alanında aktomiyosin kontraktilitesinin aktivasyonu, epitel katlanması, hücre ekstrüzyonu, delaminasyon ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere çeşitli morfogenetik süreçleri kolaylaştıran apikal daralma ile sonuçlanır 3,4,5,6,7

Protokol

1. Genetik çaprazlamanın ayarlanması ve yumurta toplama kabının hazırlanması

1. Optogenetik hat UASp-CIBNpm (I) 'den dişi sinekleri (bakire) seçin; UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) bir stereomikroskop altında bir CO₂ pedi üzerinde ve maternal GAL4 sürücü hattı 67 Sqh-mCherry'den erkek sineklerle bir çaprazlama kurdu; 15 E-kaderin-GFP.
   NOT: 67 ve 15, sırasıyla ikinci (II) ve üçüncü (III) kromozomlara yerleştirilen maternal-Tubulin-GAL4'ü temsil eder⁵². Bu protokolde kullanılan GAL4 hattı ayrıca mCherry etiketli miyozin düzenleyici hafif zincir Sqh (Spagetti kabağı)³⁷ ve GFP etiketli E-c....

Tartışmalar

Bu protokol, aktomiyosin kontraktilitesinin inaktivasyonundan hemen sonra doku gerginliğindeki değişiklikleri araştırmak için optogenetik ve lazer ablasyonun birlikte kullanımını tanımladı. Burada tarif edilen optogenetik araç, endojen Rho1 ve Rho1'e bağımlı aktomiyosin kontraktilitesini akut olarak inhibe etmek için baskın negatif Rho1 (Rho1DN) formundan yararlanır. Drosophila ventral karık oluşumu bağlamında Opto-Rho1DN'nin önceki karakterizasyonu, aletin eşzamanlı miyozin inaktivasyon.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation